由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本实验的总体目标是通过四倍体胚胎互补法，利用诱导性多能干细胞（iPSCs）产生成年小鼠。首先，使用携带OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc的慢病毒，将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPSCs，并在培养基中添加丙戊酸（VPA）进行补充。

获得诱导多能细胞（IPCs）后，需通过免疫染色、染色体计数及胚胎体形成实验对其进行表征。下一步是通过细胞融合及体外培养制备受体四倍体囊胚辅助结构。随后，将诱导多能干细胞（IPSC）注射至四倍体囊胚辅助结构中，并将完成互补的囊胚辅助结构移植至受体雌性动物体内进行妊娠。

在最后一步中，通过剖宫产将足月动物取出并交给代孕母体，以便监测其出生后的发育情况。最终确定是否成功产生了可存活的足月动物。

该检测用iPSC细胞系被认为具有完全多能性。与其它生成iPSC的方法相比，本技术的主要优势在于能够可重复地产生完全多能性的iPS细胞系。通过这些方法获得的iPS细胞系可能对希望比较其iPS细胞多能性水平，或验证其他重编程方法等效性的研究人员具有参考价值。这些方法对于希望为特定下游应用（如体外分化检测）生成完全多能性iPS细胞系的研究人员也将具有实用意义。

进一步生成所有诱导性多能干细胞（iPSC）小鼠。利用四倍体胚胎互补法可能是一种有效手段，用于评估不同细胞系的遗传和表观遗传稳定性。四倍体胚胎互补过程中所涉及的显微操作在技术上具有较高挑战性。

掌握iPSC技术可能需要数月时间，因为该技术所需的培养条件与传统ES细胞基因靶向实验所用的条件相似。在用慢病毒感染HEK 293T细胞24小时后，移除生长培养基，并更换为25毫升新鲜预温的培养基。

转染后48小时，从转染了慢病毒的HEK293T细胞中收集含有慢病毒颗粒的生长培养基，将培养基放回培养箱中24小时。通过在4°C下以3000 × g离心五分钟，去除含病毒培养基中的颗粒状碎片。接下来，在4°C下通过20%蔗糖垫以112,000 × g超速离心两小时，浓缩病毒。

小心地将上清液倒入废物容器中进行去污处理，注意不要扰动病毒沉淀。用 0.4 毫升小鼠胚胎成纤维细胞培养基重悬病毒沉淀，并密封试管。然后在 4°C 下轻轻摇动 15 至 30 分钟。

将病毒颗粒和单次使用分装样品储存在负80摄氏度。IPSC细胞系源自小鼠胚胎成纤维细胞或meth细胞。当IPSC集落具有明亮、折光性强且边界清晰的特征，并含有30至50个细胞时，即可进行人工挑选，并作为独立的IPSC细胞系扩增培养。

用移液枪枪头挑取单克隆，将每个克隆直接转移至含有 20 µL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 的 U 型底 96 孔板的单个孔中，在 37 °C 下孵育约 8 分钟，或直至克隆解离为单细胞。通过光学显微镜监测解离过程的进展。可能需要轻柔振荡。

将解离的细胞悬液转移至含有饲养层及150微升添加了多西环素和VPA的ESC培养基的96孔板中。当每个孔中重新出现iPSC克隆时，按照标准的ESC建系和细胞培养操作，将其传代至更大的培养孔中进行分析和细胞保种，以开始四倍体囊胚互补实验。从雌性小鼠收集的单细胞胚胎在KSOM培养基中于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜，发育为二细胞胚胎。次日，将BTX微型载玻片放入10厘米的培养皿中。

加入足量的室温电融合介质，使载玻片完全浸没于溶液中，但避免液体过多导致电极的电极头完全浸没。打开 BTX 电融合仪 ECM 2001 和 BTX 增强器 400。将 ECM 的电缆连接至微载玻片的电极上，并将电缆固定在培养皿侧壁，以防止载玻片发生意外移动。

运行一次手动脉冲，以获取 BTX 增强器的读数，并记录所施加直流电流的电压。交流电流将控制胚胎在电极之间排列的速度，直流电流将促使囊胚融合，而脉冲时间将设定直流脉冲的持续时长。

一个良好的起始条件是交流电三伏，直流电100伏，持续时间为0.05毫秒。最佳直流电压范围在90至150伏之间。使用口吸移液管。

从 KSOM 培养液中取出 30 至 42 个细胞的胚胎，转移至电融合液滴中。通过数滴电融合培养基进行洗涤。接着，用口吸管从微型载玻片皿中吸取新鲜的电融合培养基。

取洗涤后的胚胎，将其置于显微载片上两个电极之间的一毫米间隙中。注意使胚胎位于间隙中央并彼此不接触。通过按下手动启动按钮施加交流电流。

胚胎将在交流电场中旋转，直至胚泡接触面与电极平行。如果数秒内胚胎仍未对齐，请调高交流电设置。胚胎对齐后，再次按下手动启动按钮，以在移液管中含有电融合介质的情况下施加直流脉冲。

从微载玻片上收集胚胎，用数滴 KSOM 培养基洗涤胚胎，然后将胚胎置于 KSOM 培养基中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下、矿物油下进行培养。细胞融合操作应在 30 分钟内完成。在培养过程中，监测并筛选出卵裂球成功融合的胚胎。

融合后的胚胎在培养30分钟后应呈现单细胞阶段，弃去已裂解及处于双细胞阶段的胚胎。将融合后的胚胎继续在矿物油覆盖下的KSOM微滴中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。为准备囊胚注射用诱导多能干细胞（IPCs），需解冻先前冻存的IPCs，并将其接种于饲养层细胞上，使用胚胎干细胞（ESC）培养基进行培养。在用于注射前，至少应在饲养层细胞上传代一次。

一个六孔板中的单孔，含有70%至80%融合度的IPCs，可提供足够数量的细胞用于注射。吸去培养基，用三毫升不含钙和镁的PBS洗涤细胞，加入0.5毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37摄氏度孵育10分钟，期间偶尔轻摇。加入3.0毫升ESC培养基，反复吹打以获得单细胞悬液。通过光学显微镜观察细胞，确保形成单细胞悬液，细胞团或细胞聚集体将堵塞注射移液管。一旦获得单细胞悬液，向孔中加入1毫升ESC培养基，并将培养板放回37摄氏度培养箱中继续孵育。

孵育约15分钟，或直至大部分饲养细胞开始贴壁，轻轻移除含有诱导性前体细胞（IPCs）的培养基，注意不要扰动每周贴壁的饲养细胞。将IPCs放入含有5毫升ESC培养基的15毫升锥形管中，在200 ×g下离心5分钟。

用移液器吸除上清液，并用微量移液器彻底移除残留的 ESC 培养基。轻敲离心管使沉淀松动，然后在 0.2 至 0.5 毫升预冷的 FHM 培养基中轻柔重悬细胞。将细胞置于冰上保存，直至并持续在向四倍体囊胚注射期间保持低温。有关囊胚注射的实验方案，请参阅本文所附的手稿以及此前发表的一篇 strove 文章，其节选内容正在屏幕上显示。

这些图像展示了在重编程实验过程中，成纤维细胞向诱导性多能干细胞（IPSC）集落形态演变的示例。在加入多西环素和VPA后四到五天开始，应观察到形态上的异质性以及部分重编程的IPSC集落形成，如图B至EESC所示。类似IPSC的集落应在七到十天内出现，如图F所示。通过二倍体二细胞胚胎的电融合来制备单细胞四倍体胚胎具有很高的效率。

通常可观察到高达95%的经处理的二细胞胚胎成功融合，形成四倍体单细胞胚胎。本实验中将iPSC注射入四倍体囊胚所采用的方案，与将ES细胞注射入二倍体囊胚以制备嵌合小鼠的方案类似。为便于排除二倍体嵌合体的产生，尽可能仔细选择用于生成iPSC和四倍体胚胎的小鼠品系的毛色特征。在本例中，四倍体胚胎来源于白化品系，而iPSC则来源于有色品系。

因此，新生的iPSC小鼠表现出有色素的眼睛，并在成年后具有均匀的毛色，而二倍体克隆小鼠则会表现出白化与有色毛发相混合的表型。出生的活仔数量取决于细胞系，如本表所示。对于一条平均质量较好的iPSC细胞系，实验人员可预期每注射的囊胚中有1%至10%能够产生活的新生仔鼠。

观看本视频后，您应能充分理解如何获得完全多能性的诱导多能干细胞（iPSC），以及如何验证其发育潜能。通过掌握四倍体补偿实验技术，从胚胎干细胞（MES）的获得到成功培育出iPSC小鼠，整个过程可在两到三个月内完成。诱导多能干细胞（iPSC）的建立与维持需要高水平的细胞培养技术。

具备ESL文化方面的先前经验至关重要。切勿忘记，操作慢病毒时需格外小心，尤其是浓缩的慢病毒可能具有极高危险性。操作时应始终穿戴所在机构要求的个人防护装备，并确保所有接触过病毒的物品均用10%漂白剂处理至少20分钟，具体操作请遵循本规程。

所有iPSC小鼠及其组织均可用于分析生理、病理和行为表型。