Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben
4. Februar 2014
Diese Studie beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung und Charakterisierung von primären Eierstockkrebszellen aus soliden klinischen Proben. Eierstockkrebs klinischen Proben werden enzymatische Verdauung unterzogen, um lebensfähig, Fibroblasten frei epithelialen Eierstockkrebs (EOC) Zellen sehr gut für Downstream-Anwendungen zu erhalten.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Eierstockkrebszellen aus soliden klinischen Proben zu isolieren und zu charakterisieren. Dazu wird zunächst die Probe des Eierstocktumors entnommen und in eine Petrischale gelegt. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe in Stücke zu schneiden und die Stücke zur Inkubation in ein konisches Röhrchen mit Aufschlussreagenzien zu überführen.
Als nächstes wird der Zellschlamm durch einen Filter geleitet, in dem nur die Zellen gesammelt werden. Für die Zentrifugation besteht der letzte Schritt darin, den Überstand zu verwerfen und die Zellen für die Inkubation über Nacht wieder in Medien zu suspendieren. Letztendlich wachsen die epithelialen Eierstockkrebszellen wochenlang in Kultur, was eine nachgelagerte Anwendung ermöglicht. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Eierstockkrebses zu beantworten, z. B. was die beste Behandlungsoption für jede einzelne Patientin ist.
Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Eierstockkrebs, da sie es uns ermöglicht, realistischere Zellkulturen zu verwenden, die sehr anfällig für genetische Manipulationen sind und für Drogenscreening-Tests nützlicher sind. Ergänzen Sie zunächst 500 Milliliter Delcos, modifizierte Eagles, Medium oder DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum oder FBS und 1 % Penicillin, Streptomycin oder ps. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius.
Entnehmen Sie die Probe aus dem OP und transportieren Sie sie auf Eis zum Labor, noch im transportierten Behälter. Legen Sie die Probe in eine biologische Sicherheitshaube. Übertragen Sie die Probe aus einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in eine 60 Millimeter x 60 Millimeter große Petrischale, die 10 Milliliter frisches, eiskaltes PBS enthält.
Schneiden Sie anschließend die Probe mit einer sterilen Rasierklinge weiter in zwei Millimeter oder kleinere Stücke. Behandeln Sie dann DMEM mit einer Disc-Paste-Tube in einer konischen 15-Liter-Tube. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in das DMEM dispa Zwei-Mischungs-Röhrchen.
Dann inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Rühren Sie die Zellaufschlämmung alle fünf Minuten manuell um, um eine optimale Verdauung zu gewährleisten. Nach der Inkubation wird die Zellaufschlämmung durch ein 70-Mikrometer-Maschensieb geleitet, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.
Üben Sie mit einem Spritzenkolben vorsichtig Druck auf das Netz aus, entsorgen Sie nicht zugeordnetes Gewebe, das auf dem Netz verbleibt, und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in dem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren. Die konische Röhre bei 320 mal G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.
Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM, die 10 % FBS und 1 % ps enthalten, resuspendiert. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in eine Petrischale und inkubieren Sie die Suspension bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der ersten Beschichtung, um die Zelltrümmer und die Mehrheit der in der Kultur vorhandenen Erythrozyten zu entfernen.
Wechseln Sie schließlich das Medium in den folgenden zwei Wochen alle drei Tage, danach sind die Kulturen der primären EOC-Zellen bereit für nachgeschaltete Anwendungen. Unmittelbar nach dem Plattieren. Die epithelialen Eierstockkrebszellen oder EOC-Zellen erscheinen als Einzelzellsuspensionen und in Klumpen mit Erythrozyten und Zelltrümmern im Überfluss.
Die EOC-Zellkultur drei Tage nach der Beschichtung zeigt semi-adhärente EOC-Zellcluster und eine geringere Erythrozytenkontamination. Eine Woche nach der ersten Beschichtung wird die EOC-Zellkultur zu einem wirbelartigen Cluster von Zellen, der sich auf dem Gewebekulturkunststoff ausbreitet. Die typische epitheliale Pflastersteinmorphologie ist in einer konfluenten Monoschicht von EOC-Zellen nach 14 Tagen Kultur zu sehen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Eierstockkrebszellen aus festen klinischen Proben isoliert und charakterisiert werden können.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung und Charakterisierung primärer Ovarialkarzinomzellen aus festen klinischen Proben. Das Verfahren ermöglicht das Wachstum von epithelialen Ovarialkarzinomzellen in der Kultur und erleichtert anschließende Anwendungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Onkologie
- Zellbiologie
- Klinische Forschung
Hintergrund
- Die Eierstockkrebs ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem mit komplexen Behandlungsoptionen.
- Die Isolierung lebensfähiger Krebszellen ist entscheidend für die personalisierte Medizin.
- Aktuelle Methoden liefern möglicherweise keine reinen epithelialen Eierstockkrebszellen.
- Diese Studie zielt darauf ab, den Isolationsprozess zu verbessern, um bessere Forschungsergebnisse zu erzielen.
Zweck der Studie
- Primäre Ovarialkrebszellen aus klinischen Proben zu isolieren.
- Die isolierten Zellen für weitere Anwendungen zu charakterisieren.
- Das Verständnis der Behandlungsoptionen für Patientinnen mit Ovarialkarzinom zu vertiefen.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Eierstocktumorproben.
- Enzymatische Verdauung der Gewebeproben.
- Filtration zur Isolierung lebensfähiger Zellen.
- Zentrifugation und Resuspension in Kulturmedium.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung epithelialer Ovarialkarzinomzellen ohne Fibroblasten.
- Die Zellen können über Wochen kultiviert werden, was umfassende Untersuchungen ermöglicht.
- Die Methode stellt eine zuverlässige Quelle an Krebszellen für die Forschung bereit.
- Das Verfahren bietet das Potenzial, personalisierte Behandlungsstrategien zu unterstützen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist wirksam zur Isolierung von Ovarialkarzinomzellen.
- Sie unterstützt weitere Forschungsarbeiten zu Behandlungen des Ovarialkarzinoms.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um die Behandlungsergebnisse für Patientinnen zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Exekutive Branchenrelevanz
Die Gewinnung primärer Ovarialkrebszellen aus festen klinischen Proben ermöglicht patientenrelevante Modelle, die die Abhängigkeit von durchgezüchteten Zelllinien mit angesammelten genetischen Artefakten verringern. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung, indem er die Tumorheterogenität und die standortspezifische Biologie primärer oder metastatischer Läsionen erhält. Die resultierenden Kulturen stellen eine nachwachsende Quelle für nachgeschaltete Screenings dar und verbessern die Vorhersagekraft bei präklinischen Entscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen unter Verwendung von Zellen, die das genetische und phänotypische Profil der ursprünglichen klinischen Probe widerspiegeln.
- Operationaler Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem Artefakte vermieden werden, die mit langzeitkultivierten Zelllinien assoziiert sind.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch biologisch entrisikte Zielvalidierung in einem krankheitsrelevanten System.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt epitheliale Ovarialkarzinomzellen, die für die Wirkstoffscreening geeignet sind und tumorigene Eigenschaften beibehalten.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare Zellsuspensionen nach enzymatischer Verdauung und Filtration.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung mehrerer primärer Kulturen aus verschiedenen Proben für parallele Assay-Tests.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Forschung, indem Zellen verwendet werden, die direkt aus Patientenproben gewonnen wurden.
- Biomarker-Ausrichtung: Ermöglicht die Bewertung von Zielstrukturen und Biomarkern in einem Kontext, der dem Tumor des Patienten entspricht.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage von Reaktionen in primären Zellen, die klinische Ergebnisse besser vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten ein und liefert primäre Zellen, die die Relevanz nachgeschalteter Screening- und Validierungsarbeiten erhöhen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen unter Verwendung von Zellen mit intakten, tumorspezifischen Eigenschaften.
- Screening: Bereitstellung von assaysbereiten primären epithelialen Ovarialkarzinomzellen mit quantifizierbarem Wachstum und Morphologie zur Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von Arzneimittelwirkung, Proliferation und phänotypischen Veränderungen in einem genetisch stabilen, niedrigpassagierten System.
- Translationale Forschung: Bewahrt die klinische Relevanz durch direkte Herleitung aus Proben und unterstützt die Validierung von Biomarkern und Zielstrukturen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Erzeugung primärer Kulturen aus unterschiedlichen Proben und verringert die Abhängigkeit von begrenzten Zelllinien.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Zellen verwendet werden, die die Heterogenität und Biologie des ursprünglichen Tumors widerspiegeln.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Schritte der enzymatischen Verdauung, Filtration und Kulturinitiierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem das Risiko spätzeitiger Fehlschläge durch eine bessere präklinische Zielvalidierung verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf der Aktivität in primären, patientenabgeleiteten Zellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im sterilen Umgang mit Gewebe, enzymatischer Verdauung und Techniken der Primärzellkultur.
- Hängt vom Zugang zu frischen oder sachgerecht konservierten Eierstocktumorproben ab, die unter sterilen Bedingungen gewonnen wurden.
- Benötigt Zentrifugations-, Filtrations- und Kulturgefäße, einschließlich Biosicherheitswerkbänke und CO2-Inkubatoren.
- Beinhaltet die Optimierung der Verdauerungszeit und mechanischen Dissoziation, um die Ausbeute an epithelialen Zellen zu maximieren und gleichzeitig eine Kontamination mit Fibroblasten zu minimieren.
- Ist durch die Verfügbarkeit und Vitalität der Proben begrenzt, die je nach Operationszeitpunkt und Transportbedingungen variieren kann.
