Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur photodynamischen Therapie, auch bekannt als PDT, zu beantworten. Zu den Fragen, die mit dieser Methode beantwortet werden können, gehören die Dauer der Inkubation eines Photosensibilisators oder die Verwendung verschiedener Parameter im Experiment, wie z. B. die Änderung der Temperatur durch Erhitzen oder Abkühlen der Zellen. Diese Technik kann dazu beitragen, die In-vitro-Entwicklung neuartiger Photosensibilisatoren, Protokolle und Indikationen für die PDT zu erleichtern.

Beginnen Sie damit, zweimal 10 bis die vierte Zellzahl in zwei Millilitern Kulturmedium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit steriler Technik für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu plattieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit mindestens zwei Millilitern PBS und behandeln Sie die Kulturen mit Null-, Nullkomma-, Ein- oder Zwei-Millimeter-Verdünnungen von frisch zubereitetem 5-ALA. Stellen Sie die Platte dann für 30 Minuten auf einen 36-37 Grad Celsius warmen Heizblock, der vor Licht geschützt ist.

Während des Eingriffs empfehlen wir, dass die Forscher während der Inkubationsphase einen Heizblock verwenden, um eine konstante Temperatur während der gesamten Inkubationszeit zu erreichen. Zusätzlich empfehlen wir, die Zellen während der Inkubationszeit mit Alufolie abzudecken, um eine frühzeitige Aktivierung des Photosensibilisators zu verhindern. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in jeder Vertiefung mit zwei Millilitern PBS.

Und frischen Sie die Kulturen mit zwei Millilitern frischem Nährmedium für die Bestrahlung mit blauem Licht auf. Bevor Sie die Zellen bestrahlen, erwärmen Sie das Blaulichtgerät bei einer Ausgangswellenlänge von 417 Nanometern für einen 1.000-Sekunden-Zyklus und verwenden Sie ein Photometer, um die Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche zu messen, indem Sie den Abstand des Lichts anpassen, um die geeignete Bestrahlungsstärke entsprechend der Intensität der Lichtquelle zu erreichen. Legen Sie dann die mit 5-ALA behandelten Zellen für 1.000 Sekunden auf eine schwarze Oberfläche unter blauem Licht, um eine Gesamtfluenz von 10 Joule pro Quadratzentimeter zu erreichen.

Während der Photoaktivierung empfehlen wir, die Zellen auf eine schwarze Oberfläche zu legen, um Lichtreflexionen und ungleichmäßige Dosierung zu vermeiden. Am Ende der Phototherapie-Behandlung waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit zwei Millilitern PBS und lösen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung ab. Nach drei bis fünf Minuten bestätigen Sie die Ablösung und deaktivieren das Trypsin mit 10%FBS und PBS.

Übertragen Sie die Zellen aus jeder Vertiefung in einzelne Fünf-Milliliter-Durchflussröhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Geben Sie 200 Mikroliter Fließpuffer mit konjugiertem Annexin-V-Antikörper zu jeder Probe. Suspendieren Sie die Zellen erneut und legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in den Inkubator, um eine Annexin-V-Bindung zu ermöglichen.

Am Ende der Inkubation fügen Sie jeder Probe drei Mikroliter 7-AAD hinzu und inkubieren Sie erneut fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Probenanalyse, die gemäß den standardmäßigen durchflusszytometrischen Analyseprotokollen durchgeführt wird. Nach fünf Behandlungen mit ALA- und Blaulicht-Phototherapie wird ein dosisabhängiger Anstieg der Zellapoptose beobachtet. Um den Prozentsatz der Zellen zu berechnen, die sich einer Apoptose unterziehen, wird der Prozentsatz der Zellen in den Quadranten Annexin-V hoch, 7-AAD niedrig und Annexin-V hoch, 7-AAD hoch addiert.

Inkonsistenzen in der Länge der fünf ALA-Inkubationsperioden, der Inkubationstemperatur oder der Bestrahlungsdosis der Photoaktivierung können die Wirksamkeit der Phototherapie verändern, was beispielsweise zu einem temperaturabhängigen Anstieg der Apoptose führt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken, einschließlich RTQPCR und Western Blot, durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie PDT die Genexpression und Proteinaktivität verändert. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die sich für photodynamische Therapie interessieren, die Auswirkungen auf Hautkrebszellen und andere Hautkrankheiten in vitro zu entdecken.