Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Methicillin-resistente (MRSA) und Methicillin-empfindliche (MSSA) Stämme von Staphylococcus aureus mithilfe besonders ausgewählter anti-modifizierter lytischer Bakteriophagen zu unterscheiden. Wenn Bakterien an den langen, flexiblen Schwänzen des lytischen Phagen haften, ist der Abstand zwischen den gebundenen Zellen und der Sensorschicht größer als die Eindringtiefe der akustischen Welle des QC-Sensors. Daher wird das Signal des Bindungsereignisses nicht erzeugt.

Der Ersatz der intakten Phagen durch Sphäroide führt zu voll funktionsfähigen Phagen mit kurzen Schwänzen, die die Bakterien innerhalb der Eindringtiefe der akustischen Welle des QCM binden. Daher tragen sie zu Frequenz- und Dämpfungsänderungen bei, wenn Phagensteroide auf einen QCM-D-Kristall aufgebracht und einer gemischten Bakteriensuspension ausgesetzt werden. Sie binden sowohl MRSA- als auch MSSA-Stämme von Staphylococcus aureus, jedoch nicht andere Bakterien, wodurch Staphylococcus aureus von anderen Bakterien auf der Kristalloberfläche getrennt wird. Schließlich wird, wenn Mr.RSA-spezifische PPP2A-Antikörper-gebundene Kügelchen hinzugefügt werden, ein Signal in Gegenwart von Mr.RSA-Stämmen von Staphylococcus aureus erzeugt. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie PCR sind, dass diese Methode keine DNA-Extraktion erfordert und nicht anfällig für Störstoffe ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung und Desinfektion von Staphylococcus orus ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere antibiotikaresistente Bakterien anwenden. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung von Biosensoren Präzision, Genauigkeit und Geduld erfordert. Beginnen Sie damit, goldbeschichtete Quarzstücke zu reinigen, indem Sie sie 10 Minuten lang im Argon-Plasma ätzen, und sterilisieren Sie die Stücke anschließend sechs Stunden lang unter UV-Licht in einem sterilen Schrank. Danach geben Sie 50 µL Phagensuspension auf die Goldoberfläche jedes Stücks in einer sterilen Petrischale und inkubieren die Stücke über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Am nächsten Morgen entfernen Sie die verbliebene Phagensuspension zur Titrierung und waschen jedes Quarzstück mit gebundenem Phagen danach fünfmal mit PBS, um nicht gebundenen Phagen zu entfernen.

Um die Immobilisierung der Phageninfektiosität auf einer trockenen Oberfläche zu testen, zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus auf einem NZY eRate ausplattieren und die Suspension trocknen lassen. Anschließend ein mit Phagen beschichtetes, goldbeschichtetes Quarzstück mit der immobilisierten Seite nach unten auf die Platte legen. Nach 12 Stunden bei 37 Grad Celsius kann eine Lysezone zur Bestimmung der lytischen Aktivität freier Phagen in Flüssigkeit beobachtet werden.

Zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus zu 10 Milliliter NZY in jedes der vier 300-Milliliter-Seitenarmkolben hinzufügen. Anschließend zwei Mal 10 hoch 6 PFU pro Milliliter freie Phagen zu zwei der Kolben geben. Danach den zeitlichen Verlauf der Staphylococcus-Zelllyse über 570 Minuten durch optische Dichtemessung in 30-Minuten-Abständen für jeden Kolben verfolgen, wobei eine abschließende Messung nach 24 Stunden erfolgt.

Um die lytische Aktivität gebundener Phagen in Flüssigkeit zu testen, wiederholen Sie die gerade demonstrierten Schritte, fügen jedoch anstelle von freien Phagen Goldstücke mit gebundenen Phagen den experimentellen Kolben hinzu. Zur Herstellung von Phagen-Steroiden mischen Sie zunächst 400 Mikroliter der Stammlösung Phage 1 2600 mit einem gleichen Volumen chloroformfreiem Spektralphotometrie-Reinheitsgrad in einem Ein-Milliliter-Gefäß bei Raumtemperatur. Anschließend vortexten Sie die Phagen-Chloroform-Suspension vorsichtig fünf- bis sechsmal im Abstand von jeweils fünf Sekunden über einen Zeitraum von einer Minute.

Nachdem man der Suspension 30 Sekunden zur Stabilisierung zugelassen hat, sammelt man die obere Fraktion, die die Steroid-Suspension enthält. Überträgt einige Mikroliter der Steroid-Suspension in ein 500-Mikroliter-Gefäß zur Übertragungs- und Rasterelektronenmikroskopie. Bewahrt die verbleibende Steroid-Suspension in einem Ein-Milliliter-Gefäß zur Herstellung von Biosensoren auf.

Zur Vorbereitung des Biosensors reinigen Sie zunächst die QCMD-Sensoren durch Plasmareinigung in Argon für 10 Minuten in einem Plasma-Reinigungsgerät. Anschließend spülen Sie die Sensoren mit Hexan, um organische Verunreinigungen zu entfernen. Danach reinigen Sie eine Wanne der Schichtwaage wie zuvor von Olson et al. im Journal of Microbiological Methods beschrieben.

Indem man eine LB-Trogphase mit einer Unterschichtlösung füllt und sie mit einer Trogbarriere reinigt. Anschließend den Trog 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius stabilisieren. Erzeugen Sie nun eine Phagen-Monoschicht auf der LB-Unterschichtlösung, indem Sie vorsichtig 300 Mikroliter einer wässrigen Suspension des Phagen 1 2600 mittels eines geneigten, teilweise in die SOPH-Phase eingetauchten essbaren Glasstabs zutropfen. Nach einer Stabilisierungszeit der Monoschicht von 10 Minuten komprimieren Sie die Monoschicht mit einer Geschwindigkeit von 30 Millimetern pro Minute, bis ein konstanter Druck von 19 Newton pro Meter erreicht ist.

Die vertikale Filmaufbringung ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Um den Erfolg sicherzustellen, muss sichergestellt werden, dass alle Komponenten dieses Verfahrens sauber sind, und die Parameter für die Monolagenaufbringung sollten optimiert werden. Tauchen Sie den Sensor nun siebenmal nacheinander mit einer Geschwindigkeit von 4,5 Millimetern pro Minute in die Monolage ein und wieder heraus, um eine vertikale Filmaufbringung durchzuführen.

Auf den senkrecht positionierten QCMD-Sensor. Die vertikale Filmaufbringung bindet den intakten Phagen an die Biosensoroberfläche. Schließlich verwenden Sie hergestellte Phagen-Biosensoren zur MRSA-Detektion, Elektronenmikroskopie und zur Optometrie sowohl der freien als auch der gebundenen Phagen.

Beginnen Sie diesen Schritt mit der Ermittlung der Basiswerte, der Resonanzfrequenz und der Energie-Dissipation des QCM-Sensors in Wasser mithilfe der qof-T-Software. Ziehen Sie nach etwa 30 Minuten eine Suspension lebender Methicillin-empfindlicher Staphylococcus-aureus- oder MSSA-Bakterienzellen in Wasser durch die Testzelle. Die blaue Linie zeigt den Frequenzwert, während die rote Linie das Ausmaß der Energie-Dissipation veranschaulicht.

Die horizontalen Linien zeigen die Etablierung der Basislinie. Die Zahl zwei in der Mitte des Bildschirms weist darauf hin, dass die Ereignisse mit dem Sensor in Verbindung stehen. Zahl zwei von vier überwacht kontinuierlich die Änderungen der Resonanzfrequenz und der Energie-Dissipation der Sensoren für die erste Oberschwingung, die dargestellt ist.

Hier sind die Veränderungen, nachdem die Bakterien die Testzelle passiert haben. Beachten Sie, dass es nur wenige Sekunden dauert, bis die Frequenz abnimmt und die Energiedissipation ansteigt, wenn die Änderungen in der Resonanzfrequenz des Sensors und der inneren Energiedissipation Sättigungslevel erreichen, sobald die Aufschlämmung aus PVP-Antikörper-konjugiertem Latex in den Durchfluss gegeben wird, und die kontinuierliche Überwachung von Frequenz und Dissipation fortgesetzt wird. Dargestellt ist hier der gesamte Nachweisprozess, der die Etablierung der Grundlinie, die kurzzeitige Änderung von Frequenz und Energiedissipation nach Zugabe der Bakterien, die Sättigung und schließlich die Veränderungen nach Zugabe der Kügelchen zeigt.

Diese Tabelle zeigt die nachgewiesene phagolytische Aktivität gegenüber allen getesteten Stämmen von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämmen, wie durch den Phagen-Plaque-Test angezeigt. Die Plaque-Größen lagen im Allgemeinen zwischen fünf und 15 Millimetern. Gegenüber anderen Testkulturen wurde keine Aktivität festgestellt.

Hier wird das normale Wachstum von Staphylococcus Urus A TCC 1 2600 im NZ Y-Medium in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius gezeigt, wobei die Anzahl der Bakterien von 3,2 × 10⁶ auf 4,0 × 10⁸ KBE pro Milliliter ansteigt. Innerhalb von etwa 24 Stunden zeigte die an einer Goldoberfläche immobilisierte Phage eine vergleichbare lytische Aktivität wie die Phage in Suspension. Die immobilisierte Phage blieb auch nach Einsatz in einem 24-stündigen Wachstumsversuch, mehrfachen Waschschritten und Lagerung in PBS für sechs Tage bei 4 Grad Celsius infektiös gegenüber einer frischen Bakterieninfektion.

In diesem Bild ist das Lysosom um das Goldstück herum zu erkennen, was darauf hinweist, dass die immobilisierten Phagen in der Lage sind, bakterielle Zellen zu lysieren. Daher ist die hier veranschaulichte wirksame Verringerung des bakteriellen Wachstums, die bei der Kokultur von Bakterien und demobilisierten Phagen beobachtet wird, auf die primäre Wechselwirkung zwischen in Wasser suspendierten Bakterien und gebundenen Phagen zurückzuführen. Hier werden Transmissions- und Rasterelektronenmikrographien des intakten lytischen Phagen 1 2600 auf einer Goldsubstratoberfläche gezeigt; wenn die Phagensuspension einer Chloroformbehandlung unterzogen wird, verkürzt sich der Schwanz des Phagen und wird dicker, und der polygonale Kopf wird rundlich oder steroid.

Trotz der signifikanten strukturellen Veränderungen änderte sich die lytische Aktivität des Steroids, gemessen anhand der Plaque-Anzahl, nicht infolge der Behandlung mit Chloroform. QCM-Sensoren mit immobilisierten lytischen Phagen zeigten keine signifikanten Änderungen in der Resonanzfrequenz oder Energie-Dissipation, wenn sie MRSA ausgesetzt wurden, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen Phagen und MRSA zu keiner Massenänderung führte.

Die Elektronenmikroskopie-Aufnahmen von Biosensoren nach dem Assay zeigten gemäß der QCM jedoch eine signifikante Bindung von Bakterien an der Sensorschicht. Bei Injektion von MRSA-Suspensionen in die Durchflusszelle mit phagenbasierten Steroid-Biosensoren wurde ein deutlicher Frequenzabfall und eine Zunahme der Dissipation beobachtet. Nach den Bindungsinteraktionen zwischen Phagen, sphärischen Bakterien und MRSA wurden die Assaysensoren einer Suspension aus BBP two A Antikörper-gebundenen Latexpartikeln ausgesetzt.

Diese MRSA-Assay-Biosensoren reagierten auf die mit dem BPP zwei A-Antikörper konjugierten Latex-Schnell-Suspensionen, wobei eine weitere Abnahme der Frequenz und eine Zunahme der Dissipation beobachtet wurden. Die Bindung der MSA an Phagen-Sonden und an PPP zwei A-Antikörper konjugierte Latex-Schnellpräparate wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie bestätigt. Wenn der Phagen-Steroid-Biosensor MSSA ausgesetzt wurde, zeigte sich eine deutliche Abnahme der Frequenz und eine Zunahme der Dissipation infolge der Bindungswechselwirkungen zwischen Phagen-Steroid und MSSA; anschließend wurden die Assay-Sensoren mit PPP zwei A-Antikörper konjugierten Latex-Schnell-Suspensionen herausgefordert.

Anfangs zeigte der MSSA-Assay-Biosensor eine kurze vorübergehende Zunahme der Frequenz und Abnahme der Dissipation nach einigen Minuten der Wechselwirkung zwischen MSSA und PPP zwei A Antikörper-gebundenen Latexkügelchen. Allerdings kehrte die Frequenz auf das Niveau nach der Zugabe des PVP zwei A Antikörpers zurück, während die Dissipationsenergie anstieg. Die Bindung von MSSA an Phagenproben wurde anschließend mittels Rasterelektronenmikroskopie analysiert, wobei jedoch keine Bindung zwischen MSSA und PPP zwei A Antikörper-gebundenen Latexkügelchen beobachtet wurde. Ein ellipsensymmetrisches Dickenprofil und eine 3D-Dickenkarte des lytischen Phagen sind dargestellt.

Ein Strich wurde über die Dickenkarte gezogen, um das Dickenprofil zu erzeugen. Diese letzten Bilder zeigen repräsentative CCD-Kameraoptikaufnahmen von MRSA, die von Phagen gebunden an der Goldoberfläche des A-Q-C-M-D-Sensors erfasst wurden, sowie 3D-Intensitätsprofile von MRSA auf Phagen- immobilisierten Glasuntergründen bei einer Konzentration von 10 hoch 8 KBE pro Milliliter und 10 hoch 9 KBE pro Milliliter. Jeder runde Kreis repräsentiert ein einzelnes Bakterium.

Es ist deutlich, dass die Erhöhung der Bakterienkonzentration in der flüssigen Suspension von 10⁸ KBE pro Milliliter auf 10⁹ KBE pro Milliliter zu einem signifikanten Anstieg der erfassten Bakterien in den 3D-Intensitätsprofilen führt. Die Anzahl der weißen Peaks in der oberen Schicht ist proportional zur Anzahl der erfassten Bakterien, und wie erwartet steigt die Dichte der Peaks deutlich an, wenn die bakterielle Exposition von 10⁸ auf 10⁹ KBE pro Milliliter erhöht wird. Die untere dunkelblaue Schicht entspricht der Phagenschicht, die mit einem Goldsubstrat in Kontakt steht.

Wenn mehr Bakterien gebunden werden, verändern sich die optischen Eigenschaften der Phagen durch die Bindung an die Bakterien, was zu einer dunkleren und intensiveren blauen Färbung führt. Mit dieser Methode kann die Effizienz der Bakterienbindung bestimmt werden, um die Wechselwirkungen zwischen Phagen und Bakterien nach der Entwicklung zu verstehen. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Bakteriophagentherapie neue Wege, um die Hemmung von Pathogenen bei Tieren und Menschen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln und pathogenen Bakterien äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie daher die strikte Einhaltung der Sicherheitsvorschriften.