Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

Este vídeo descreve um método para gerar e usar um microarray de polímero usando uma técnica de fotopolimerização no chip. As primeiras lâminas de vidro são revestidas por imersão em polihidroxietil, metacrilato ou FEMA para produzir um substrato de baixa fixação. Os monômeros são misturados em proporções variadas para produzir uma biblioteca de soluções de monômeros.

As soluções são transferidas para um formato de lâmina de vidro usando um dispositivo de impressão robótico e curadas com irradiação UV. O monômero polimeriza e o solvente é extraído a vácuo. Após a caracterização da superfície de alto rendimento, os microarrays podem ser usados para triagem de desempenho de materiais, como ensaios de fixação bacteriana.

A análise dos dados de fixação é um passo em direção à descoberta de novos biomateriais, destacando a utilidade do formato de microarray de polímero. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes onde a resposta biológica de diferentes materiais é investigada, um material de cada vez, é a triagem paralela de centenas de materiais, que são facilmente manipulados em uma única lâmina. Essa técnica pode ser facilmente adaptada a vários ensaios biológicos, como a triagem de materiais que resistem à fixação bacteriana ou suportam a expansão de células-tronco.

Essa técnica ajudou a descobrir materiais com aplicações potenciais para apoiar a expansão de células-tronco potentes para a medicina regenerativa. Também estamos muito entusiasmados com a recente descoberta de materiais que resistem à fixação bacteriana com potencial para reduzir a ocorrência de infecções associadas a dispositivos médicos. Geralmente, os usuários novos no método terão dificuldade em otimizar as condições necessárias para imprimir um microarray, pois é difícil prever as condições ideais.

Errar até mesmo pequenos detalhes pode levar a matrizes não utilizáveis. Também é essencial considerar qual cepa bacteriana e a condição cultural serão usadas, porque a morfologia de fixação e biofilme são específicas da espécie e do meio e, portanto, podem variar consideravelmente. Aqui usamos o aerogênio como um organismo modelo e o meio químico definido para um ensaio de fixação bem controlado.

Nossos colaboradores do MIT tiveram a ideia desse método por meio da comparação com microarrays de DNA e proteínas. Estes estão bem estabelecidos para explorar seus respectivos espaços combinatórios biológicos. Dan e Bob perceberam que existia um espaço de combinador químico semelhante que precisava ser explorado a partir de materiais demonstrando um procedimento será Andrew Hook e Chen Chang bolsistas de pós-doutorado em nosso projeto financiado pelo fundo de boas-vindas Comece este procedimento preparando um fundo de baixo apego.

Esta é uma superfície que resiste à ligação de biomoléculas, como proteínas e células. Pese dois gramas de poli-hidroxietil metacrilato ou FEMA em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, aumente o volume para 50 mililitros com 95% de etanol em água.

Em seguida, coloque o tubo em um ator por cerca de 24 horas ou até que a FEMA esteja completamente solubilizada, segurando a luz do vidro com uma pinça. Mergulhe em vidro epóxi funcional. Deslize para a solução FEMA para coar tudo, exceto cinco milímetros.

Os grupos epóxi formam ligações covalentes com o revestimento FEMA. A porção não revestida pode servir como um controle positivo durante um período de um segundo. Retire a lâmina da solução FEMA, inverta a lâmina e coloque-a em uma posição quase horizontal para secar.

Quando a lâmina estiver seca, coloque-a em um suporte de lâmina. Deixe as lâminas revestidas com FEMA em condições atmosféricas por uma semana para permitir a evaporação completa do solvente. Em seguida, para fazer as soluções de monômero, pipetar cinco microlitros de solução fotoiniciadora e 15 microlitros de monômeros de metacrilato de acrilato solúvel em dimetilformamida em uma placa de origem de 384 poços.

Um volume total de 20 microlitros é ideal para a formação de manchas. Agora que as soluções foram geradas, um robô de impressão de contato com um estágio X, Y, Z é usado para gerar o microarray. O robô usa pinos com fenda de 220 micrômetros de diâmetro que contêm fendas que funcionam como reservatórios para transferência de solução.

Comece colocando os pinos e o porta-pinos em um ator contendo di clorometano por 10 minutos. Depois de deixar os pinos secarem, recoloque o suporte no cabeçote de impressão. Em seguida, carregue os pinos no suporte.

Em seguida, carregue 10 lâminas de vidro para borrão e lâminas revestidas pela FEMA no robô. Normalmente, três matrizes replicadas são impressas em cada lâmina. Em seguida, usando tubos, conecte a estação de lavagem do robô a uma garrafa contendo 2,5 litros de dimetilformamida fresca.

Carregue a placa que contém a solução de monômero no robô. Encha toda a câmara do robô com Argonne para reduzir o nível de oxigênio para menos de 2000 PPM. Neste baixo nível, os radicais de polimerização não devem ser extintos pelo oxigênio.

Usando um dispositivo regulador de umidade, defina a umidade a ser mantida entre 30 a 40% dentro da câmara do robô, incluindo a umidade que permite que a FEMA inche, permitindo que o polímero formado interpenetre a camada FEMA e fique fisicamente preso à superfície. Para iniciar a impressão, clique em ir no software com o computador associado. Os pinos irão então abaixar nas soluções de monômero a uma velocidade de 25 milímetros por segundo.

Em seguida, eles serão mantidos em solução por 2,5 segundos e retirados a uma velocidade de 25 milímetros por segundo. Em seguida, a extremidade do pino é colocada em contato com as lâminas FEMA, dispensando aproximadamente 2,4 nanolitros de solução da parte da colcha do pino. O tempo total de contato para cada contato é de 10 milissegundos e a velocidade de aproximação e retirada é de 175 milímetros por segundo.

Os pinos são então borrados fazendo contato repetidamente com as lâminas de borrão de vidro para remover a solução de monômero da parte externa do pino. A sequência de blotting usada consiste em 33 contatos com uma lâmina de vidro limpa. As primeiras quatro posições farão 10, 5, 4 e três contatos, respectivamente.

As próximas quatro posições farão dois contatos e as últimas três posições farão um contato após a impressão. Os pinos são lavados em banho de fluxo de DMF com agitação por 30 segundos. Ao mesmo tempo, as lâminas impressas são irradiadas com uma fonte UV de ondas curtas de 365 nanômetros a uma densidade de 30 milivolts por centímetro quadrado.

Assim que a lavagem e a irradiação estiverem concluídas, o próximo slide é impresso. Se a impressão for bem-sucedida, irradie as matrizes com UV a 365 nanômetros por mais 10 minutos. As matrizes recém-impressas são colocadas em um forno a vácuo ajustado para menos de 50 mili tours por uma semana para remover un polimerizado, monômero e solvente após a impressão e extração a vácuo.

O sucesso da polimerização de manchas poliméricas pode ser avaliado por microscopia de luz simples para identificar quaisquer morfologias de manchas anômalas, normalmente as manchas devem parecer circulares e uniformes, conforme mostrado nesta figura à esquerda. A causa provável para uma mudança na geometria é um pino danificado ou sujo ou contaminante de poeira nas soluções de monômero. Se isso acontecer, o processo terá que ser repetido para um pequeno número de combinações de monômeros.

Manchas deformadas podem ser vistas, por exemplo, uma mancha central com um satélite de pequenas manchas mostradas à direita ou uma forma de ovo frito onde há uma mancha central em cima de uma mancha grande e plana. Isso pode ser causado pela separação de fases antes da impressão, relacionada a diferenças na viscosidade, volatilidade da hidrofilicidade ou tensão superficial dos monômeros, e sugere que a combinação de monômeros não é compatível com este formato. O mapeamento químico adicional de manchas de polímero também é uma etapa de controle de qualidade importante e às vezes necessária para determinar a distribuição dos materiais químicos entre as manchas e a caracterização da superfície de alto rendimento da matriz ou HTSC dos microarrays gerados.

O uso dessa técnica também permite correlacionar o desempenho biológico com as propriedades físico-químicas. Isso permite o estudo da interação do material biológico. O HTSC faz uso de medições de ângulo de contato com a água, tempo de voo, espectrometria de massa de íons secundários, microscopia de força atômica e espectroscopia de elétrons fotográficos de raios-x.

Em particular, os simuladores TOF fornecem uma análise quimicamente rica da amostra que pode ser usada para correlacionar a resposta celular com uma porção molecular. Em alguns casos, o desempenho biológico pode ser previsto. Os espectros TOF SIM demonstrando a dependência química de uma interação de material biológico e informando o desenvolvimento de materiais HI.

Uma vez caracterizada a superfície do microarranjo polimérico, ela pode ser usada para o estudo de interações biológicas. Aqui demonstramos o uso do microarray na realização de um ensaio de fixação bacteriana. Comece inoculando 10 mililitros de LB com uma única colônia de pseudomonas marcadas com GFP.

O aerogênio cresce a 37 graus Celsius com 200 RPM tremendo durante a noite. Meça o OD 600 da cultura bacteriana durante a noite e dilua a cultura para um OD 600 de 0,01 em 15 mililitros de RPMI 1640. Enquanto isso, lave as lâminas da matriz e esterilize a água destilada por 10 minutos para remover quaisquer componentes solúveis das matrizes, como monômero não polimerizado, todos os ligamentos e solvente.

Em seguida, seque as lâminas ao ar em um gabinete de fluxo de ar. Em seguida, coloque as lâminas lavadas em uma placa de Petri limpa e esterilize-as por UV por 10 minutos. Quando a cultura bacteriana estiver pronta, transfira a lâmina com a matriz para uma placa de Petri e adicione 15 mililitros do meio inoculado RPMI 1640.

Coloque outra lâmina de matriz em uma segunda placa de Petri e adicione 15 mililitros de RPMI 1640 estéril como controle. Incube os pratos a 37 graus Celsius por 72 horas com agitação a 60 RPM após a incubação. Lave as lâminas três vezes com 15 mililitros de PBS estéril por cinco minutos a 100 RPM.

Em seguida, lave as lâminas duas vezes com 15 mililitros de água destilada estéril para remover o sal de fosfato. Após a lavagem. Deixe as lâminas secarem ao ar em um gabinete de fluxo de ar.

Assim que as lâminas estiverem secas. Eles devem ser lidos por um scanner fluorescente o mais rápido possível para evitar a deterioração da GFP usando a tecnologia e o software de imagem apropriados. A fluorescência devido à fixação bacteriana é calculada subtraindo a fluorescência do controle apenas do meio da amostra inoculada para identificar materiais que resistem à adesão bacteriana.

Microarrays foram gerados e ensaios de adesão bacteriana foram realizados de acordo com os métodos descritos neste vídeo. Como visto aqui, o microarray de polímero contém materiais com baixa adesão bacteriana, que possuem baixa fluorescência e alta adesão bacteriana, que possuem alta fluorescência. As três matrizes mostradas aqui são replicadas quando os valores de fluorescência das três réplicas são calculados e apresentados como uma representação 3D.

Como mostrado aqui, a interpretação visual quantitativa é simplificada. A escala de intensidade à direita representa os valores dos dados de fluorescência. Em um nível básico, identificar os materiais com baixa fluorescência fornece um meio de identificar rapidamente materiais que atendem a uma aplicação biológica específica, como resistir à fixação bacteriana.

No entanto, esses resultados também podem ser combinados com o HTSC para investigar correlações entre propriedades particulares dos materiais com seu desempenho biológico. Essa análise pode elucidar a estrutura, as relações de função, identificando assim os mecanismos subjacentes à interação biológica com os materiais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como se preparar e imprimir um microarray de polímero e também ter uma visão de como os microarrays de polímero podem ser usados para sondar a resposta bacteriana aos materiais.

Uma vez dominado, um micro array de polímero pode ser impresso em dois dias, se executado corretamente. A preparação dos monômeros leva aproximadamente um dia e a impressão da matriz leva aproximadamente seis horas. O ensaio de fixação bacteriana leva cinco dias, o que aumenta o tempo para aumentar a cultura de sobreposição como um inóculo Ao incubar a luz de microraios na cultura bacteriana por 72 horas e detectar a floresta e o sinal usando o scanner de microraios, Ok, ao tentar este procedimento, é importante manter o pino e os porta-pinos limpos.

É muito frustrante se, no meio de uma corrida, o pino ficar preso na posição vertical e não puder mais fazer contato com a superfície, porque o pino ou o suporte do pino não foi suficientemente limpo. Não se esqueça de que trabalhar com DMF e monômeros tóxicos pode ser extremamente perigoso e precauções como a extração devem sempre ser incluídas no procedimento.