Summary
Her præsenterer vi en metode til at studere Colorado-kartoffelbilledvaletilstand under de naturlige forhold i den tempererede zone samt en teknik til indsamling af biller om vinteren. Denne metode gør det muligt at opnå et ønsket antal overvintrende individer til forskellige analyser på ethvert stadium af dvaletilstand.
Abstract
Et af de største skadedyr af kartoffel Solanum tuberosum L. i den tempererede zone er insektet Colorado kartoffelbille (CPB). De fleste undersøgelser af immunitet og sygdomme i CPB udføres under aktive fodringsstadier. Ikke desto mindre er der færre undersøgelser af hvilestadier, selvom disse biller tilbringer det meste af deres livscyklus i en tilstand af vinterdiapause (dvale). I dette arbejde blev en metode til undersøgelse af CPB-dvaletilstand under naturlige forhold udviklet og testet, hvilket giver mulighed for at indsamle et tilstrækkeligt antal individer om vinteren. I denne artikel blev CPB-overlevelse vurderet, og infektiøse agenser på forskellige stadier af dvaletilstand blev identificeret. CPB-dødeligheden steg under dvaletilstanden og nåede et maksimum i april-maj. Entomopatogene svampe (Beauveria, Isaria og Lecanicillium) og bakterier Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas og Serratia blev isoleret fra de døde insekter. Overlevelsesgraden for billerne for hele dvaleperioden var 61%. Der blev ikke fundet frosne eller udtørrede biller, hvilket indikerer succesen med den præsenterede metode.
Introduction
Colorado-kartoffelbaglen Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) er et vigtigt skadedyr af Solanaceae-planter, overvejende kartoffel Solanum tuberosum L. Det geografiske område af denne art er mere end 16 millioner km2 og udvides konstant1. CPB har fakultativ vinterdiapause, og dvaletilstand er obligatorisk i den tempererede zone. Diapausen induceres af en kortdags fotoperiode og moduleres af temperatur1. Disse biller overvintrer i voksenstadiet ved at grave sig ned i jorden. Med stigende breddegrader forlænges dvaleperiodens varighed. I den tempererede zone, især på nordlige områder af sit sortiment, varer overvintringen op til 9 måneder: fra august-september til maj-juni (Noskov et al., personlige observationer). I løbet af denne periode udsættes CPB - ligesom ethvert andet insekt i den tempererede zone - for ugunstige vinterforhold og skal øge sin kuldetolerance. Samtidig øger billernes kontakt med jord risikoen for infektion med forskellige opportunistiske og patogene mikroorganismer2. Derfor skal disse biller opretholde et vist niveau af immunsystemaktivitet under dvaletilstand, hvilket også er energisk dyrt. Ikke desto mindre, selvom insektet overlever en infektion, kan sygdommen reducere sin kuldehårdhed3. Det skal bemærkes, at lav temperatur ikke er den eneste årsag til vinterdødeligheden i CPB. En vigtig rolle spilles også af manglen på ilt, og under nogle forhold kan det være den vigtigste faktor for vinterdødelighed 4,5.
Det er kendt, at CPB's naturlige vinterdødelighed kan være meget høj og nå 100% i lerjord6. Overvintring er således en af de mest afgørende perioder i CPB's livscyklus. Ikke desto mindre er data om fysiologi, immunsystemaktivitet, overlevelse og andre parametre for CPB-dvaletilstand under naturlige forhold stadig begrænsede. Der er undersøgelser af differentiel genekspression og forskellige fysiologiske parametre hos CPB-voksne under diapausen og som reaktion på kuldechok 7,8,9,10,11,12; Disse analyser er imidlertid hovedsageligt blevet udført ved induktion af diapause eller kuldestress under laboratorieforhold uden naturlige udsving i temperatur, fugtighed og naturlig patogenbelastning. Ikke desto mindre er forskning i fysiologien af disse biller indsamlet ved udgravning fra jord under naturlige forhold vigtig. Forskellige aspekter af CPB-overvintring under naturlige forhold blev aktivt undersøgt i 1970'erne-1980'erne 13,14,15,16,17,18. På den anden side involverede disse undersøgelser ikke CPB-udgravning fra jorden om vinteren. Derudover er en teknik til kontrolleret dvaletilstand af CPB og en beskrivelse af burene ikke givet detaljeret. Derfor er der behov for undersøgelse af fysiologien hos CPB'er, der overvintrer i naturlige omgivelser19.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle og teste en metode til kontrolleret dvale hos voksne CPB under naturlige forhold. Den foreslåede metode gør det muligt at opnå et ønsket antal CPB-individer til mikrobiologiske, immunologiske og andre assays under dvaletilstand under feltbetingelser i et kontinentalt klima. Denne metode kan tilpasses og anvendes på andre insektarter, der overvintrer i jord under sne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivelse af dvaleburene
BEMÆRK: Afhængigt af forsøgets formål varierer antallet af bure. Brug mindst tre bure pr. prøveudtagningsdato. For at estimere antallet af biller, der vil dukke op, skal du forberede mindst tre ekstra bur, som ikke tages ud af jorden til foråret.
- Brug bure lavet af en stiv træramme med en størrelse på 25 × 25 × 40 cm (L × W × H).
- For at opbygge en ramme til buret skal du bruge træplader mindst 2 cm tykke og 4 cm brede.
- Indersiden af buret dækkes med et net af rustfrit stål med en størrelse åbninger, der ikke er større end 5 mm × 3 mm. Brug en træhæftemaskine til at fastgøre masken.
- Fastgør det rustfrie stålnet på ydersiden af bunden med hæftemaskinen.
- Beklæd indersiden af buret med et sort syntetisk geotekstil med en densitet på 60 g / m2.
BEMÆRK: Geotekstilet fungerer som en ekstra barriere for at forhindre billernes flugt. Brug det ikke i eksperimenter relateret til aktivt bevægelige entomopatogener og parasitoider. - Fastgør et rør af syntetisk gennemsigtigt åndbart stof, der er ca. 60 cm højt, tæt på toppen af buret.
- Kryds og fastgør to stærke reb til bunden af buret for at trække det ud af jorden, når det er nødvendigt.
2. Installation af burene
- Grav et hul 40 cm dybt i jorden og læg buret inde.
- Læg tørt græs eller hø på hullet.
- Placer buret inde, så hø eller tørt græs er mellem burets vægge og jorden.
- Fyld burene op med jord fra samme kartoffelmark, hvor insekterne samles.
- Installer vandtætte temperatur- og fugtighedsdataloggere i burene på de krævede dybder.
BEMÆRK: Dataloggere fra enhver producent kan bruges og skal kunne fungere ved lave temperaturer. - Plant kartoffelplanter inde i hvert bur 3-4 uger før billernes introduktion og vand dem moderat.
- Fastgør et rør af syntetisk stof lodret til en pind af ethvert materiale, der er installeret på ydersiden af buret.
3. Opdræt af insekter inden overvintring
- Saml manuelt voksne biller i pesticidfrie kartoffelmarker mod slutningen af kartoffelvegetationen.
BEMÆRK: Voksne biller adskiller sig væsentligt fra larver og er kendetegnet ved stribet elytra, mens larver er røde. - Opbevar de indsamlede biller i 15-20 L plastikspande (højst 200 individer pr. Spand) indeholdende kartoffelplader til fodring af insekterne, inden de placeres i burene.
- Dæk spandene med åndbart stof.
BEMÆRK: Opbevar ikke insekter i spande i mere end 12 timer. Brug store nok kartoffelplader til at forhindre ophobning af biller i bunden af spandene. - Placer ikke mere end 200 CPB-individer på kartoffelplanterne dækket med det syntetiske stofnet.
- Når kartoffeltoppene indtages, tilsættes friske i en plastikbeholder med vand og skiftes kartoffelpladerne dagligt bagefter.
BEMÆRK: For at fastgøre stængler i en krukke skal du bruge bomuldsuld og parafilm. Kontroller omhyggeligt gamle stængler for billerne, når du fjerner dem. - Når alle billerne er gravet ned i jorden til overvintring, løsnes røret af syntetisk stof fra pinden og lægger stoffet ned.
4. Indsamling af insekter i vintersæsonen
- Fjern sne over burets overflade.
- Løsn buret på hver side med en stærk skovl.
- Træk buret ud af jorden ved hjælp af rebene.
- Bring buret til laboratoriet.
BEMÆRK: Afhængigt af forsøgets mål skal dvalebiller muligvis være inaktive før analysen. I dette tilfælde skal temperaturen i laboratoriet under isolering af biller fra jorden være ~ 2-5 ° C. - Fjern jorden fra kassen i små portioner, bryd forsigtigt store jordstykker op og isoler biller ved hjælp af pincet.
- Adskil levende biller fra kadavere. Levende sunde biller skaber kompakt jord omkring dem, der danner et lufthulrum (en såkaldt vugge) og er derfor let adskilt fra jorden. Biller dræbt af svampe mumificeres eller har synligt mycelium på overfladen. Bakterielt nedbrydende insekter er mørke.
- Sigt jorden gennem en sigte for at sikre, at alle billerne er isolerede og ikke beskadigede.
- Placer kadavere med symptomer på svampeinfektion eller bakteriel nedbrydning i et individuelt sterilt 15 ml centrifugerør til fremtidig identifikation.
- Levende biller opbevares i køleskab ved en temperatur på 0-2 °C indtil analysen i en lukket beholder, der indeholder et fugtigt vatstykke.
5. Forberedelse af organ- og vævsprøver
- For at opsamle hæmolymfe skal du punktere i den laterale del af maven under elytra ved hjælp af en insulinnål.
BEMÆRK: Under overvintring reduceres mængden af hæmoolymp betydeligt, hvilket gør det vanskeligt at opsamle denne væske. - For at isolere tarmen skal du afskære hovedkapslen, presse alt indholdet ud i en petriskål med fosfatbuffer, adskille tarmen og rense den for fedt og malpighiske kar.
- Adskil en ønsket del af tarmen, såsom forgut, midgut eller bagtarm.
- For at isolere fedtlegemet skal du adskille det fra andre væv efter isolering af tarmen.
BEMÆRK: De isolerede væv kan bruges til måling af aktiviteten af antioxidanter og afgiftende enzymer (et eksempel: Supplerende figur 1), analyse af regulering af immunsignalvejsgener (et eksempel: Supplerende figur 2) eller metabarkodning af insekttarmindhold osv.
6. Isolering af mikroorganismer fra kadavere
- For at isolere entomopatogene svampe fra kadavere, sæt de mumificerede insekter i et sterilt fugtighedskammer.
- Brug luftkonidier (hvis tilgængelig) eller sclerotia fra billernes indre indhold til plettering på Sabouraud dextroseagar med 0,4% mælkesyre.
BEMÆRK: Brug biller med mycelium og konidier til plettering straks (uden at placere dem i fugtighedskamre). - Isoler bakterier fra kadavere med symptomer på bakteriel nedbrydning.
- Skær et billehoved af, klem det indre indhold ud og saml dem i rør til efterfølgende plettering på medier for bakterier (Luria-Bertani agar, endoagar og galde esculin agar).
BEMÆRK: Brug mikroskopi og molekylære metoder til at identificere patogenernes slægter og arter. Om nødvendigt kan en analyse for tilstedeværelsen af andre parasitter udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne nedenfor om overvintrende CPB'er viser jordtemperatur, overlevelse og infektioner.
Jordtemperatur dynamik.
Temperaturer under nul i burene på en dybde på 30 cm blev registreret fra slutningen af november til begyndelsen af april (figur 1). Gennemsnitstemperaturen i denne periode var minus 3,3 ± 0,1 °C (gennemsnit ± standardfejl). Den laveste registrerede temperatur var minus 7,9 °C i midten af februar.
Overlevelse af overvintrende CPB'er.
Insektdødeligheden blev set under dvale og nåede et maksimum om foråret før fremkomst. Det oprindelige antal biller var 2000, hvoraf 1470 individer overlevede i slutningen af maj. Overlevelsesraten for billerne under dvaletilstanden var 61% (figur 2).
Infektioner i overvintrende CPB'er.
En analyse af 530 døde biller viste, at 53% af dem i dvaleperioden havde symptomer på bakteriel nedbrydning, og 25% havde symptomer på svampeinfektioner (figur 3). Beauveria dominerede (45 isolater) blandt de isolerede kulturer af entomopatogene svampe. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) og Lecanicillium var meget mindre almindelige (to isolater hver). Blandt de bakterier, der blev isoleret fra kadavere med symptomer på bakteriel nedbrydning (n = 30), blev arter tilhørende slægterne Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella og Glutamicibacter identificeret (supplerende tabel 1).
Figur 1: Dynamikken i jordtemperaturen. Jordtemperaturdynamik målt ved hjælp af en vandtæt temperaturdatalogger installeret i en dybde på 30 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Overlevelse af overvintrende Colorado-kartoffelbiller i forskellige dvaleperioder. Burene blev gravet ud, og de overlevende og døde biller blev talt i november, januar, april og maj. Barer repræsenterer antallet af overlevende biller. Whiskers angiver standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Infektioner i overvintrende Colorado kartoffelbille kadavere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende materialer: Klik her for at downloade nedenstående supplerende filer.
Supplerende figur 1. Aktivitet af uspecifikke esteraser i CPB's midgut under dvaletilstanden. Whiskers angiver standardfejl. Forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle mellem tidspunkter (Dunns test, P < 0,05).
Supplerende figur 2: Ændringer i ekspressionen af transkriptionsfaktoren NFkB (IMD-vej) i CPB's tarm- og fedtlegeme under dvaletilstand. Data præsenteres som foldændringer i forhold til et tidspunkt for august. Rp4, Rp18 og Arf19 blev brugt som referencegener. Whiskers viser standard fejl.
Supplerende tabel 1: Formodet identifikation af 16S rRNA (~800 bp) gensekvenser af bakterier isoleret fra en død CPB under dvaletilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser, at den foreslåede metode til undersøgelse af overvintring af CPB'er gør det muligt for os at opnå et tilstrækkeligt antal insekter i forskellige dvaleperioder. Succesen med den præsenterede teknik afhænger af flere uafhængige faktorer, hvoraf den vigtigste er vejrforholdene. I en kold, snefri vinter kan jorden fryse til hele dybden af buret. I dette tilfælde stiger risikoen for død af alle biller betydeligt18. Billeoverlevelsen afhænger af en kombination af mange faktorer, som kan variere betydeligt fra år til år6.
I forsøget faldt jordtemperaturen inde i burene om vinteren ikke til under minus 7,9 °C. Der blev ikke observeret is på en dybde større end 25 cm, og jorden forblev løs selv i perioden med den største afkøling (januar-februar). De fleste biller akkumuleret i den nederste del af hvert bur på en dybde på 30-40 cm. Billerne kan have gravet dybere med en større dybde af burene. På den anden side vil en forøgelse af burets dybde føre til en stigning i vægt, hvilket gør det udfordrende at trække buret ud af jorden, især om vinteren. Desuden graver CPB ifølge vores observationer i kartoffelmarker i den undersøgte region ikke dybere end 35 cm til overvintring. Dette fund kan forklares ved lerjordlaget i dybden på 30-35 cm, som billerne ikke kan overvinde. I vores eksperiment blev der brugt sand, lerjord fra den øverste 30 cm horisont. Dette er sandsynligvis grunden til, at billerne var i stand til at grave dybere end under naturlige forhold. Dybden, hvor CPB dvale, er typisk 10-25 cm (ref. 1), men dette kan variere mellem geografiske regioner. For eksempel i det nordøstlige USA (New Jersey) dvale de fleste biller i en dybde på 10-13 cm (ref. 13). Lignende overvintringsdybder af biller (≤15 cm) er også blevet dokumenteret i Wisconsin, USA18. I de sydlige uraler (Rusland) ligger dybden, hvor CPB-graverne til overvintring ligger i området 5-30 cm (ref. 20). Det skal bemærkes, at overlevelsesgraden af insekter ikke altid positivt korrelerer med en stigning i overvintringsdybde1. Faktisk blev det i et feltovervintringsforsøg i Estland6 vist, at overlevelsesraten for CPB var højere i en dybde på 30 cm end i en dybde på 50 cm. Disse forfattere foreslår, at dette fund kan skyldes manglen på ilt. Lignende data blev opnået i et feltforsøg i Wisconsin, USA18: Den højeste overlevelsesrate (51,5%) for overvintrende CPB'er blev registreret i en dybde på 15-25 cm. Samtidig blev18.100% dødelighed af billen noteret på en dybde på 25-35 cm. Vi mener, at en dybde på 40 cm er tilstrækkelig til forsøg i den tempererede zone, fordi procentdelen af overlevende biller var høj, og jordfrysningen ikke strakte sig til hele burets dybde. Tilstedeværelsen af snedække bidrager til mindre afkøling af jorden. Om nødvendigt kan tykkelsen af snedækket over burets overflade justeres.
Et andet centralt punkt i protokollen er CPB's mulige utilstrækkelige beredskab til overvintring på grund af en lille mængde lagrede næringsstoffer. Nogle voksne CPB'er forblev på jordoverfladen efter billernes massegravning i jorden. Det er muligt, at de ikke lagrede nok fedt, fordi succesen med overvintring også afhænger af mængden af akkumulerede næringsstoffer21. Derudover, når burene blev fjernet fra jorden om vinteren, var nogle af billerne i frossen tilstand på jordoverfladen eller i det nærliggende overfladelag. Måske var det de biller, der ikke havde nok energi til at grave sig ned på grund af underernæring, infektioner eller andre skadelige faktorer. Lashomb et al.13 bemærkede i eksperimenter med CPB overvintring, at ~ 15 % af voksne ikke gravede sig ned i jorden for overvintring. Disse forfattere diskuterede ikke årsagerne. Under alle omstændigheder er det nødvendigt at give biller nok mad.
Afhængigt af en undersøgelses mål kan det være nødvendigt at holde biller i dvaletilstand, efter at de er indsamlet fra jorden. Til dette formål bør laboratorietemperaturen være kølig, og billerne skal straks anbringes under forhold på 0-2 °C efter ekstraktionen fra jorden. Det blev observeret i vores arbejde, at CPB'er i efteråret og foråret næsten øjeblikkeligt starter lokomotorisk aktivitet efter at være blevet udgravet fra jorden; Denne proces foregår meget langsommere midt om vinteren.
Denne undersøgelse tog ikke hensyn til aktivt bevægelige entomopatogener og parasitoider. Vi brugte et geotekstil som en ekstra barriere mod spredning af CPB. Bemærk, at et geotekstil ikke bør anvendes i forskning i aktivt bevægelige entomopatogener (f.eks. Entomopatogene nematoder), rovdyr eller parasitoider, fordi det vil hindre deres bevægelse gennem det.
Det er vigtigt at påpege, at undersøgelser af immunitet og sygdomme i CPB for det meste udføres under aktive fodringsstadier. Hvilestadier er mindre undersøgt og er hovedsagelig blevet undersøgt under laboratorieforhold. Under disse forhold er det imidlertid vanskeligt at simulere de udsving i temperatur, fugtighed og beluftning, der forekommer på naturlige ynglesteder. Således foretrækkes feltforsøg22. For at bestemme årsagerne til CPB vinterdødelighed i marken i forskellige dvaleperioder er det nødvendigt at udgrave overvintrende biller fra jorden. Undersøgelser af CPB-overvintring under naturlige forhold blev aktivt udført i 1970'erne-1980'erne. De metoder, der er beskrevet i disse papirer, består hovedsageligt i at indsamle og tælle individer, der dukker op i foråret 13, evaluere effektiviteten af at bruge entomopatogene svampe 14,15,16 eller entomopatogene nematoder 15 før overvintring og indsamle overvintrende biller fra jorden om foråret og efteråret for at bestemme naturlig vinterdødelighed 17. Samtidig varierede størrelsen og formen af de bure, der blev anvendt i disse forsøg, fra 20×20 cm til 90×90×90 cm (ref.13) eller 180×60×30 cm (ref.18). Det skal påpeges, at de ovennævnte undersøgelser ikke var rettet mod at udvikle metoden til CPB-overvintring med mulighed for at indsamle insekter om vinteren. I modsætning til eksisterende metoder gør teknikken beskrevet i denne artikel det muligt at undersøge naturlige CPB-populationer i en sneperiode.
Afslutningsvis gør den foreslåede metode det muligt for forskere at opnå det ønskede antal overvintrende CPB-individer under naturlige forhold med relativt lav dødelighed af insekterne og til en lav pris. Undersøgelse af forskellige aspekter af CPB-dvaletilstand er afgørende ud fra både grundforskning og anvendt synspunkt: for at forbedre tilgange til bekæmpelse af dette skadedyr. Denne teknik kan tilpasses andre insektarter, der overvintrer i jorden. Fremtidige forskere kan anvende denne metode til at studere generel fysiologi og biokemi - herunder immunitet af overvintringsfaser - af forskellige insektarter. Desuden kan denne metode anvendes til at forudsige overflod af skadedyr af interesse på grundlag af deres vinterdødelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker vores kolleger Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova og Oksana Tomilova for deres hjælp med at organisere og udføre felt- og laboratorieprocedurerne.
Forskningen blev støttet af Russian Science Foundation, projekt nr. 22-14-00309.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
