Küken Ex ovo Kultur und Ex ovo CAM-Assay: Wie es wirklich funktioniert

Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in chick Ex ovo Kultur, Anwendung von potenziell angiogenen Substanzen und erfolgreiche Impfung von Tumorzellen und Gewebe auf der Oberfläche der CAM.

Hallo, ich bin Susan Paa. Ich komme vom Institut für Physiologische Chemie, Abteilung für Biochemische Endokrinologie an der Universität Burg Esen in Deutschland. Hallo, ich bin Daniel Ze Basian Dole.

Ich komme aus der gleichen Institution wie Susan. Hallo, ich bin Mann vom Institut für Anatomie Abteilung für Neuro der Universität Burg. Wir zeigen Ihnen, wie die CH X-Kultur und der Co-Membran-Essay wirklich funktionieren.

Also nichts wie ran ins Labor. In den meisten neueren experimentellen Studien wurde die Cam, d.h. die Chico-Membran, freigelegt, indem ein Fenster durch die Eierschale geschnitten wurde, und die Experimente wurden in ovo durchgeführt, was zu erheblichen Einschränkungen in der Zugänglichkeit der CAM und in den Möglichkeiten zur Beobachtung und Fotodokumentation von Effekten führte. X-Ovo-Kulturen von Hühnerembryonen erleichtern die Zugänglichkeit des Cams und des Hühnerembryos erheblich.

Siehe das schlagende Herz, das eine einfache in vivo Dokumentation der Wirkung und experimentelle Manipulation des Embryos ermöglicht. In unserem Videoartikel werden wir eine Schritt-für-Schritt-Demonstration der erfolgreichen Anwendung der X-Ovo-Kultur für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen geben. Die Eier werden in einem Brutkasten mit beweglicher Schale bebrütet.

Hier sehen Sie, wie das Heizelement und der Tablettbeweger die Eier 12 Mal am Tag kontinuierlich drehen. Die Luftfeuchtigkeit wird bei 60 % gehalten, indem Wasser in Plastikbehälter am Boden des Inkubators gegeben wird, und die Inkubationstemperatur wird vor Beginn der Inkubation auf 37,5 Grad Celsius eingestellt. Schmutz, Federn und Exkremente werden vorsichtig von den Eierschalen entfernt, wobei das maschinelle Abwischen der Eier mit Ethanol oder Desinfektionsmittel die Überlebensraten der Embryonen jedoch deutlich reduziert.

Die Eier werden horizontal auf der beweglichen Schale des Inkubators positioniert. Bitte achten Sie darauf, genügend Abstand zwischen den einzelnen Eiern zu halten, um eine freie Rotation zu ermöglichen. Nach der Inkubation Für 72 Stunden werden die Eizellen aus dem Brutkasten entnommen und die Oberseite der Eizellen, auf der sich der Embryo befindet, wird mit Bleistift markiert.

Da der Embryo der Rotation bis zu einem gewissen Grad widersteht und hier verbleibt. Für ein besseres Gefühl sollten keine Handschuhe zum Aufschlagen der Eier verwendet werden, sondern die Hände sollten mit 70%Ethanol desinfiziert werden. Das Ei wird horizontal mit einer Bleistiftmarkierung auf der Oberseite gehalten und an der Kante eines dreieckigen magnetischen Rührstabs geknackt. Für eine maximale Kraftkontrolle während des Knackvorgangs sollten die Ellbogen nicht auf der Tischplatte aufliegen. Es ist wichtig, dass sowohl die Eierschale als auch die Eimembran geöffnet werden, während das Aufschlagen von Eiweiß austritt, ist ein sicheres Zeichen dafür, dass die Eimembran perforiert wurde.

Das Ei wird nahe am Boden der Patriot-Schale aufbewahrt. Um ein weiteres Auslaufen von Eiweiß während dieses ersten Öffnungsvorgangs zu vermeiden, ist es wichtig, dass das Eiweiß auf dem Boden der Patriot-Schale noch mit dem Rest im Inneren des Eis verbunden ist. Da dies zu einem Vakuum im Inneren des Eies führt, das das Eigelb an Ort und Stelle hält, indem mit Daumen und Mittelfinger sanft Druck auf den Meridian ausgeübt wird, der durch den Spalt und den Äquator des Eies verläuft, ist es möglich, das Vakuum und die Extrusion des Eiinhalts zu regulieren.

Der Inhalt des Eies kann dann mit dem Eigelb unbeschädigt in die Petrischale überführt werden. Wenn das Ei vorsichtig angehoben und beide Hälften der Schale vorsichtig getrennt werden, werden die Ex-Ovo-Kulturen auf ein Tablett gelegt, in einen Inkubator zurückgebracht und bei 37,5 bis 38,2 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. Eine Kohlendioxid- oder Sauerstoffzufuhr ist nicht notwendig.

Werden spezielle Patriot-Schalen mit Abstandshaltern zwischen Deckel und Schale und Inkubatoren mit Belüftungsgitter verwendet, sollte das Belüftungsgitter halb offen gehalten werden. Autoklavenfilter Papiere werden als Stützmaterial für flüssige Substanzen verwendet, die auf den Nocken aufgetragen werden, da sie den Nocken am wenigsten zu reizen scheinen. Die Applikationsstelle sollte auf halbem Weg zwischen dem Embryo und dem Rand der Kamera liegen, da der Embryo sonst die mikroskopische Beobachtung von Effekten im Durchlicht behindert.

Die Flüssigkeit, hier Atropin, sollte sofort nach dem Aufsetzen des Filters auf den Nocken aufgetragen werden, um ein Austrocknen zu vermeiden. Entweder zusätzliche Dosen oder Puffer sollten jeden Tag erneut aufgetragen werden. Wenn der Nocken voll entwickelt ist, können bis zu sechs verschiedene Proben appliziert werden und ihre Auswirkungen können auf einem einzigen Nockenring verglichen werden. Aus einem Milliliter sollte die Pipettenspitze so dünn wie möglich geschnitten werden, um das Gewicht zu minimieren und ein Eindrücken des Nockens zu vermeiden.

Der Ring wird dann auf den Nocken aufgebracht und die Zellen werden in den Ring pipettiert. Eine Hamilton Mikroliter-Spritze wird mehrmals mit 70%igem Ethanol und abschließend mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS gespült. Die Mikrospritze wird vorsichtig mit einer vorbereiteten Zellsuspension befüllt. Dringen Sie jedoch schnell mit der Spritzennadel in den Nocken und die Augenschichten ein und injizieren Sie kontinuierlich die Zellsuspension. Die Nadel sollte einige Sekunden im Öhr verbleiben, um einen Verlust der injizierten Zellsuspension zu vermeiden.

Kulturen von Eizellen, die drei Tage lang bebrütet werden, werden als Spender von Gliedmaßenknospen verwendet. Der Embryo wird aus den verbundenen Dottergefäßen präpariert. Durch das Schneiden eines Kreises wird der Embryo mit einem kleinen Abtropflöffel in eine Petrischale gebracht, die mit kaltem, sterilem PBS gefüllt ist, und unter Rühren gewaschen.

Anschließend wird der Embryo in eine frische Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist, überführt und von den umgebenden Membranen befreit, wobei diese vorsichtig mit einer feinen Pinzette auseinandergerissen werden. Die Knospen der Gliedmaßen werden mit einer Pinzette so nah wie möglich am Körper abgelöst, gegriffen und in die Kamera eines acht bis 10 Tage alten Wirtshuhns übertragen. An der gewünschten Applikationsstelle wird der Nocken durch sanftes Schaben mit einem Stück der Pinzette selektiv traumatisiert.

Dann wird das Transplantat gegriffen und mit dem anderen Stück der Pinzette auf den Nocken gelegt. Die Opfermaus ist auf einem Brett fixiert. Die Bauchdecke wird mit 70% Ethanol befeuchtet, entlang der Mittellinie geschnitten und die Hautlappen werden seitlich mit Stiften fixiert.

Die Gebärmutter wird aus dem Bauch entnommen, abgelöst und in ein Becherglas überführt. Mit kaltem PBS. Die embryonalen Membranen werden zu Demonstrationszwecken vorsichtig mit einer Pinzette entfernt.

Ein 16 Tage alter Mausembryo ist hier zu sehen, um die Knospen der Gliedmaßen besser sichtbar zu machen. Nur so werden optimale Veredelungsergebnisse erzielt. Werden jedoch Gliedmaßenknospen von 10 bis 13 Tage alten Embryonen verwendet, werden die Gliedmaßenknospen abgeschnitten oder mit einer feinen Pinzette so nah wie möglich am Körper eingesetzt.

An der gewünschten Applikationsstelle wird das CAM durch sanftes Schaben mit einer Pinzette selektiv traumatisiert. Dann werden die Knospen der Gliedmaßen ergriffen und in das CAM eines acht bis 10 Tage alten Wirtshuhns übertragen. Das Transplantat wird ein- oder zweimal auf einer Seite des Nockens platziert, auf der keine endgültige Transplantation zur Entfernung von überschüssigem PBS vorgesehen ist.

Die Transplantate werden idealerweise auf dem Nocken in der Nähe einer Y-Bifurkation eines Blutgefäßtumors platziert. Biopsien werden mit sterilen Skalpellen in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke geschnitten. Die Entnahme von Material von der Oberfläche der Biopsie erhöht das Risiko einer Kontamination mit Muskel- oder Bindegewebe.

An der gewünschten Applikationsstelle wird das CAM durch sanftes Schaben selektiv traumatisiert. Ein Stück aus dem Kern der Biopsieprobe wird auf das CAM eines acht bis 10 Tage alten Wirtshuhns gepfropft. Die Transplantate werden idealerweise auf dem Nocken in der Nähe einer Y-Bifurkation eines Blutgefäßes platziert.

Das Transplantat wird dann mit minimalem PBS auf das CAM übertragen. Es kann leichter Druck ausgeübt werden, um das Transplantat in eine resultierende Vertiefung des Nockens zu manövrieren. Der Embryo des Wirtskükens wird durch Enthauptung getötet.

Das CAM mit dem angehängten Transplantat wird durch einen kreisförmigen Schnitt entfernt und in eine mit PBS gefüllte Petrischale überführt. Aus dem Transplantat wird mit Ausnahme der ehemaligen Ansatzstelle überschüssiges CAM geschnitten. Wieder an der gewünschten Einsatzstelle.

Die Kamera eines neuen Wirtskükenembryos wird selektiv durch sanftes Schaben traumatisiert und das Transplantat wird mit minimalem PBS auf die Kamera des zweiten Wirts übertragen. Wir haben gerade gezeigt, wie CH X oder Kultur wirklich funktioniert. Ich habe Ihnen die Vorteile im Vergleich zu Orval-Experimenten aufgezeigt und Ihnen einige Beispiele für die Anwendung gegeben.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.