Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Eierstockkrebszellen aus soliden klinischen Proben zu isolieren und zu charakterisieren. Dazu wird zunächst die Probe des Eierstocktumors entnommen und in eine Petrischale gelegt. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe in Stücke zu schneiden und die Stücke zur Inkubation in ein konisches Röhrchen mit Aufschlussreagenzien zu überführen.

Als nächstes wird der Zellschlamm durch einen Filter geleitet, in dem nur die Zellen gesammelt werden. Für die Zentrifugation besteht der letzte Schritt darin, den Überstand zu verwerfen und die Zellen für die Inkubation über Nacht wieder in Medien zu suspendieren. Letztendlich wachsen die epithelialen Eierstockkrebszellen wochenlang in Kultur, was eine nachgelagerte Anwendung ermöglicht. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Eierstockkrebses zu beantworten, z. B. was die beste Behandlungsoption für jede einzelne Patientin ist.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Eierstockkrebs, da sie es uns ermöglicht, realistischere Zellkulturen zu verwenden, die sehr anfällig für genetische Manipulationen sind und für Drogenscreening-Tests nützlicher sind. Ergänzen Sie zunächst 500 Milliliter Delcos, modifizierte Eagles, Medium oder DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum oder FBS und 1 % Penicillin, Streptomycin oder ps. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius.

Entnehmen Sie die Probe aus dem OP und transportieren Sie sie auf Eis zum Labor, noch im transportierten Behälter. Legen Sie die Probe in eine biologische Sicherheitshaube. Übertragen Sie die Probe aus einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in eine 60 Millimeter x 60 Millimeter große Petrischale, die 10 Milliliter frisches, eiskaltes PBS enthält.

Schneiden Sie anschließend die Probe mit einer sterilen Rasierklinge weiter in zwei Millimeter oder kleinere Stücke. Behandeln Sie dann DMEM mit einer Disc-Paste-Tube in einer konischen 15-Liter-Tube. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in das DMEM dispa Zwei-Mischungs-Röhrchen.

Dann inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Rühren Sie die Zellaufschlämmung alle fünf Minuten manuell um, um eine optimale Verdauung zu gewährleisten. Nach der Inkubation wird die Zellaufschlämmung durch ein 70-Mikrometer-Maschensieb geleitet, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.

Üben Sie mit einem Spritzenkolben vorsichtig Druck auf das Netz aus, entsorgen Sie nicht zugeordnetes Gewebe, das auf dem Netz verbleibt, und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in dem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren. Die konische Röhre bei 320 mal G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.

Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM, die 10 % FBS und 1 % ps enthalten, resuspendiert. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in eine Petrischale und inkubieren Sie die Suspension bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der ersten Beschichtung, um die Zelltrümmer und die Mehrheit der in der Kultur vorhandenen Erythrozyten zu entfernen.

Wechseln Sie schließlich das Medium in den folgenden zwei Wochen alle drei Tage, danach sind die Kulturen der primären EOC-Zellen bereit für nachgeschaltete Anwendungen. Unmittelbar nach dem Plattieren. Die epithelialen Eierstockkrebszellen oder EOC-Zellen erscheinen als Einzelzellsuspensionen und in Klumpen mit Erythrozyten und Zelltrümmern im Überfluss.

Die EOC-Zellkultur drei Tage nach der Beschichtung zeigt semi-adhärente EOC-Zellcluster und eine geringere Erythrozytenkontamination. Eine Woche nach der ersten Beschichtung wird die EOC-Zellkultur zu einem wirbelartigen Cluster von Zellen, der sich auf dem Gewebekulturkunststoff ausbreitet. Die typische epitheliale Pflastersteinmorphologie ist in einer konfluenten Monoschicht von EOC-Zellen nach 14 Tagen Kultur zu sehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Eierstockkrebszellen aus festen klinischen Proben isoliert und charakterisiert werden können.