Summary
在这里，我们提出了一种在温带自然条件下研究科罗拉多马铃薯甲虫冬眠的方法以及一种在冬季收集甲虫的技术。该方法允许在冬眠的任何阶段获得所需数量的越冬个体进行各种分析。
Abstract
温带地区马铃薯 Solanum tuberosum L.的主要害虫之一是昆虫科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）。大多数关于CPB免疫和疾病的研究都是在主动喂养阶段进行的。尽管如此，关于休息阶段的研究较少，尽管这些甲虫的大部分生命周期都处于冬季滞育（冬眠）状态。在这项工作中，开发并测试了一种在自然条件下研究CPB冬眠的方法，为在冬季收集足够数量的个体提供了机会。在本文中，评估了CPB的存活率，并确定了处于不同冬眠阶段的传染性病原体。CPB死亡率在冬眠期间增加，在4-5月达到最大值。从死虫中分离出昆虫病原真菌（Beauveria、 Isaria 和 Lecanicillium）和细菌 Bacillus、Sphingobacterium、Peribacillus、Pseudomonas 和 Serratia 。甲虫在整个冬眠期的存活率为61%。没有发现冷冻或干燥的甲虫，表明所提出的方法取得了成功。
Introduction
科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Say（CPB）是茄科植物的重要害虫，主要是马铃薯Solanum tuberosum L。该物种的地理范围超过1600万km2，并不断扩大1。CPB具有兼性冬季滞育，在温带地区必须冬眠。滞育是由短日照光周期诱导的，并由温度调节 1.这些甲虫在成虫阶段通过钻入土壤越冬。随着纬度的增加，冬眠期的持续时间延长。在温带地区，特别是在其范围的北部地区，越冬持续长达 9 个月：从 8 月至 9 月到 5 月至 6 月（Noskov 等人，个人观察）。在此期间，CPB与温带地区的任何其他昆虫一样，暴露在不利的冬季条件下，必须增加其耐寒性。同时，甲虫与土壤的接触增加了各种机会性和致病微生物感染的风险2。因此，这些甲虫在冬眠期间需要保持一定程度的免疫系统活动，这在能量上也很昂贵。尽管如此，即使昆虫在感染中幸存下来，这种疾病也可能降低其耐寒性3.应该指出的是，低温并不是CPB冬季死亡的唯一原因。缺氧也起着重要作用，在某些情况下，它可能是冬季死亡的主要因素4,5。
众所周知，CPB的自然冬季死亡率可能非常高，在粘壤土中达到100%6。因此，越冬是CPB生命周期中最关键的时期之一。然而，关于自然条件下CPB冬眠的生理学、免疫系统活动、存活率和其他参数的数据仍然有限。有关于CPB成人在滞育期间和应对冷休克的差异基因表达和各种生理参数的研究7,8,9,10,11,12;然而，这些分析主要是通过在实验室条件下诱导滞育或冷应激来进行的，没有温度、湿度和天然病原体载量的自然波动。尽管如此，研究这些甲虫在自然条件下从土壤中挖掘收集的生理学是很重要的。1970-1980年代，对自然条件下CPB越冬的不同方面进行了积极研究13,14,15,16,17,18。另一方面，这些研究不涉及冬季从土壤中挖掘CPB。此外，没有详细提供CPB的受控冬眠技术和笼子的描述。因此，需要研究在自然环境中越冬的CPBs的生理学19。
本研究的目的是开发和测试一种在自然条件下控制CPB成虫冬眠的方法。所提出的方法允许在大陆性气候的野外条件下冬眠期间获得所需数量的CPB个体，用于微生物学、免疫学和其他测定。该方法可以适用于在雪下土壤中越冬的其他昆虫物种。
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Protocol
1. 冬眠笼的描述
注意：根据实验的目的，笼子的数量会有所不同。每个采样日期至少使用三个笼子。要估计将出现的甲虫数量，请准备至少三个额外的笼子，这些笼子要到春天才能从土壤中取出。
- 使用由 25 × 25 × 40 厘米（长 × 宽 × 高）的刚性木框架制成的笼子。
- 要为笼子搭建框架，请使用至少 2 厘米厚、4 厘米宽的木板条。
- 用开口尺寸不大于 5 毫米× 3 毫米的不锈钢网覆盖笼子的内部。使用木制订书机固定网眼。
- 用订书机将不锈钢网固定在底部外侧。
- 在笼子内侧铺上密度为 60 g/m 2 的黑色合成土工布。
注意：土工布可作为防止甲虫逃跑的额外屏障。不要在与主动移动的昆虫病原体和寄生虫相关的实验中使用它。 - 将一根约 60 厘米高的合成半透明透气织物管紧紧地固定在笼子的顶部。
- 将两根结实的绳索交叉并固定在笼子的底部，以便在需要时将其从土壤中拉出。
2. 保持架的安装
- 在土壤中挖一个 40 厘米深的洞，然后将笼子放在里面。
- 将干草或干草铺在洞上。
- 将笼子放在里面，使干草或干草位于笼子的墙壁和土壤之间。
- 用收集昆虫的同一块马铃薯田的土壤填满笼子。
- 将防水温度和湿度数据记录仪安装到笼子中所需的深度。
注意： 可以使用任何制造商的数据记录器，并且必须能够在低温下运行。 - 在甲虫引入前 3-4 周在每个笼子内种植马铃薯幼苗，并适度浇水。
- 将一根合成纤维管垂直固定在安装在笼子外侧的任何材料的棍子上。
3. 越冬前饲养昆虫
- 在马铃薯植被末端的无农药马铃薯田中手动收集成年甲虫。
注意：成虫与幼虫有很大不同，其特征是条纹鞘翅，而幼虫是红色的。 - 将收集到的甲虫放在 15-20 升的塑料桶中（每桶最多 200 只），装有马铃薯顶部，用于喂养昆虫，然后再将它们放入笼子中。
- 用透气织物盖住水桶。
注意：不要将昆虫放在桶中超过 12 小时。使用足够大的马铃薯顶部，以防止甲虫在桶底堆积。 - 将不超过 200 个 CPB 个体放在覆盖有合成织物网的马铃薯植株上。
- 食用土豆盖后，加入装有水的塑料罐中的新鲜土豆盖，然后每天更换土豆盖。
注意： 要将茎固定在罐子中，请使用棉绒和封口膜。移除甲虫时，请仔细检查旧茎是否有甲虫。 - 一旦所有的甲虫都钻入土壤中越冬，从棍子上解开合成织物管并放下织物。
4. 冬季昆虫采集
- 清除笼子表面以上的积雪。
- 用强力铲子松开两侧的笼子。
- 用绳索将笼子从土壤中拉出。
- 将笼子带到实验室。
注意：根据实验的目的，冬眠的甲虫在分析之前可能必须处于非活动状态。在这种情况下，从土壤中分离甲虫期间实验室中的温度应为~2-5°C。 - 从盒子中取出小份土壤，小心地打碎大块土壤，然后用镊子隔离甲虫。
- 将活甲虫与尸体分开。健康的甲虫在它们周围形成致密的土壤，形成一个气腔（所谓的摇篮），因此很容易与土壤分离。被真菌杀死的甲虫被木乃伊化或表面有可见的菌丝体。细菌分解的昆虫是深色的。
- 通过筛子筛选土壤，以确保所有甲虫都被隔离且未受损。
- 将有真菌感染或细菌分解症状的尸体放入单个无菌 15 mL 离心管中以备将来鉴定。
- 将活甲虫储存在温度为0-2°C的冰箱中，直到在装有潮湿棉球的密闭通风容器中进行分析。
5. 器官和组织样本的制备
- 为了收集血淋巴，使用胰岛素针头在鞘翅下的腹部外侧部分穿刺。
注意：在越冬期间，血淋巴的量显着减少，这使得收集这种液体变得困难。 - 要分离肠道，切掉头部胶囊，将所有内容物挤出到带有磷酸盐缓冲液的培养皿中，分离肠道，并清除脂肪和Malpighian血管。
- 分离肠道的所需部分，例如前肠、中肠或后肠。
- 为了分离脂肪体，在肠道分离后将其与其他组织分开。
注：分离的组织可用于测量抗氧化和解毒酶的活性（例如：补充图 1），分析免疫信号通路基因的调控（例如： 补充图2），或昆虫肠道内容物的宏条形码等。
6. 从尸体中分离微生物
- 为了从尸体中分离出昆虫病原真菌，将木乃伊昆虫放入无菌的湿度室中。
- 使用来自甲虫内部内容物的气生分生孢子（如果可用）或菌核，用0.4%乳酸接种在Sabouraud葡萄糖琼脂上。
注意：立即使用带有菌丝体和分生孢子的甲虫进行电镀（不要将它们放入湿度室中）。 - 从有细菌分解症状的尸体中分离出细菌。
- 切下甲虫的头，挤出内部内容物，并将它们收集到试管中，以便随后接种在细菌培养基（Luria-Bertani琼脂，endo琼脂和胆汁七叶苷琼脂）上。
注：使用显微镜和分子方法鉴定病原体的属和种。如有必要，可以分析是否存在其他寄生虫。
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Representative Results
以下关于越冬 CPB 的结果显示了土壤温度、存活率和感染率。
土壤温度动态。
从11月底到4月初，网箱中30厘米深的温度低于零度（图1）。这一时期的平均气温为零下3.3°C±0.1°C（平均值±标准误差）。2月中旬的最低记录温度为零下7.9°C。
越冬CPB的存活率。
昆虫在冬眠期间死亡，在春季出苗前达到最大值。甲虫的初始数量为 2000 只，其中 1470 只在 5 月底幸存下来。甲虫在冬眠期间的存活率为61%（图2）。
越冬CPB的感染。
对530只死甲虫的分析表明，在冬眠期间，53%的甲虫有细菌分解的症状，25%的甲虫有真菌感染的症状（图3）。 Beauveria 在昆虫病原真菌的分离培养物中占主导地位（45 个分离株）。 Metarhizium、冬虫夏草 （=Isaria）和 Lecanicillium 则少得多（各有2个分离株）。在从尸体中分离出的具有细菌分解症状的细菌（n = 30）中，鉴定出属于芽孢杆菌属、鞘杆菌属、芽孢杆菌属、 假单胞菌属、沙雷氏菌属、拉氏 菌属和 谷氨酸杆 菌属的物种（补充表1）。
图1：土壤温度动态。 通过安装在 30 厘米深处的防水温度数据记录仪测量的土壤温度动态。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：越冬科罗拉多马铃薯甲虫在不同冬眠期的存活率。 笼子被挖出来，在11月、1月、4月和5月对幸存和死亡的甲虫进行计数。晶须表示标准误差。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：越冬科罗拉多马铃薯甲虫尸体的感染情况。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充资料：请按此下载以下补充资料。
补充图 1.冬眠期间CPB中肠中非特异性酯酶的活性。 晶须表示标准误差。不同的字母表示时间点之间的显著差异（Dunn检验，P < 0.05）。
补充图2：冬眠期间CPB肠道和脂肪体中转录因子NFkB（IMD通路）表达的改变。数据表示为相对于 8 月时间点的倍数变化。Rp4、Rp18和Arf19作为参考基因。 晶须显示标准误差。
补充表 1：在冬眠期间从死亡的 CPB 中分离出的细菌的 16S rRNA （~800 bp） 基因序列的推定鉴定。
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Discussion
本研究表明，所提出的研究CPBs越冬的方法使我们能够在不同的冬眠期获得足够数量的昆虫。所提出的技术的成功取决于几个独立因素，其中最重要的是天气条件。在寒冷、无雪的冬天，土壤可能会冻结到笼子的整个深度。在这种情况下，所有甲虫的死亡风险显着增加18.甲虫的存活取决于许多因素的组合，这些因素每年都会有很大差异6.
在实验中，冬季网箱内的土壤温度没有低于零下7.9°C。 在超过25厘米的深度没有观察到冰，即使在最凉爽的时期（1月至2月），土壤仍然松散。大多数甲虫聚集在每个笼子的下部，深度为30-40厘米。甲虫可能挖得更深，笼子的深度更大。另一方面，增加笼子的深度会导致重量增加，使得从土壤中提取笼子具有挑战性，尤其是在冬天。此外，根据我们在所研究地区的马铃薯田的观察，CPB越冬的挖洞深度不超过35厘米。这一发现可以用30-35厘米深处的粘土层来解释，这是甲虫无法克服的。在我们的实验中，使用了上部 30 厘米地平线的沙质肥沃土壤。这可能就是甲虫能够比自然条件下挖得更深的原因。CPB 冬眠的深度通常为 10-25 厘米（参考文献 1），但这可能因地理区域而异。例如，在美国东北部（新泽西州），大多数甲虫在10-13厘米的深度冬眠（参考文献 13）。在美国威斯康星州也记录了类似的甲虫越冬深度（≤15 厘米）18。在乌拉尔南部（俄罗斯），CPB越冬的深度在5-30厘米的范围内（参考文献 20）。应该注意的是，昆虫的存活率并不总是与越冬深度的增加呈正相关1.事实上，在爱沙尼亚6 的田间越冬实验中，结果表明 CPB 在 30 厘米深度的存活率高于 50 厘米深度的存活率。这些作者提出，这一发现可能是由于缺氧造成的。在美国威斯康星州18的田间试验中也获得了类似的数据：在15-25厘米的深度记录了越冬CPB的最高存活率（51.5%）。同时，在18-25厘米的深度注意到甲虫的100%死亡率为35%。我们认为，40厘米的深度足以在温带进行实验，因为存活的甲虫比例很高，而且土壤冻结没有延伸到笼子的整个深度。积雪的存在有助于减少土壤的冷却。如有必要，可以调整网箱表面以上的积雪厚度。
该协议的另一个关键点是，由于储存的营养物质量很少，CPB可能对越冬的准备不足。一些成年CPBs在甲虫大量钻入土壤后仍留在土壤表面。它们可能没有储存足够的脂肪，因为越冬的成功还取决于积累的营养物质的数量21.此外，当冬季将笼子从土壤中移走时，一些甲虫在土壤表面或近表层处于冻结状态。也许这些甲虫由于营养不良、感染或其他破坏性因素而没有足够的能量挖洞。Lashomb 等人 13 在 CPB 越冬实验中指出，~15% 的成虫不会钻入土壤中越冬。这些作者没有讨论原因。无论如何，有必要为甲虫提供足够的食物。
根据研究的目标，可能需要在从土壤中收集甲虫后将其保持在冬眠状态。为此，实验室温度应凉爽，从土壤中提取后应立即将甲虫置于0-2°C的条件下。在我们的工作中观察到，在秋季和春季，CPBs在从土壤中挖掘出来后几乎立即开始运动活动;这个过程在隆冬时节发生得更慢。
这项研究没有考虑积极移动的昆虫病原体和类寄生虫。我们使用土工布作为防止CPB传播的额外屏障。请注意，土工布不应用于研究主动移动的昆虫病原体（例如，昆虫病原线虫）、捕食者或寄生虫，因为它会阻碍它们通过土工布的移动。
需要指出的是，关于CPB的免疫和疾病的研究大多是在主动喂养阶段进行的。静息期的研究较少，主要在实验室条件下进行检查。然而，在这些条件下，很难模拟自然繁殖地发生的温度、湿度和曝气的波动。因此，现场实验是可取的22。为了确定不同冬眠期田间CPB冬季死亡的原因，有必要从土壤中挖掘越冬甲虫。1970-1980年代积极开展了自然条件下的CPB越冬研究。这些论文中描述的方法主要包括收集和计数春季出现的个体 13，评估在越冬前使用昆虫病原真菌 14、15、16 或昆虫病原线虫 15 的有效性，以及在春季和秋季从土壤中收集越冬甲虫以确定冬季自然死亡率 17.同时，这些实验中使用的笼子的大小和形状从20×20厘米到90×90×90厘米（参考文献13）或180×60×30厘米（参考文献18）不等。应该指出的是，上述研究的目的不是开发CPB越冬的方法，并有可能在冬季收集昆虫。与现有方法不同，本文中描述的技术可以在雪期调查自然CPB种群。
综上所述，该方法使研究人员能够在自然条件下以相对较低的昆虫死亡率和低成本获得所需数量的越冬CPB个体。从基础研究和应用的角度来看，对CPB冬眠的各个方面进行调查是必不可少的：为了改进控制这种害虫的方法。该技术可以适用于在土壤中越冬的其他昆虫物种。未来的研究人员可能会将这种方法应用于研究各种昆虫的一般生理学和生物化学，包括越冬期的免疫力。此外，该方法还可用于根据冬季死亡率预测感兴趣的害虫的丰度。
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Disclosures
作者声明不存在竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢我们的同事弗拉基米尔·希洛、维拉·莫罗佐娃、乌利亚娜·罗茨卡娅、奥尔加·波列诺戈娃和奥克萨娜·托米洛娃在组织和执行现场和实验室程序方面的帮助。
该研究得到了俄罗斯科学基金会的支持，项目编号为22-14-00309。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar bacteriological purified | diaGene | 1806.5000 | |
| Bile Esculin Agar | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glucose monohydrate-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Lactic acid | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani liquid medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 |
|
| Phosphate buffered saline | Medigen | PBS500 | |
| Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11 | Relsib | Waterproof datalogger |
References
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