Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien mittels einer enzymbasierten selektiven Hydrolyse und eines Assays. Diese Methode kann dazu beitragen, eine Schlüsselfrage auf dem Gebiet der Cyanobakterien zu beantworten, wie z. B. Physiologie, Molekulargenetik und Bioengineering verschiedener Cyanobakterienstämme, die derzeit untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an einen kleinen Maßstab angepasst ist, einfach durchzuführen und sehr empfindlich und spezifisch für Glykogen ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in Cyanobakterien geben kann, kann sie auch auf andere Mikroorganismen angewendet werden, die Glykogen oder Stärke ansammeln, wie z. B. E.Coli, Hefe, Mikroalgen und verschiedene heterotrophe und phototrophe Mikroorganismen. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Vorbereitung von Cyanobakterienkulturen, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie einen Milliliter Cyanobakterienkultur oder Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Dann zentrifugieren Sie bei 6.000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in einem Milliliter 50 Millimolar Tris-HCL pH 8 resuspendieren. Zentrifugieren Sie das resuspendierte Pellet wie zuvor.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet ein zweites Mal im Tris-HCL-Puffer. Zentrifugieren Sie die Röhrchen wie zuvor und entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet gründlich in 500 Mikrolitern 50 Millimolar Tris-HCL-Puffer mit einem pH-Wert von acht.

Für eine effiziente Lyse ist es entscheidend, dass das Pellet gut suspendiert ist. Bewahren Sie die Resuspension in Eis auf. Die resuspendierten Zellen werden bei vier Grad Celsius durch 30 Zyklen Ultraschall lysiert, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei einer Frequenz von 20 Kilohertz mit einer maximalen Amplitude besteht, gefolgt von 90 Sekunden ohne.

Das Röhrchen mit dem Lysat wird 10 Minuten lang bei 6.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren sollte das Pellet hauptsächlich aus großzelligen Trümmern bestehen, und der Überstand wird für die weitere Analyse verwendet. Bestimmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Proteinkonzentration mit dem Protein-Assay-Kit.

Entfernen Sie das Chlorophyll a aus dem Zelllysat, indem Sie 900 Mikroliter Ethanol und 100 Mikroliter des erhaltenen Überstands in ein 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mischen. Nach dem Schließen der Kappe erhitzen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius mit einem handelsüblichen Laborheizblock. Inkubieren Sie das Röhrchen dann 30 Minuten lang in Eis.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand vorsichtig zu entfernen. Das Pellet enthält Glykogen.

Trocknen Sie das Pellet leicht an der Luft, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. Trocknen Sie das Pellet nicht übermäßig ab, um ein schwieriges Auflösen zu vermeiden. Die Extinktion wird bei 666 Nanometern des erhaltenen Überstands gemessen, um den Gehalt an Chlorophyll a zu bestimmen.

Der Wert kann verwendet werden, um den Glykogengehalt zu normalisieren. Lösen Sie das Pellet in 100 Mikrolitern 50 Millimolar Natriumacetat pH fünf auf. Mischen Sie diese Materialien gut mit einem Wirbel.

Das Mischen durch Pipettieren wird nicht empfohlen, da die Mischung viskos ist. Fügen Sie auch 50 Mikroliter mit acht Einheiten pro Milliliter Amyloglucosidase und 50 Mikroliter mit zwei Einheiten pro Milliliter Alpha-Amylase hinzu. Als nächstes inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius in einem Heizblock, um den Verdau von Glykogen in Glukosemoleküle zu ermöglichen.

Nach der Inkubation wird die Probe fünf Minuten lang bei 20.000 g zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Messen Sie die Glukosekonzentration im Überstand nach der enzymatischen Hydrolyse mit dem GOD-POD-Reagenz. Übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands aus dem Glykogenfällungsschritt in eine Vertiefung in einer 96-Well-Platte.

Verwenden Sie als Negativkontrolle 100 Mikroliter 50 Millimolar Natriumacetat pH fünf. Zur Erstellung der Kalibrierkurve sind auch die Glukose-Standardlösungen zu messen. Geben Sie 150 Mikroliter GOD-POD-Reagenz zu jeder Probe und mischen Sie sie schnell durch Pipettieren.

Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Zeichnen Sie dann den Absorptionswert bei 510 Nanometern mit einem Plattenlesegerät auf. Berechnen Sie die Glykogenmenge als Glukoseäquivalent unter Verwendung einer Kalibrierkurve, die aus den Glukosestandards erhalten wird.

Hier sind die Glykogengehalte in Synechocystis dargestellt. Die beiden mutierten Stämme, delta pmg A und delta pmg R, von denen bekannt ist, dass sie Glykogen hyperakkumulieren, wurden mit dem Wildtyp-Stamm verglichen. Erwartungsgemäß wiesen die mutierten Stämme erhöhte Glykogenspiegel auf.

Umgekehrt hat eine Mutante, der die Glykogensynthase fehlt, kein Glykogen akkumuliert. Die hier verwendeten Stämme wurden so verändert, dass sie Mannitol produzieren. Bemerkenswert ist, dass die Glykogensynthase-Mutante mehr Mannitol produzierte als der Kontrollstamm, was darauf hindeutet, dass das durch Photosynthese synthetisierte Kohlenhydrat in dem mutierten Stamm, dem die Fähigkeit zur Synthese von Glykogen fehlt, zu Mannitol umgeleitet wird.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, den Glykogengehalt in Cyanobakterien in fünf Stunden quantitativ zu bestimmen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen gründlich zu resuspendieren und Glykogenpellets zu lösen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Assays der metabolischen Enzymaktivität mit den verbleibenden Zelllysaten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie der Kohlenhydratstoffwechsel in Cyanobakterien reguliert wird.