Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Versuchs ist die Unterscheidung von Methicillin-resistenten oder MRSA- und Methicillin-sensitiven oder MSSA-Stämmen von Staphylococcus aureus durch speziell ausgewählte anti-modifizierte lytische Bakterienphagen. Wenn Bakterien an den langen, flexiblen Schwänzen des lytischen Phagen haften, ist der Abstand zwischen den anhaftenden Zellen und der Sensoroberfläche größer als die Durchdringung der akustischen Welle des QC m. Daher wird das Signal des Bindungsereignisses nicht generiert.

Das Ersetzen des intakten Phagen durch einen Sphäroid führt zu voll funktionsfähigen Phagen mit kurzen Schwänzen, die die Bakterien innerhalb der Eindringtiefe der akustischen Welle des QC m binden und somit zu den Frequenz- und Dissipationsänderungen beitragen, wenn Phagensteroide auf A-Q-C-M-D-Kristall abgelagert und der gemischten Bakteriensuspension ausgesetzt werden, sie binden sowohl die MRSA- als auch die MSSA-Stämme von Staphylococcus aureus, aber nicht andere Bakterien, die den Staphylococcus aureus von den anderen Bakterien auf der Kristalloberfläche trennen. Wenn schließlich Mr.RSA-spezifisches PPP zwei A-Antikörper-gebundene Kügelchen hinzugefügt werden, wird ein Signal in Gegenwart von Mr.RSA-Stämmen von Staphylococcus aureus erzeugt. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der PCR bestehen darin, dass diese Methode keine DNA-Extraktion erfordert und nicht empfindlich auf Empirischkeit reagiert.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Screening und die Desinfektion von Staphylococcus orus geben kann, kann sie auch auf andere antibiotikaresistente Bakterien angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Herstellung von Biosensoren Präzision, Genauigkeit und Geduld erfordert. Beginnen Sie mit der Reinigung von goldcodierten Quarzstücken durch Plasmaätzen in Argonnen für 10 Minuten und sterilisieren Sie die Stücke dann sechs Stunden lang unter UV-Licht in einem sterilen Schrank, nachdem Sie bei 50 Mikrolitern Phagensuspension auf die Goldoberfläche jedes Stücks in einer sterilen Petrischale sterilisiert wurden, und inkubieren Sie die Stücke dann am nächsten Morgen über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die restliche Phagensuspension zum Tickeln und waschen Sie dann jedes Quarzstück mit gebundenen Phagen fünfmal mit PBS, um ungebundene Phagen zu entfernen.

Um die Imfektiosität von immobilisierten Phagen auf einer trockenen Oberfläche zu testen, verteilen Sie zunächst eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus auf ein NZY eRate und lassen Sie die Suspension trocknen. Legen Sie dann ein goldbeschichtetes Quarzstück mit dem immobilisierten Phagen mit der Vorderseite nach unten auf die Platte. Nach 12 Stunden bei 37 Grad Celsius kann eine Lysezone beobachtet werden, die auf eine Infektiosität hinweist, um die lytische Aktivität von freien Phagen in Flüssigkeit zu testen.

Zuerst wird über Nacht eine Bakterienkultur von Staphylococcus aureus zu 10 Millilitern NZY in jedem der vier 300-Milliliter-Seitenarmkolben gegeben. Geben Sie dann zweimal 10 zu den sechs PFU pro Milliliter freiem Phagen in zwei der Kolben. Überwachen Sie nun den zeitlichen Verlauf der Staphylokokken-Zelllyse für 570 Minuten durch optische Dichtemessung in 30-Minuten-Intervallen für jeden Kolben, der eine abschließende Messung nach 24 Stunden durchführt.

Um die lytische Aktivität von gebundenen Phagen in Flüssigkeit zu testen, wiederholen Sie die eben gezeigten Schritte, fügen Sie jedoch Goldstücke mit gebundenen Phagen anstelle von freien Phagen in die Versuchskolben hinzu. Zur Herstellung von Phagensteroiden kombinieren Sie zunächst 400 Mikroliter Stamm-Phagen-1-2600-Suspension mit einem gleichen Volumen an Spektren photometrischem Chloroform in einem Ein-Milliliter-Fläschchen bei Raumtemperatur. Als nächstes wird die Phagen-Chloroform-Suspension fünf- bis sechsmal in Intervallen von fünf Sekunden über eine Dauer von einer Minute vorsichtig vortext.

Nachdem Sie die Suspension 30 Sekunden lang stabilisieren gelassen haben, sammeln Sie die obere Fraktion mit der Steroidsuspension. Übertragen Sie einige Mikroliter der Steroidsuspension in ein 500-Mikroliter-Fläschchen für die Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie. Bewahren Sie die restliche Steroidsuspension in einem Ein-Milliliter-Fläschchen für die Herstellung von Biosensoren auf.

Um den Biosensor vorzubereiten, reinigen Sie die QCMD-Sensoren zuerst, indem Sie sie 10 Minuten lang in einem Plasmareiniger in Argon ätzen. Spülen Sie dann die Sensoren mit Hexan, um organische Verunreinigungen zu entfernen. Reinigen Sie anschließend eine Wanne der Filmwaage, wie zuvor von Olson Etal im Journal of Microbiological methods beschrieben.

Indem man einen LB-Trog mit einer Unterphasenlösung füllt und ihn mit einer Trogsperre reinigt. Stabilisieren Sie dann die Wanne 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Erstellen Sie nun eine Phagen-Monoschicht auf der LB-Unterphasenlösung, indem Sie vorsichtig eine 300 Mikroliter Eloqua von Phagen 1 2600 wässrige Suspension auf einen geneigten essbaren Glasstab tropfen, der teilweise in die SOPH-Phase eingetaucht ist. Nachdem Sie die Monoschicht 10 Minuten lang stabilisieren ließen, komprimieren Sie die Monoschicht mit einer Geschwindigkeit von 30 Millimetern pro Minute, bis ein konstanter Druck von 19 Newton pro Meter erreicht ist.

Die vertikale Schichtabscheidung ist der kniffligste Teil dieses Verfahrens. Um den Erfolg zu gewährleisten, muss sichergestellt werden, dass alle Komponenten dieses Verfahrens sauber sind und auch die Abscheidungsparameter der Monoschicht optimiert werden sollten. Tauchen Sie nun den Sensor siebenmal hintereinander mit einer Geschwindigkeit von 4,5 Millimetern pro Minute in die Monoschicht ein und wieder heraus, um eine vertikale Folienabscheidung durchzuführen.

Auf den senkrecht positionierten QCMD-Sensor. Durch die vertikale Filmabscheidung wird der intakte Phagen an die Oberfläche des Biosensors gebunden. Schließlich werden hergestellte Phagen-Biosensoren für die MRSA-Detektion, die Elektronenmikroskopie und die Optometrie sowohl des freien als auch des gebundenen Phagen verwendet.

Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Basislinien, die Resonanzfrequenz und die Energiedissipation des QCM-Sensors in Wasser mit der qof T-Software ermitteln. Nach ca. 30 Minuten ziehen Sie eine Suspension von lebenden Methicillin-empfindlichen Staphylococcus aureus- oder MSSA-Bakterienzellen in Wasser durch die Testzelle. Die blaue Linie zeigt den Frequenzwert an, während die rote Linie den Grad der Energieverlustleistung anzeigt.

Die horizontalen Linien zeigen die Festlegung der Basislinie. Die Zahl zwei in der Mitte des Bildschirms zeigt an, dass Ereignisse mit dem Sensor zusammenhängen. Nummer zwei von vier überwachen kontinuierlich die Veränderungen der Resonanzfrequenz und der Verlustenergie der Sensoren für den ersten abgebildeten Oberton.

Hier sind die Veränderungen, nachdem Bakterien die Testzelle passiert haben. Beachten Sie, dass es nur wenige Sekunden dauert, bis die Frequenz abnimmt und die Energiedissipation zunimmt, wenn die Änderungen der Resonanzfrequenz und der inneren Energiedissipation des Sensors bei der Suspension von PVP-Antikörpern konjugierte Latexgeschwindigkeiten zur Strömung Sättigungswerte erreichen, und setzen Sie die kontinuierliche Überwachung der Frequenzdissipation fort. Hier ist der gesamte Detektionsprozess dargestellt, der die Etablierung von Basislinien, die Änderung der Frequenz und Energiedissipation in wenigen Sekunden nach der Zugabe von Bakterien, die Sättigung und schließlich die Veränderungen nach der Zugabe von Kügelchen zeigt.

Diese Tabelle zeigt die nachgewiesene lytische Aktivität von Phagen gegen alle getesteten Stämme von S reus, einschließlich MRSA-Stämme, wie durch den Phagen-Spot-Test angezeigt. Die Plaquegrößen reichten in der Regel von fünf bis 15 Millimetern. Es wurde keine Aktivität gegen andere Testkulturen gefunden.

Hier wird das normale Wachstum von Staphylokokken Urus A TCC 1 2600 in NZ Y Medium auf einem Schüttel-Inkubator bei 37 Grad Celsius demonstriert, wobei die Anzahl der Bakterien von 3,2 mal 10 auf sechs bis 4,0 mal 10 bis acht KBE pro Milliliter ansteigt. In etwa 24 Stunden zeigten Phagen, die auf einer Goldoberfläche immobilisiert waren, eine ähnliche lytische Aktivität wie die Aktivität der Phagen in Suspension. Der immobilisierte Phagen blieb bei einer frischen bakteriellen Infektion auch nach der Verwendung in einem 24-stündigen Wachstumsexperiment, mehreren Wäschen und sechstägiger Lagerung in PBS bei vier Grad Celsius infektiös.

In diesem Bild ist das Lysosom um das Goldstück herum zu sehen, was darauf hindeutet, dass die immobilisierten Phagen in der Lage sind, Bakterienzellen zu lysieren. Daher ist, wie hier dargestellt, die effektive Abnahme des Bakterienwachstums, die bei der Co-Kultur von Bakterien und demobilisierten Phagen gefunden wurde, ein Ergebnis der primären Interaktion von wassersuspendierten Bakterien und gebundenen Phagen. Hier sind Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen des intakten lytischen Phagen 1 2600 auf einer Goldsubstratoberfläche zu sehen: Wenn die Phagensuspension einer Chloroformbehandlung unterzogen wird, zieht sich der Schwanz des Phagen in der Länge zusammen und verdickt sich und der polygonale Kopf wird abgerundet oder steroidförmig

Trotz der deutlichen strukturellen Veränderungen. Die lytische Aktivität des Steroids, gemessen an der Plaquezahl, änderte sich infolge der Chloroform-Behandlung nicht. QCM-Sensoren mit immobilisierten lytischen Phagen zeigten keine signifikanten Veränderungen der Resonanzfrequenz oder Energiedissipation, wenn sie MRSA ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass die MRSA-Phagen-Interaktion zu einer nom-Massenänderung führte.

Nach Angaben des QCM zeigten die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Post-Assay-Biosensoren jedoch eine signifikante bakterielle Bindung an der Sensoroberfläche. Bei der Injektion von MRSA-Suspensionen in die Durchflusszelle mit Phagensteroid-Biosensoren wurde eine erhebliche Abnahme der Häufigkeit und eine Zunahme der Dissipation beobachtet. Nach Phagen-Sphäro-bakteriellen MRSA-Bindungsinteraktionen wurden die Assay-Sensoren mit BBP zwei A-Antikörpern konjugierten Latex-Speed-Suspensionen exponiert.

Diese MRSA-Assay-Biosensoren reagierten auf die BPP mit zwei A-Antikörpern, konjugierten Latex-Speed-Suspensionen, da eine weitere Abnahme der Frequenz und eine Zunahme der Dissipation beobachtet wurden. Die Bindung des MSA an Phagensonden und PPP zwei A-Antikörper-konjugierte Latexgeschwindigkeiten wurde mit Hilfe von rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen bestätigt. Als der Phagensteroid-Biosensor MSSA ausgesetzt wurde, wurde eine erhebliche Abnahme der Häufigkeit und eine Zunahme der Dissipation nach Phagensteroid-MSSA-Bindungsinteraktionen beobachtet, die Assay-Sensoren wurden mit PPP zwei A-Antikörper-konjugierten Latex-Speed-Suspensionen herausgefordert.

Anfänglich zeigte der MSSA-Assay-Biosensor eine kurze Vergänglichkeit von Frequenzzunahmen und Abnahmen der Dissipation nach einigen Minuten von MSSA- und PPP zwei A-Antikörper-konjugierten Latex-beschleunigten Interaktionen. Die Häufigkeit kehrte jedoch nach dem PVP auf zwei A-Antikörpereinführungsniveaus zurück, aber die Deci-Energie stieg an. Die Bindung von MSSA an Phagensonden wurde dann mittels Rasterelektronenmikroskopie analysiert, aber es wurde keine Bindung zwischen MSSA und PPP zwei A-Antikörper-konjugierte Latexgeschwindigkeiten beobachtet, ein symmetrisches Dickenprofil von Ellips und eine 3D-Dickenkarte von lytischen Phagen sind gezeigt.

Es wurde eine Linie quer durch die Dickenkarte gezeichnet, um das Dickenprofil zu generieren. Diese letzten Bilder zeigen repräsentative CCD-Bilder von optischen Kamerabildern von MRSA, die von Phagen aufgenommen wurden, die an die Goldoberfläche des A-Q-C-M-D-Sensors gebunden waren, sowie 3D-Intensitätsprofile von MRSA auf phagenimmobilisierten Glassubstraten bei einer Konzentration von 10 bis acht KBE pro Milliliter und 10 bis neun KBE pro Milliliter. Jeder runde Kreis steht für ein einzelnes Bakterium.

Es ist klar, dass die Erhöhung der Bakterienkonzentration in flüssiger Suspension von 10 auf acht KBE pro Milliliter auf 10 bis neun KBE pro Milliliter zu einem signifikanten Anstieg der gefangenen Bakterien in den 3D-Intensitätsprofilen führt. Die Anzahl der weißen Peaks auf der obersten Schicht ist proportional zur Anzahl der gefangenen Bakterien, und wie erwartet nimmt die Dichte der Peaks signifikant zu, wenn die Bakterienexposition von 10 auf acht auf 10 bis neun KBE pro Milliliter erhöht wird. Die untere dunkelblaue Schicht entspricht der Phagenschicht, die mit einem Goldsubstrat in Kontakt kommt.

Wenn mehr Bakterien gefangen werden, ändern sich die optischen Eigenschaften der Phagen, wenn sie Bakterien binden, was zu einer dunkleren, intensiveren blauen Farbe führt. Nach diesem Verfahren können wir die Effizienz des bakteriellen Einfangs definieren, um die Wechselwirkungen zwischen Phagenbakterien nach der Entwicklung zu verstehen. Diese Technik weist Forschern auf dem Gebiet der Bakterien-Phagen-Therapie den Weg, die Hemmung von Krankheitserregern bei Tieren und Menschen zu erforschen Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln in pathogenen Bakterien äußerst gefährlich sein kann und die Einhaltung der strengen Vorschriften sehr wichtig ist.