Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

Hallo, mein Name ist Alice Chen. Ich bin Postdoc im Schmelzlabor und zeige Ihnen heute, wie wir embryonale Stammzellen aus menschlichen Embryonen gewinnen. Wir erhalten Embryonen in allen verschiedenen Entwicklungsstadien und kultivieren sie in vitro, bis sie das richtige Stadium der expandierten Blasten erreichen.

Dies sind Beispiele dafür, wie sich der Embryo von der ersten Zellphase bis zur frühen Blast-Unterstützung und dann der expandierten Explosion entwickelt, aus der wir menschliche embryonale Stammzellen gewinnen. Hochwertige Embryonen, die für die Gewinnung ausgewählt wurden, werden dann durch drei Tropfen ACE-Straßen übertragen, wo Sie sie belassen und auf die Auflösung des Z von Lucita achten. Der neurochirurgische Prozess ist ein unspezifischer Prozess, bei dem der Kaninchen-Anti-Human-Antikörper an die äußere Zellschicht bindet.

In diesem Fall ist es die Trifecta Derm. Nach der Verabreichung von Meerschweinchen-Serumkomplikation werden alle diese Zellen mit angehängten Antikörpern lysiert. Zu Beginn wollen wir drei Teller vorbereiten.

Die erste Platte ist für ACE-Tyros, die wir verwenden, um die Zita zu entfernen. Die zweite und dritte Platte sind für die Immunchirurgie. Ich beginne zunächst mit der Erstellung der Platte, auf der wir die sauren Tyrostropfen und die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen platzieren werden.

Medien-Drops. Bereiten Sie drei Tropfen saure Tyros auf der linken Seite der Platte vor, und auf der rechten Seite der Platte bereiten Sie drei Tropfen humane ES-Kulturmedien vor. Die zweite Platte besteht aus dem primären Antikörper, bei dem es sich um eine Kaninchen-Anti-Human-Erythrozyten handelt.

Auch hier ist die linke Seite der Platte für den primären Antikörper bestimmt, drei Tropfen pro Embryo, und die rechte Seite der Platte für die humane ES-Kultur. Das Medium tropft wieder drei Tropfen pro Embryo für die Komplementplatte. Auch hier geben wir drei Tropfen Komplement auf die linke Seite der Platte und dann drei Tropfen humanes ES-Kulturmedium auf die rechte Seite der Platte.

Auch hier ist jede Reihe einem Embryo gewidmet. Alle drei Platten werden mit Mineralöl überzogen, um eine Verdunstung zu verhindern, und zur Äquilibrierung in den Inkubator gelegt. Dies ist ein Präparierbereich innerhalb eines Pflückerguts, in dem es eine laminare Strömung gibt, genau wie bei einer Gewebekultur, und hier führen wir den Großteil unserer menschlichen Ana-Manipulation durch.

Das erste, was Sie vorbereiten sollten, bevor Sie mit Ihren Embryonen beginnen, sind Mundpipetten. Dies ist also der Standard-Mundpipettenschlauch, mit dem Unterschied, dass wir einen 0,2-Mikron-Filter zwischen Ihrem Mund und der Stelle, an der die Pipette hingehen würde, eingesetzt haben. Und das nur, um die Sterilität zu gewährleisten.

Lassen Sie mich zeigen, wie man Mundpipetten zieht. Ich ziehe gerne eine Vielzahl von Größen. Sie können all dies bei VWR erhalten und ich ziehe gerne Durchmesser von 10 Mikrolitern, 50 Mikrolitern und 100 Mikrolitern.

Jetzt verwende ich einen Diamantstift, um das Montagerohr zu schneiden. Für diesen ersten Schritt möchten Sie einen ziemlich großen Durchmesser, da Sie den gesamten Embryo handhaben. Hochwertige Embryonen, die für die Gewinnung ausgewählt wurden, werden dann durch drei Tropfen übertragen.

Ofci-Straßen, die nur vom ersten Tropfen zum zweiten Tropfen zum dritten Tropfen führen, wo Sie ihn verlassen und auf die Auflösung der Zap Palita achten. Dieser Vorgang dauert in der Regel weniger als 30 Sekunden, und Sie können tatsächlich sehen, wie sich die Zop Palita auflöst. Wenn sich die Zap Palita vollständig aufgelöst hat.

Die Embryonen werden dann durch die drei Waschtropfen des menschlichen Es-Kulturmediums übertragen, die durch den ersten, zweiten und dritten Waschtropfen hindurchgehen. Dann wird der Embryo in den Primärantikörper übertragen, tropft wieder und wandert vom ersten Tropfen zum zweiten Tropfen zum dritten Tropfen, wo Sie ihn für eine halbe Stunde Inkubation im Gewebekultur-Inkubator lassen. Die Lyse der Trifecta wird sichtbar, wenn Sie Blasenbildung der Zellen an der Außenseite des Embryos sehen. Dies ist der Beginn der Trifecta Hautzellen zu lügen.

Wenn die Lyse am gesamten äußeren Rand des Embryos sichtbar ist, ist der Embryo bereit, durch die drei Tropfen humanus culture media gewaschen zu werden. Nach der Immunoperation werden die Embryonen mit einer Pipette mit kleinerem Mund mechanisch verriefen. Diese Mundpipette sollte einen kleineren Durchmesser als die erste Pipette haben, damit Sie den Prozess der Tation für das Abrasieren der Lys Trifecta effizienter gestalten können.

Hautzellen. Am Ende der mechanischen Ation bleibt ein Cluster von Zellen in der Mitte. Es gibt die innere Zellmasse, die intakt ist.

Um diese herum gibt es viele Lys Trifecta Hautzellen sowie einige intakte Trifecta Hautzellen. Dieses innere Zellmassenisolat wird dann in eine Vertiefung gegeben, die mit Feeder-Schichtzellen von embryonalen Mäusen vorbereitet wurde. Die Platte mit den Feeder-Layer-Zellen wurde am Vorabend vorbereitet, und heute Morgen habe ich das Medium von embryonalen Fibroblasten-Medien der Maus auf humane Ableitungsmedien umgestellt.

Das innere Zellmassenisolat wird dann aus den Waschtropfen nach der Komplementierung in diese Vertiefung überführt, die die Zellen der Feederschicht enthält. Diese Schale wird dann in den Inkubator zurückgebracht und einige Tage lang unberührt gelassen, um die Anheftung des inneren Zellmassenisolats zu ermöglichen. Dies ist ein Beispiel dafür, wie sich der Auswuchs entwickelt.

Wenn der Auswuchs groß genug wird. Dann können wir die erste Passage beginnen, indem wir diesen Auswuchs in zwei Hälften teilen. Nun, es sind 14 Tage seit der ursprünglichen Ableitung vergangen, und hier ist ein Beispiel für einen Auswuchs aus einer unserer Ableitungen.

Dies ist ein Beispiel für einen solchen Auswuchs, bei dem ich heute die Hälfte des Auswuchses abschneiden werde. Dieser Auswuchs wird in zwei Hälften geteilt und dann in quadratische Stücke geschnitten, und jedes dieser Stücke wird in eine neue Vertiefung mit Feederzellen überführt. Es ist eine gute Idee, die Hälfte des Auswuchses unberührt zu lassen, damit Sie eine kontinuierliche Quelle von Zellen haben, zu denen Sie zurückkehren können, um Ihre Zellen zu amplifizieren und alle Passagen, die Sie durchführen, zu sichern.

Für die ersten zwei bis drei Passagen. Es ist eine gute Idee, auf diese Weise mechanisch zu passieren und die Zellen schließlich an die enzymatische Dissoziation anzupassen, um eine effizientere Verpackung zu erzielen. Unser Labor leitet konsequent humane embryonale Stammzelllinien ab, um sie zu verwenden und die Entwicklung und Differenzierung zu verstehen.

Diese Linien werden auch weltweit an Stammzellforscher vertrieben. Ich denke, es gibt vier Hauptfaktoren, die den Erfolg der Ableitung beeinflussen. Der erste hat mit der Qualität des Embryos zu tun, die auch vom genetischen Hintergrund abhängt, davon, wie gut die Embryonen eingefroren und aufgetaut wurden, und auch von der Qualität der In-vitro-Kultur bis zum Derivationsstadium bei der Blastenhilfe.

Der zweite Faktor ist wahrscheinlich die Qualitätsintegrität der inneren Zellmasse nach der Isolierung, und dies kann von der Technik abhängen, die zur Isolierung der inneren Zellmasse verwendet wird, und kann auch von Erfahrung und Geschicklichkeit abhängen. Der dritte Faktor ist, wie gut sich die isolierte innere Zellmasse an die Feeder-Schichten bindet, und der vierte Faktor ist das Auswachsen dieses ICM-Isolats. Ich glaube nicht, dass es technisch ein schwieriger Prozess ist.

Es braucht nur ein bisschen Übung. In der Tat ist jeder Schritt ziemlich einfach, solange Sie also das Protokoll mit ein wenig Übung befolgen können, denke ich, dass jeder dies tun kann. Was wir im Labor herausgefunden haben, ist, dass jede Zeile ein bisschen anders ist, aus Gründen, von denen wir nicht ganz sicher sind, ob wir sie verstehen.

Wenn Sie zum Beispiel das Differenzierungspotenzial von 10 Linien testen würden, könnten sich vielleicht zwei oder drei dieser Linien zu dem Zelltyp entwickeln, an dem Sie interessiert sind. Ich vermute, dass diese Unterschiede mit dem Stadium zu tun haben, in dem sich die Zellen befanden, die embryonalen Stammzelllinien wurden abgeleitet, das Stadium des Embryos, das heißt, sowie mit der manuellen Handhabung dieser Zellen. Ich denke, dass ihre Eigenschaft manchmal die Heterogenität der Zelllinien verändert und ihr Potenzial etwas ist, das jeder Stammzellforscher im Auge behalten muss.

Auch hier weiß ich nicht, was die Ursache dafür ist, aber als Beispiel für meine Forschung ist es unser Ziel, insulinproduzierende Betazellen der Bauchspeicheldrüse herzustellen. Der erste Schritt zur Herstellung dieser Art von Zelllinie besteht darin, Endoderm aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen, und in einem Vergleich von 10 bis 20 Linien fanden wir heraus, dass ein oder zwei dieser Linien effizient Endoderm erzeugen können, während die Hälfte von ihnen vielleicht weniger effizient Endoderm erzeugen kann, und einige von ihnen können Endoderm überhaupt nicht sehr gut erzeugen. Durch diesen ersten Screening-Prozess selektieren wir also Zellen, die eine höhere Tendenz zur Bildung des interessierenden Zelltyps haben, und wir verfolgen die verbleibende Differenzierung anhand dieser Zelltypen.

Die erste Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen wurde 1998 von Thompson Etal berichtet, und im Jahr 2004 berichtete unser Labor über die Gewinnung von 17 neuen humanen embryonalen Stammzelllinien. Durch die Änderung dieser veröffentlichten Protokolle, und diese Änderungen dienten eigentlich nur dazu, den Ableitungsprozess zu rationalisieren. Sie bestehen aus Veränderungen in der Zusammensetzung des Mediums, der Art und Weise, wie die Zellen durchgelassen werden und der Art und Weise, wie sie gefroren aufgetaut werden.

Seitdem suchen wir bei jeder Ableitung nach neuen Wegen, um das Protokoll und die Ableitungsrate zu verbessern. Zum Beispiel erforscht unser Labor alternative Wege, um die innere Zellmathematik zu isolieren, indem wir keine Xeno-Reagenzien wie den Kaninchen-Antikörper oder das Meerschweinchen-Sero-Komplement verwenden, sondern die innere Zellmasse eher mechanisch heraussezieren. Es bleibt zu hoffen, dass diese Methoden zumindest zu einer vergleichbaren, wenn nicht sogar besseren Möglichkeit führen, die innere Zellmasse zu isolieren.