Name: Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Generierung monoklonaler Antikörper gegen Naturprodukte mittels Immunisierung, Zellfusion und ELISA-Screening. Diese Methode ermöglicht präzise Immunoassays für biologische Proben.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81573573, 81473338 und 81503344) und dem klassischen Rezept grundlegende Forschungsteam an der Beijing Universität der chinesischen Medizin unterstützt.

Alle tierischen Verfahren durchgeführt, die in dieser Studie wurden von der ethischen Prüfungsausschuss an der Beijing University of Chinese Medicine (Genehmigung Nr. 2016BZYYL00109) genehmigt.
Hinweis: Die weiblichen BALB/c Mäuse (8 Wochen alt) wurden mit Hapten-Carrier-Protein Konjugate immunisiert. Wenn Sie allein, ein kleines Molekül (< 1.000 Da) kann keine Immunantwort hervorrufen. Jedoch Konjugation das kleine Molekül in ein Träger Makromolekül führt in Antigen-Synthese. In diesem Zusammenhang ist das kleine Molekül ein Hapten beschriftet. Hapten Konjugation ist ein notwendiges und wirksames Strategie bei der mAb-Produktion. Kreuz Reaktivität, zwei verschiedene Eiweißträgern wie Rinderserumalbumin (BSA) und Ovalbumin (OVA) oder Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) zu vermeiden und BSA, sollte als die immunogenen (für tierische Immunisierung) und Beschichtung Antigene (auf die Platte zum Beschichten verwendet werden Anti-Serum-Erkennung). BSA und Eizellen werden als Beispiel in dieses Protokoll verwendet.
1. Vorbereitung des Immunogen und Beschichtung Antigen
Hinweis: Für künstliche Antigen-Synthese, verwenden Sie die entsprechenden funktionellen Gruppe (z.B., Hydroxyl, Sulfhydryl Carboxylgruppen sauer oder amino) als den Seitenarm für die kovalente Bindung mit dem Trägerprotein. Die Konjugation, die Methoden umfassen periodate Oxidation, der Carbodiimide-Methode, eine gemischte Anhydride Reaktion, Glutaraldehyd Reaktion und die Succinat-Methode. Dieses Protokoll verwendet Naringin (NAR), eine bekannte Flavanone Glykosid, als Beispiel Verbindung. NAR ist eine kleine Anlage (581 Da) in Zitrusfrüchten sowie verschiedene traditionelle chinesische Medizin.
<ol><li>Verwenden Sie eine Periodate Oxidation Verfahren, um NAR-BSA und NAR-OVA Konjugate zu synthetisieren.<ol>
<li>50 mg NAR in einer Endkonzentration von 1 mg/mL22Wasser auflösen.</li>
		<li>Fügen Sie 100 µL der frisch zubereiteten Natrium periodate Lösung (0,1 M) bis 5 mL der NAR-Lösung hinzu. Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 mg von BSA und Eizellen in 2,0 mL 50 mM-Karbonat-Puffer (pH 9,6) auflösen. Fügen Sie dieses Protein Lösung für das NAR/Natrium periodate Reaktionsgemisch.</li>
	<li>Passen Sie die Mischung auf pH 9 mit 1 M Na2CO3 Lösung und rühren bei Raumtemperatur für 6-8 h.</li>
	<li>Dialyse das Reaktionsgemisch in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer Dialysemembran (MWCO 10 kDa) für 3 Tage, die CBS auszutauschen.</li>
	<li>Analysieren der Hapten-Carrier-Konjugat mit Matrix assisted Laser Desorption/Ionisierung Zeit des Fluges (MALDI-TOF)-MS.<ol>
<li>Mischen Sie 1 bis 10 Pmol des Konjugats mit 103-molare Sinapinic Säure-Überschuss in einer wässrigen Lösung mit 0,15 % Trifluoroacetic Säure (TFA) Falten. Trocknen Sie die Mischung auf einem Probenteller in Luft.</li>
		<li>Führen Sie die Analyse mit ein MALDI-TOF Massenspektrometer, ausgestattet mit einem gepulsten Stickstoff Laser betrieben bei 337 nm. Positive Ionen MALDI Massenspektren im linearen Modus innerhalb der Masse 15.000-100.000 wie zuvor beschrieben22(m/Z) zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunisierung
Hinweis: Insgesamt 5 BALB/c weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden verwendet: 4 für NAR Konjugat-Impfung und 1 für die Kontrolle (PBS) Immunisierung.
<ol><li>Für die erste Impfung 50 µg Konjugat (in 100 µL PBS verdünnt) mit ein gleiches Volumen der Freunds kompletten Adjuvans (CFA) mischen und vollständig emulgieren. Verabreichen Sie 100 µL dieser Mischung an jede Maus über dorsalen subkutanen Injektion.</li>
	<li>Liefern Sie zwei Wochen später ein Booster Impfung (100 µL) durch subkutane Injektion mit der gleichen Menge an Konjugat mit unvollständige Adjuvans (IFA) gemischt.</li>
	<li>Extrahieren Sie, 200 µL Blut aus der Vene Schweif von jeder Maus 7 Tage später um Serum erhalten.<ol>
<li>Zentrifuge das Blut bei 3.000 x g für 10 min. Transfer überstand das Serum zu einem neuen Schlauch.</li>
		<li>Analysieren Sie das Serum mit einem ELISA als zuvor beschriebenen21. Wählen Sie die Maus mit der höchsten Serum-Titer für Zellfusion verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In Vorbereitung auf Zellfusion Verwalten einer gepulsten Immunisierung, die gewählten Maus über intraperitoneale Injektion von 50 µg des Konjugats in 300 µL PBS ohne Adjuvans 3 Tage vor der Fusion. Hinweis: Dieser Schritt kann ausgelassen werden, wenn der Titer hoch genug ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung auf Zellfusion
<ol><li>Cell Fusion mittlere Vorbereitung<ol>
<li>Für die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) selektiven Medium: 50 x Hut Medien Ergänzung in 10 mL von RPMI-1640 auflösen und fügen Sie diese Mischung auf 500 mL RPMI-1640 mit 20 % FBS. Hinweis: Wenn 10 mL Konzentrat 50 X 500 mL Kulturmedium verdünnt sind, sind die Endkonzentrationen von Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin 100 µM, 0,4 µM und 16 µM bzw..</li>
		<li>Für die Hypoxanthin-Thymidin (HT) Medien: Auflösen der 50 x HT Media Ergänzung in 10 mL von RPMI-1640 und fügen Sie diese Mischung auf 500 mL RPMI-1640 mit 20 % FBS. Die Endkonzentrationen von Hypoxanthin und Thymidin sind 100 µM bzw. 16 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kulturzellen Sie Sp2/0-Ag14.<ol>
<li>Tauen Sie mindestens 7 Tage vor der Fusion auf, schnell ein Fläschchen mit flüssigem Stickstoff eingefroren SP2/0-Ag14 Myelomzellen im warmen Wasser.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Lösung in 5 mL frisches Nährmedium (RPMI-1640) und Zentrifuge für 10 min bei 1000 X g.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Zentrifugation das Kulturmedium und Aufschwemmen der Zellen frische RPMI-1640 mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt.</li>
		<li>Zellen und Medium in einem 25 cm2 Kolben und Inkubation bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2.</li>
		<li>Erweitern Sie die Zellen auf 3 oder 4 75 cm2 Fläschchen vor der Fusion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Abdominal-Feeder Schicht Zellen<ol>
<li>Opfern Sie eine 12 Wochen altes Baby Albino-ICR-Maus durch zervikale Dislokation 1 Tag vor Zellfusion zu und Tauchen Sie es in 75 % Ethanol.</li>
		<li>Nach dem Entfernen des Fells aus dem Bauch mit hämostatischen Zangen, desinfizieren der Gegend mit 75 % Ethanol. Schneiden Sie die äußere Haut um die Bauchhöhle verfügbar zu machen. 3 mL steriles RPMI-1640 Medium in die Bauchhöhle injiziert und massieren Sie den Bauch um zusätzliche Zellen in die Lösung zu lösen. Aspirieren Sie die Feeder-Zellsuspension in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Nach der Zellsuspension für 10 min bei 1000 X g Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Feeder-Zellen in 20 mL Hut selektiven Medium.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen in Kultur 96-Well Zellplatten (100 µL/Well). Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Zellfusion
<ol><li>Nach die gewählten geimpft wurde Maus für Zellfusion erstellt (siehe Punkt 2.4), eine intraperitoneale Injektion von 10 % Chloral Hydrate (Narkose) zu verwalten und immunisierten Maus durch zervikale Dislokation zu opfern.</li>
	<li>Sammeln Sie zusätzliche Blut aus dem Herzen (1 mL), und bereiten Sie Serum wie unter Schritt 2.3.1 als Positivkontrolle während Hybridom Auswahl verwenden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut und Muskel Gewebe mit einer Schere, um die Milz verfügbar zu machen.</li>
	<li>Isolieren Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette zu und waschen Sie die Milz mit RPMI-1640. Die Milz in Stücke schneiden und langsam die Milz zu genannte Pfund. Bereiten Sie eine Milz Zellsuspension durch Drücken der Milz-Gewebe durch eine 800 Sieb Zelle in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie die Milz Zellsuspension mit RPMI-1640 Medium. Ernte der Milzzellen durch Zentrifugieren (1000 x g, 10 min und 4 ° C), und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diese Waschschritt dreimal.</li>
	<li>Entfernen Sie kultiviert und verstärkte Myelom-Zellen aus dem Inkubator und sanft Hahn/schütteln die Kolben um eine Zellsuspension zu erhalten. Waschen Sie diese Suspension mit RPMI-1640 Medium zweimal um die FBS zu entfernen. Hinweis: Dies ist ein wesentlicher Schritt, als FBS Zellfusion beeinflussen können.</li>
	<li>Zählen der Zellen und die Konzentration vor dem Mischen mit der Milzzellen anpassen. Das letzte Verhältnis der Milzzellen auf Myelomzellen sollte zwischen 1:5 und 01:10.</li>
	<li>Mischen Sie die Milz Zelle Aussetzung und Myelom-Zellen. Zentrifugieren Sie die Zelle Mischung (1000 x g, 10 min und 4 ° C), und entfernen Sie den überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Lösung 50 % Polyethylenglykol (PEG) zu den Zellen und rühren Sie sanft bei 37 ° C für 1 min. Lassen Sie stehen für 30 s. Hinweis: Die PEG-Lösung verwendet in diesem Schritt sollte enthalten 50 % (w/V) Polyethylenglykol 1500 und 10 % (V/V) Dimethyl Sulfoxid (DMSO) mit PBS-Puffer ohne Calcium (Ca2 +).</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL RPMI-1640 Medium für 2 min, die Reaktion zu kündigen. Fügen Sie eine zusätzliche 2 mL RPMI-1640 Medium für ein weiteres 1 min, und fügen Sie eine zusätzliche 10 mL RPMI-1640 Medium.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 X g für 10 min. Nach verwerfen des Überstands, Hut Lösung hinzufügen und weiter, die Zellen zu kultivieren. Dann fügen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung der Feeder-Schicht-Platten und inkubieren Sie die Platten für 7 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2. Hinweis: Unter diesen Bedingungen werden fusionierter Myelom-Zellen sterben, während die Hybridom-Zellen werden weiter im Hut Medium wachsen. Innerhalb von 7 Tagen wird monoklonalen Hybridom bilden als einem einzigen Cluster von Zellen in den Brunnen, Brunnen mit polyklonalen Hybridom mehrere Cluster von Zellen haben werden.</li>
	<li>Aspirieren des Überstands für die Analyse und das Medium mit HT Medium zu ersetzen. Hinweis: Achten Sie darauf, das Hut-Medium zu ersetzen mit HT mittlere zunächst als Wechsel direkt zu unsupplemented Medium wirkt sich nachteilig auf die Hybridom.</li>
</ol>5. indirekte wettbewerbsfähige ELISA (IcELISA)
<ol><li>Bestreichen Sie eine 96-Well-Platte mit NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL/Well) und 1 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Blockieren Sie die Platte mit 300 µL GPBS (PBS mit 1 % m/V Gelatine) für 1 h bei 37 ° C, nicht-spezifische Adsorption zu verhindern.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte dreimal mit TPBS (PBS mit 0,05 % V/V Tween-20).</li>
	<li>Verdünnen Sie unconjugated NAR in einer Reihe von Konzentrationen mit 10 % Methanol. Fügen Sie 50 µL diese Verdünnungen, Brunnen zu trennen. Fügen Sie in die weiteren Bohrungen 50 µL Antiserum oder Hybridom überstand (mit mAbs). Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° c</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL der Peroxidase radioaktiv markierten Anti-Maus IgG in jede Vertiefung und weitere 1 h inkubieren.</li>
	<li>Nach dem Waschen der Platte dreimal mit TPBS, 100 µL Substratlösung hinzufügen (0,1 M Citrat-Puffer (pH 4) enthält 0,015 % V/V H2O2 und 2 mg/mL von 3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-Benzidine (TMB)) zu jedem gut und 15 min inkubieren.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 1 M H2SO4 in jede Vertiefung.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption mit einem Mikrotestplatte Reader bei 450 nm. Wählen Sie die Hybridome, die höchsten Konzentrationen von NAR Antikörper in ihren überstand zur weiteren Vorbereitung abgesondert.</li>
</ol>6. Vorbereitung der monoklonalen Hybridomen
<ol><li>Verwenden Sie die begrenzende Verdünnungsmethode um monoklonale Hybridome vorzubereiten.<ol>
<li>Nach dem Entfernen der HT-Medium aus der ausgewählten Hybridome (d. h. diejenigen positiv für NAR Antikörper Sekretion), die Zellen RPMI-1640 Aufschwemmen und sie zählen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen zu einer Konzentration von 1 Zelle, 2 Zellen und 4 Zellen pro Bohrloch in 100 µL RPMI-1640 in eine 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
		<li>Erkennen Sie nach 7-10 Tagen die NAR-Antikörper in der Kultur Überstand über das IcELISA-Protokoll (Schritt 5). Übertragen Sie Zellen von den Hybridome, die positiv auf NAR Antikörper gegen 24-Well Platten, 25 cm2 Fläschchen und 75 cm2 Fläschchen für den Anbau sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tiefgefrieren Sie die monoklonalen Hybridome.<ol>
<li>Ernten der Zellen und übertragen Sie sie um Rohre zu zentrifugieren.</li>
		<li>Nach dem Zentrifugieren der Zellen (800 X g, 10 min), entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in der eisigen Medium (RPMI-1640, 20 % fetalen Kälberserum (FCS) und 10 % DMSO). Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf Cryoröhrchen.</li>
		<li>Speichern Sie die Cryoröhrchen in einem Farbverlauf Kühlbox bei-80 ° C für 24 h. Dann übertragen Sie die Cryoröhrchen zu flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die erfolgreiche Produktion von mAbs gegen natürliche Produkt abgeleitet kleine Moleküle. Die wesentlichen Schritte des Verfahrens umrissen worden, und wir haben bewiesen, dass die Nützlichkeit dieses Protokoll mit NAR als ein Beispiel kleines Molekül. Die Beispiel-Spektren, Reaktivität Analysen und IcELISA Ergebnisse zeigen Vertreter experimenteller und Steuerdaten, die mit diesem Protokoll abgerufen wird. Beispielbilder von der Hybridome bieten eine visuelle Darstellung der...

Monoklonale Antikörper (MAK), auch bekannt als Mono-spezifische Antikörper werden aus einem einzigen zahlreiche Klon hergestellt und bestehen aus monovalenten Antikörper, dass alle an der gleichen Epitop1binden. In den letzten Jahren haben viele pflanzliche natürliche Arzneimittel bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten2verwendet worden. In der Tat sind viele kleine Molekülverbindungen ursprünglich abgeleitet aus Naturprodukten nun als Erstlinien Drogen wie Artemisinin für Malaria und Paciltaxel (Taxol) für Krebs2,3angewendet. Die Studie von Naturprodukten machte rasche Fortschritte, vor allem auf die enorme Entwicklung und Optimierung der herkömmlichen Analyse-Techniken, einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie (MS). Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die diese Methoden, wie z. B. ihre komplexen Vorbehandlung Protokolle und die damit verbundenen Kosten in Bezug auf Zeit, Arbeit/Expertisen und erforderlichen Instrumente4zugeordnet.
Vor kurzem wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe mAb basierende Assays (Elisa) angewendet, um Lebensmittel und natürliche Produkte qualitativ und quantitativ zu analysieren. In der Tat, diese Methode beantragt worden Analyse von biologischen Proben und klinische Tests und hat gezeigt, dass genau, empfindlich und höchst effizient zu sein, während auch die Vermeidung der mühsame Vorbehandlung Schritte verknüpft mit anderen Analysen5, 6.
Wenn mAb-basierte ELISAs verwenden, um komplexe natürliche Produkte zu studieren, ist Vorbereitung von monoklonalen Antikörpern eines der Kern-Schritte. Leider der mAbs speziell für kleinen bioaktiven Komponenten in diesen Arten von Substanzen6,7,8,9,10,11,12 vorhanden ,13,14,15 sind oft begrenzt, im Vergleich zu den Protein-Antigene. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir ein Protokoll, um speziell generieren mAbs gegen kleine Verbindungen entwickelt. Die hier vorgestellten Protokoll umfasst künstliche Antigen-Synthese, Maus Immunisierung Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung.
Vor allem unsere Forschungsgruppe die Bildung von mAbs gegen kleine bioaktiven Verbindungen, die aus der traditionellen chinesischen Medizin studiert und entwickeln ihre Anwendungen seit Jahren. In unseren laufenden Studien haben wir mAbs gegen Baicalin16, Puerarin17Glycyrrhizic Säure18, Paeoniflorin19, Ginsenoside Re20, Ginsenoside Rh121und viele andere kleine Moleküle entwickelt. Unsere ELISA-Protokolle basierend auf diese mAbs wurden in einer Reihe von Studien zur Pharmakokinetik von diesen kleinen Molekülen sowie ihre Interaktionen mit anderen bioaktiven Substanzen zu bewerten. Darüber hinaus entwickelten verwenden diese mAbs, auch Immunoaffinitäts Chromatographie Methoden zur Trennung von strukturelle Analoga, einschließlich Epimers wir. Vor kurzem haben wir eine lateral Flow Immunoassay mit unserer Anti-Puerarin mAb, die anschließend für schnelle, vor-Ort-Nachweis von dieser Verbindung verwendet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere mAb basierende Assays unverzichtbar und praktische Werkzeuge sind für das Studium der Biologie und der Qualität der natürlichen Produkt abgeleitete Verbindungen, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet.

<table><tbody><tr><td>800 Mesh (40 &mu; m Nylon) Filter&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Kulturplatte</td><td>NUNC</td><td>119567</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Kolben</td><td>Labserv</td><td>310109016</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>860336 1G</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Kulturplatte</td><td>NUNC</td><td>117246</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>Corning</td><td>430645</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen, 1 mL&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Grubber</td><td>DRP-9082&nbsp;</td><td>Samsung</td><td></td></tr><tr><td>Dialysemembran (10kDa)</td><td>Heng Hui</td><td>45-10000D</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>DH105-10</td><td></td></tr><tr><td>elektronische Waage&nbsp;</td><td>BS124-S&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Platten, 96 Well</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 96%</td><td>Sinopharm Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s Adjuvans, komplettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBM2183V</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s Adjuvans, unvollständiges</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBL0210V</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>AMRESCO</td><td>9764-500g</td><td></td></tr><tr><td>Gradientenkühlerbehälter</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>HAT Medienergänzung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0262-10VL</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Maus IgG-Antikörper</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>HT Medienergänzung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0137-10VL</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>IX73</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schlüsselloch-Napfschnecke hämocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF-MS&nbsp;</td><td>Axima-CFR&nbsp; plus&nbsp; &nbsp;</td><td>Axima&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTex</td><td>ELX-800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maus</td><td>Vital River&nbsp;</td><td>BALB/c</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Beijing BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin& Streptomycin-Lösung</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10 mL</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 25 mL</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>applygen</td><td>P1622</td><td></td></tr><tr><td>Natriumperiodat</td><td>Sinopharm Chemikalie</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1.000 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von monoklonalen antikörpern gegen naturprodukte

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Die Analyse der bioaktiven Komponenten in Lebensmittel und Naturprodukte ist ein beliebtes Gebiet der Studie in vielen Bereichen, einschließlich der traditionellen chinesischen Medizin und Lebensmittel Sicherheit/Toxikologie geworden. Viele der klassischen Analysetechniken erfordern teure Ausrüstung und/oder Know-how. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (Elisa) sind vor allem eine neue Methode für die Analyse von Lebensmitteln und natürlichen Produkten geworden. Diese Methode basiert auf Antikörper-vermittelten Erkennung von Zielkomponenten. Wie viele bioaktiven Komponenten bei Naturprodukten sind jedoch klein (< 1.000 Da) und keine Immunantwort auslösen, Erstellen von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen sie ist oft schwierig. In diesem Protokoll bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Schritte erforderlich, um mAbs gegen Zielmoleküle als auch benötigt, um die damit verbundenen indirekten wettbewerbsfähig (ic) ELISA für die schnelle Analyse der Verbindung mehrerer Proben erstellen generieren. Das Verfahren beschreibt die Synthese des künstlichen Antigens (d. h. das Hapten-Carrier-Konjugat), Immunisierung, Zellfusion, monoklonalen Hybridom-Vorbereitung, Charakterisierung der MAB und die ELISA-basierten Anwendung der MAB. Das Hapten-Carrier-Konjugat wurde durch das Natrium synthetisiert periodate Methode und von MALDI-TOF-MS ausgewertet. Nach der Immunisierung, Splenocyten wurden isoliert von der immunisierten Maus mit der höchsten Antikörpertiter und verschmolzen mit der Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) - sensible Maus Myelom Zelllinie Sp2/0 - Ag14 mit einem Polyethylenglykol (PEG)-basierte Methode. Die Hybridome sezernierenden mAbs reagiert auf das Ziel-Antigen wurden durch IcELISA für Spezifität und Kreuzreaktivität gezeigt. Darüber hinaus wurde die begrenzende Verdünnungsmethode angewandt, um monoklonale Hybridome vorzubereiten. Die endgültige mAbs waren weitere zeichnet sich durch IcELISA und dann in einem ELISA-basierten Anwendung zur schnellen und bequemen Detektion von Beispiel-Hapten (Naringin (NAR)) in natürlichen Produkten genutzt.

Generierung von monoklonalen Hybridomen
Das Molekulargewicht des Konjugats Hapten-Carrier wurde durch MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt. Da das Molekulargewicht des BSA und NAR bekannt sind, konnte die Anzahl von kleinen Molekülen mit BSA konjugierten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt repräsentative spektrale Ergebnisse für NAR-BSA22, die ei...

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonale Antikörper werden als monospezifische Antikörper bezeichnet, die aus einem einzigen B-Lymphozytenklon und den monovalenten Antikörpern hergestellt werden, die an dasselbe Epiton binden. In jüngster Zeit hat sich der monoklonale Antikörper-basierte ELISA zu unserer neuen Plattform für die qualitative oder quantitative Analyse von Lebensmitteln oder Naturprodukten entwickelt. Diese Methode ist eine genaue, empfindliche und effektive Methode ohne mühsame Vorbehandlungsschritte.Das ist also das Wesentliche für biologische Proben und die zukünftigen klinischen Anwendungen. Die Vorbereitung der mABs von TCM ist ein wichtiger Schritt in Studien über komplexe Systemeigenschaften der TCM-Formel. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um mABs gegen die kleinen molekularen Verbindungen zu erzeugen, einschließlich künstlicher Antigensynthese, Mausimmunisierung und Zellfusion.Das Hapten ist mit dem Trägerprotein verbunden, um das künstliche Antigen zu synthetisieren. Künstliches Antigen und vollständige Hilfsstoffe werden gemischt und emulgiert. Die Maus wurde durch subkutane Injektion immunisiert.Nehmen Sie die Milz der immunisierten Maus heraus und machen Sie einzellige Suspension. M

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Antikörpern aus Säugetierzellen durch Einführung von Plasmidvektoren mit schweren und leichten Kettengenen. Diese Vektoren interagieren mit Polyethylenimin und gelangen durch Bildung von Polyplexen in die Zellen; Später werden sie in einzelne Proteine übersetzt und zu vollständigen Antikörpern zusammengesetzt, die in das extrazelluläre Medium sezerniert werden.

Erzeugung rekombinanter monoklonaler Antikörper aus Säugetierzellkulturen

Das Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen. Eukaryotische Expressionsvektoren, die für die schweren und leichten Ketten von Antikörpern kodieren, die von isolierten antigenspezifischen B-Zellen kloniert wurden, werden mit Hilfe von Polyplexen in Säugetierzellen eingeführt. Sobald sich diese Vektoren in den Zellen befinden, durchlaufen sie eine Translation, und die resultierenden schwer- und leichtkettigen Peptide lagern sich zu...

Eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen

Die Synthese von humanen monoklonalen Antikörpern ist der erste Schritt in Studien, die darauf abzielen, die pathophysiologischen Mechanismen von Autoantikörper-vermittelten Immunantworten zu entschlüsseln. Wir haben ein Protokoll zur Erzeugung rekombinanter monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper aus blutsortierten B-Zellen entwickelt, einschließlich B-Zellisolierung, Antikörperklonierung und In-vitro-Synthese.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern auf Basis der Hybridom-Technologie vorgestellt. Die Mäuse wurden mit einem Immunkonjugat immunisiert. Milzzellen wurden durch PEG und einen elektrischen Impuls mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Antikörper-produzierende Hybridomzellen wurden mittels HAT und antigenspezifischem ELISA-Screening selektiert.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit THP1 Zellen...

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Die Lagerbedingungen von Thrombozytenprodukten schaffen eine ideale Umgebung für bakterielle Verunreinigungen, um sich auf ein gefährliches Niveau zu vermehren.  Das Ziel dieser Studie war es, einen koloniebildenden Assay zu verwenden, um einen Riboflavin-basierten Erregerreduktionsprozess gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer in humanen Thrombozytenprodukten zu bewerten.

Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer

Erfahren Sie die Generierung monoklonaler Antikörper gegen Naturprodukte mittels Immunisierung, Zellfusion und ELISA-Screening. Diese Methode ermöglicht präzise Immunoassays für biologische Proben.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

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