Name: Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Lernen Sie einen In-vitro-Ansatz zur photodynamischen Therapie mit 5-ALA und Blaulicht zur Induktion der Apoptose in Hautkrebszellen. Diese Methode ermöglicht die Optimierung von Behandlungsparametern für verbesserte therapeutische Strategien.

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Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Platte 20.000 Zellen in 2 mL Kulturmedium in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte mit steriler Technik in eine biologische Kabinett.</li>
	<li>Platz 6-Well Platten in einem befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) 24 Stunden damit die Zellen an Platten halten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Photosensitizers für Behandlung der Zellen
<ol><li>0,5, 1 und 2 mM 5-ALA-Lösungen in Kulturmedium vorzubereiten. Wenn fötale bovine Serum (FBS) zutat Kulturmedium ist, vorzubereiten und behandeln Zellen mit 5-ALA in Kulturmedium Lösung mit 0,1 % FBS für Inkubationen. 11 , 12 In diesem Fall SCC-13 Zellen FBS, erfordern keine so 5-ALA direkt Keratinozyten serumfreien Medium ergänzt mit bovinen Hypophysen-Extrakt und epidermalen Wachstumsfaktor hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit mindestens 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS und 2 mL 0, 0,5, 1 oder 2 mM 5-ALA-Lösungen in separaten Platten oder Brunnen.</li>
	<li>Inkubation der Zellen mit 0, 0,5, 1 oder 2 mM 5-ALA auf einem 36 bis 37 ° C heizen Block für 30 min. schützen die Zellen vor Belichtung während der Inkubation mit Aluminiumfolie.</li>
	<li>Aspirieren Sie die 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA-Lösungen und waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS.</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS und 2 mL Kulturmedium für blaue Lichteinstrahlung.</li>
</ol>3. blaue Licht Phototherapie
<ol><li>Vor der Bestrahlung von Zellen, aktivieren Sie das blaue Licht Gerät (z.B., Light Emitting Diode, Leuchtstofflampen oder Halogenlicht) und führen Sie einen Zyklus lang (1.000 s) zum Aufwärmen des Gerätes. Das blaue Licht Gerät hätte eine Output-Wellenlänge von 417 + /-5 nm. Wodurch das Gerät für einen Zyklus vor der Behandlung laufen sorgt dafür, dass das blaue Licht-Wellenlänge und Bestrahlungsstärke innerhalb der photoaktivierungen-Phase konsistent sind.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Photometer zur Messung der Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche. Die blaue Licht Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche sollte 10 mW/cm2. Der Abstand zwischen dem Licht und der Zellen müssen möglicherweise angepasst werden, um eine Bestrahlungsstärke von 10 mW/cm2 abhängig von der Intensität der Lichtquelle zu erreichen.</li>
	<li>Legen Sie 0, 0.5, 1 und 2 mM ALA Behandlungsgruppen auf eine schwarze Fläche unter der blauen Lichtquelle. Bestrahlen die Zellen mit blauem Licht für 1.000 s (16 min und 40 s) für eine totale Fluence von 10 J/cm2. Nach blauen Licht photoaktivierungen sind die Zellen für die Analyse bereit.</li>
</ol>4. Erhebung und Färbung
<ol><li>Bereiten Sie Flow-Puffer nach Herstellerrichtlinien (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Zellen mit 2 mL PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und lassen Sie Zellen, ca. 3-5 Minuten zu lösen. Die Zellen können unter dem Mikroskop Zelle Ablösung bestätigen untersucht werden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Kulturmedium (oder PBS) mit 10 % fötalen Rinderserum, die Trypsin zu deaktivieren.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension in beschrifteten 5 mL Messrohre.</li>
	<li>Drehen Sie 5 mL strömungsrohr in einer Zentrifuge bei 201 X g für 5 min. Aspirat Lösung ohne Zelle Pellet.</li>
	<li>Jede Probe 200 µL fließen Puffer mit konjugierten annexin V Antikörper (1 µL annexin v pro 39 µL fließen Puffer) hinzufügen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen und in den Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) für 20 min annexin V Bindung zu ermöglichen.</li>
	<li>Jede Probe 3 µL 7-AAD hinzufügen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>5. durchflusszytometrischen Analyse
<ol><li>Flow Cytometer Hersteller Richtlinien für die Aufstellung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Erfassen Sie und analysieren Sie Proben mit Durchflusszytometrie. 13
</li>
	<li>Führen Sie statistische Vergleich Behandlungs-und Kontrollgruppen mit Varianzanalyse (ANOVA)14. Vergleichen Sie die Mittel von den Behandlungsgruppen zum Mittelwert des Steuerelements mit einem Dunnett-Test für die post-Hoc Analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
<li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li>
<li>Goldberg, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18940541">Photodynamic therapy in skin rejuvenation.</a> Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).</li>
<li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris%3A+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice%3A+Part+I.+Acne+vulgaris%3A+When+and+why+consider+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li>
<li>Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photodynamic+therapy+in+acne%3A+An+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).</li>
<li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5650/annexin-v-and-propidium-iodide-labeling">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
<li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm403505s">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li>
<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/Sun Pharma 5-ALA und dem BLU-U leichte Gerät zur Verfügung. Dieses Manuskript wurde von Dr. Jagdeo Restwert unterstützt Finanzierung. Den Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des US-Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten.

Gab es ein deutlichen Anstieg der SCC-13 Apoptose nach 30 min Inkubationen von 0,5, 1 und 2 mM 5-ALA gefolgt von 1.000 s von blauem Licht. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Untersuchungen zeigen, dass 5-ALA Inkubationen von 30 min, gefolgt von blauem Licht Aktivierung führt zu eine dosisabhängige Zunahme des Anteils der fibroblastenzellen Apoptose12, 14.
Diese experimentellen Umgang mit Studium PDT hat Vorteile und Einschränkungen. Die beschriebenen Methoden entsprechen den klinischen Praxis als handelsübliche PS und Lichtquelle dienten. Forscher können die Methoden mit verschiedenen Zelltypen, PSs, Lichtquellen und Bestrahlung Parameter anpassen. Allerdings gibt es Grenzen dieses Ansatzes, da dieses Protokoll für adhärente Zellen kultiviert in einem monomolekularen Film konzipiert wurde. In der klinischen Praxis können Unterschiede im Gewebe Architektur oder Krankheit Pathologie (z.B. Hyperkeratose oder Fibrose) PS Aufnahme verringern oder ein leichtes Eindringen15. Infolgedessen können die Behandlung Dosen und experimentelle Befunde nicht direkt in die klinische Praxis entsprechen. Sphäroid Tumormodellen und Mikrofluidik-Chip sind als Methoden genauer Tumor Mikroumgebungen16,17,18replizieren untersucht worden. Sphäroide haben innere und äußere zelluläre Nischen, die differentiell integrieren die Photosensibilisatoren und heterogener Tumor Architektur darstellen. Andere Forscher haben mikrofluidischen Chips auf Bildschirm Behandlungsbedingungen und vaskuläre Auslieferung von Photosensibilisatoren verwendet. Mikrofluidische Chips können jedoch zu kostspielig oder schwierig zu implementieren für Forscher nicht mit der Technik vertraut sein. Darüber hinaus können Sphäroide und mikrofluidischen Chips nicht die klinische Behandlung von Hautkrebs wider Photosensibilisatoren in denen direkt an die Tumor-Oberfläche ohne vaskuläre Verbreitung angewendet werden. Forscher müssen die vor- und Nachteile der Monolayer Kultur, Sphäroid Tumormodellen und mikrofluidischen Chips für Studium PDT in verschiedenen Krankheiten Systeme zu bewerten. Da gibt es keine Immunzellen oder extrazelluläre Matrix, ist es nicht möglich festzustellen, wie PDT komplexe Zell-Zell-Interaktionen auswirkt. Forscher müssen in Vitro experimentellen Ergebnisse mit Tiermodellen und klinischen Studien bestätigen. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen.
Temperatur ist bekannt, die Wirksamkeit von PDT19zu ändern. Eine Studie zeigte, dass Zelltod, 5-ALA-Aufnahme, PP-IX Bildung und Freisetzung von Zytokinen durch Inkubation der Zellen mit 5-ALA bei Temperaturen bis auf 44 ° C19verbessert werden können. Inkubation Temperaturen über 44 ° C zu thermisch induzierte Zelltod führen können, und Inkubation Temperaturen unter 20 ° C können nicht führen zu erheblichen 5-ALA-Aufnahme und Akkumulation19. Es wird empfohlen, Forscher PS Inkubationen auf eine Temperatur regulierbare Heizung-Block bei einer konstanten Temperatur zu steuern für potenziell verwirrende thermische Effekten führen. Darüber hinaus ist es wichtig, für eine ausreichende Menge an Zeit, um die Umwandlung von 5-ALA in PP-IX ermöglichen dem Photosensitizer inkubieren. In diesem Protokoll wurden SCC-13 Zellen mit 5-ALA für 30 min inkubiert, die erfolgreich Zelle Apoptose induziert. Wir haben bereits gezeigt, dass eine 10 min Inkubation von 5-ALA Apoptose in Fibroblasten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Fibroblasten11,14nicht signifikant erhöhen. PP-IX beginnt in Maus Haut ansammeln, nach 5-ALA für sechs Minuten bei 37 ° c inkubieren ist Daher, nach zehn Minuten 5-ALA Inkubation möglicherweise nicht ausreichend Anhäufung von PP-IX, Zelle Apoptosis20zu induzieren. Es wird empfohlen, eine minimale Inkubationszeit von 20 bis 30 min für 5-ALA basierend auf unseren bisherigen Studien11,14. Forscher müssen möglicherweise Inkubationszeit basierend auf das Labor, Photosensitizer, Zelltyp und klinischer Indikation zu optimieren. Antikörper-Titration und Optimierung-Experimente können für beste Ergebnisse mit Hersteller-Richtlinien durchgeführt werden. Andere Tests von Interesse können nach blauen Licht photoaktivierungen einschließlich Dihydroethidium Fluss durchflusszytometrischen Quantifizierung von ROS durchgeführt werden. 14
Variation in Höhe von Licht pro Flächeneinheit (d. h. Bestrahlungsstärke) geliefert und die gesamten Bestrahlungsdosis (d. h. Fluence) in der photoaktivierungen Phase beeinträchtigen ROS-Bildung und Zelle Apoptosis21. Die Beziehung zwischen Fluence, Bestrahlungsstärke und Zeit kann durch die folgende Gleichung beschrieben:
Fluenz (J/cm2) = Bestrahlungsstärke (W/cm2) x Zeit (s)
Fluenz Zeit abhängig ist, kann Verlängerung oder Verkürzung der photoaktivierungen Phasen Wirksamkeit der Behandlung ändern. Die Bestrahlungsstärke ist proportional zum Abstand zwischen der Lichtquelle und das Zielgewebe im Quadrat. Infolgedessen, wenn das Licht zu weit weg ist, möglicherweise nicht genügend Lichtenergie geliefert, das Zielgewebe begeistern die PS. Alternativ kann die Bestrahlungsstärke um Licht reflektiert die umgebenden Flächen erhöht werden. Daher empfehlen wir leichte Bestrahlungen mit den Zellplatten Kultur gelegt auf eine schwarze Fläche, Lichtreflexion zu verhindern. Forscher können kommerziell verfügbar oder FDA-zugelassene blaue Leuchtdioden und fluoreszierende Geräte für Versuchszwecke PDT erwerben, sondern diese Geräte möglicherweise verschiedene Leistungsstufen und Lichtfeld Einheitlichkeit. Eine Wellenlänge-spezifischen Photometer sollte verwendet werden, um die Bestrahlungsstärke auf der Zelloberfläche und Gleichmäßigkeit des Lichtfeldes vor jedem Experiment für konsistente Ergebnisse zu messen. Ein handelsüblicher Diffusor kann zur Feld Einheitlichkeit zu erhöhen bei Bedarf.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir einen in-vitro- Ansatz für die Untersuchung von PDT durch Detaillierung Theorie, experimentelle Methoden, Einschränkungen, potenzielle Fallstricke und Empfehlungen für die Optimierung beschrieben. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Die Federal Drug Administration (FDA) genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen (AK) und klinische Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris1,2. Aufstrebenden nicht-dermatologische Anwendungen für PDT sind Behandlung von Magen-Darm-, Prostata- und gynäkologischen Krebserkrankungen3. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasive und minimale Nebenwirkungen und Narbenbildung2zugeordnet.
Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und akkumulieren intrazellulär2erlaubt. In den USA ist aktuell 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) häufig zur Behandlung von AKs. Während der Inkubation wird Phase 5-ALA in Protoporphyrin IX (PP-IX) über den Häm-Biosynthese-Weg im eingebauten Zellen3umgewandelt. Krebs und Pre-Krebszellen gesunken Ferrochelatase Aktivität, die das Endprodukt Protoporphyrin IX (PP-IX) umwandelt, Häm. Krebs Zellen ansammeln infolgedessen PP-IX im Vergleich zu normalen Zellen4,5. Diese Anhäufung von PP-IX in Krebs und Pre-Krebszellen im Verhältnis zu dem umgebenden Gewebe ermöglicht eine PDT ein gezieltes Vorgehen mit minimalen Nebenwirkungen zu sein. Lichteinstrahlung führt zu reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation wenn Sauerstoff angeregten Elektronen aus PP-IX annimmt. PP-IX hat eine Spitze Absorption im UV-Spektrum mit kleineren Gipfel während des sichtbaren Lichtspektrums, darunter blau und rot Licht2. ROS-Bildung führen letztlich zu zellapoptose, Membran Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz6,7,8,9 , 10.
PDT wurde in den 1970er Jahren entwickelt und ist eine sich entwickelnde therapeutische Modalität3. Das Protokoll FDA-Zulassung für die Behandlung von AKs empfiehlt 5-ALA Haut Inkubation für 14 – 18 h, aber 1 bis 2 h Inkubationen sind weit verbreitet in der klinischen Praxis2. In Vitro, haben wir gezeigt, dass kürzere 15 min 5-ALA Inkubationen Fibroblasten zellapoptose im Vergleich zu unbehandelten Fibroblasten11,12erhöhen können. Darüber hinaus werden neuartige Chlorin, Phthalocyanin und Nanopartikel basierende PSs untersucht, um PDT Wirksamkeit3zu verbessern. Hier präsentieren wir eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine anhaftende Plattenepithelkarzinom Zellen. In diesem Protokoll sind SCC-13 Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-ALA für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Das primäre Ergebnis Maß ist Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Durchflusszytometrie gemessen. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit anderen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Vorbereitung der zusätzliche Kontrollgruppen möglicherweise erforderlich, einschließlich ungefärbten, einzelne Fluorophor gebeizt, negative und positive Kontrollen für Durchflusszytometrie. Eine umfassende Überprüfung der Theorie, Protokolle, Versuchsplanung und gating für Apoptose/Nekrose Durchflusszytometrie finden Sie ebenfalls13.

<table><tbody><tr><td>Keratinozyten-Serum freies Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Nährmedium für SSC-13 Zellen</td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Mögliches Kulturmedium für andere Zelltypen</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blaue Lösung, 0,4 %</td> <td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Für die Zellzählung und -beschichtung&nbsp;</td></tr><tr><td>BLU-U Leuchte&nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Anfrage beim Hersteller</td><td>Andere blaue LED-, Leuchtstofflampen oder Halogenlampen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Anfrage vom Hersteller</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>FCCH100108&nbsp;</td><td>Propidiumiodid kann 7-AAD ersetzen. Kommt mit Annexin-V, 7-AAD und Durchflusspuffer</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Anfrage vom Hersteller</td><td>Jedes Durchflusszytometer kann verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Zählkammer</td><td>Häusser</td><td>3120</td><td>Für Zellzählung und Beschichtung&nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Anfrage vom Hersteller</td><td>Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr></tbody></table>

ein in-vitro- ansatz zur photodynamischen therapie

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Der Federal Drug Administration genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen und klinischen Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasiv, und mit minimalen Nebenwirkungen verbunden und erschrecken. Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und intrazellulär sammeln. Nachfolgende Lichtbestrahlung induziert reaktive Sauerstoff Spezies Formation, die letztlich zur zellapoptose, Membran-Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz führen. Hier präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine adhärente Zell-Linie. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit verschiedenen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Plattenepithelkarzinom Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Die primären Endpunkt Maßnahme war Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D Durchflusszytometrie gemessen. Es gab eine dosisabhängige Zunahme der zellapoptose nach 30-minütiger Inkubation von 5-Ala. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.

Nach SCC-13 Zellen waren für 30 min mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubiert und bestrahlt mit 1.000 s blaues Licht, gab es eine dosisabhängige Zunahme der zellapoptose. Insgesamt Apoptose (Mittelwert ± Standardfehler von Mittelwert) betrug 3,94 ± 0,34 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 und 38.33 ± 1,81 nach 30 min Inkubation mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA, bzw. 1000 Sekunden blau Licht (Abbildung 1). Den mittlere Anteil der Apoptotic Zellen unter 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Gruppen ANOVA verglichen. Zellen mit 1 und 2 mM 5-ALA behandelt hatte eine deutliche Steigerung bei der Apoptose der Zelle im Vergleich zu 0 mM 5-ALA behandelten Zellen. Abbildung 2A zeigt repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Anspritzung forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) für SCC-13 Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-Ala Der Kreis Anspritzung umschließt die SCC-13-Zell-Population. Für dieses Experiment 7500 Ereignisse wurden gesammelt und das SCC-13 Zelle Bevölkerung Tor gefangen zu mindestens 90 % der Ereignisse. Abbildung 2 b zeigt eine repräsentative Handlung des 7-AAD auf der x-Achse und annexin V auf der y-Achse. Die Zell-Populationen sind in vier Quadranten gated (Q1 bis Q4) apoptotische Zellen zu unterscheiden. Q1 (hohe annexin V, niedrige 7-AAD) stellt Zellen frühen Apoptose unterziehen. Q2 (hohe annexin V, hohe 7-AAD) repräsentieren Zellen späten Apoptose und Nekrose. Q3 (niedrige annexin V, hohe 7-AAD) stellt Zellen Nekrose. Q4 (niedrige annexin V, niedrige 7-AAD) stellt Zellen nicht unterziehen Apoptose und Nekrose. Um den Prozentsatz der Zellen Apoptose zu berechnen, haben wir den Prozentsatz der Zellen in Q1 und Q2. Inkonsistenz in 5-ALA Inkubation Periodenlänge, Inkubationstemperatur oder photoaktivierungen Bestrahlungsdosis kann PDT Wirksamkeit ändern. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative annexin V und 7-AAD Fluss durchflusszytometrischen Handlung, wenn die Inkubationstemperatur variiert wird (d.h., 27, 36 und 42 ° C). Es gab eine abhängige Temperaturerhöhung in Apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Abbildung 1: dosisabhängige Zunahme der Apoptose nach 30-minütiger Inkubation von 5-Ala 5-ALA inkubiert bei 36 ° C für 30 Minuten gefolgt von 1.000 s von blauem Licht in SCC-13 Zellen. Balken stehen für durchschnittliche prozentuale annexin V positive Zellen in jeder Behandlung und Kontrollgruppe. Experimente wurden in technischen dreifacher durchgeführt. Statistischer Signifikanz wurde bestimmt durch ANOVA, p &lt; 0,05, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter Flow Cytometry Grundstücke. (A) repräsentative forward Scatter vs. Seite zytometrie Streudiagrammen in willkürlichen Einheiten (AU) für x- und y-Achse für 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Zellen. Für dieses Experiment 7500 Ereignisse wurden gesammelt und das SCC-13 Zelle Bevölkerung Tor erfasst 90 % der Ereignisse. (B) repräsentative annexin V vs. 7-AAD Durchflusszytometrie Grundstücke in AU für x- und y-Achse für 0, 0.5, 1 und 2 mM 5-ALA inkubierten Zellen. Q1: frühen Apoptotic Zellen, Q2: späten Apoptotic/nekrotischen Zellen, Q3: nekrotische Zellen und Q4: lebensfähige Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Abbildung 3: 5-ALA bei unterschiedlichen Temperaturen Bebrüten PDT Wirksamkeit vorbehalten. Repräsentative annexin V vs. 7-AAD Durchflusszytometrie Grundstücke in AU für x- und y-Achse für SCC-13 Zellen inkubiert mit 0,5 mM 5-ALA auf 27, 36 und 42 ° C. Q1: frühen Apoptotic Zellen, Q2: späten Apoptotic/nekrotischen Zellen, Q3: nekrotische Zellen und Q4: lebensfähige Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur photodynamischen Therapie, auch bekannt als PDT, zu beantworten. Zu den Fragen, die mit dieser Methode beantwortet werden können, gehören die Dauer der Inkubation eines Photosensibilisators oder die Verwendung verschiedener Parameter im Experiment, wie z. B. die Änderung der Temperatur durch Erhitzen oder Abkühlen der Zellen. Diese Technik kann dazu beitragen, die In-vitro-Entwicklung neuartiger Photosensibilisatoren, Protokolle und Indikationen für die PDT zu erleichtern.Beginnen Sie damit, zweimal 10 bis die vierte Zellzahl in zwei Millilitern Kulturmedium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit steriler Technik für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu plattieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit mindestens zwei Millilitern PBS und behandeln Sie die Kulturen mit Null-, Nullkomma-, Ein- oder Zwei-Millimeter-Verdünnungen von frisch zubereitetem 5-ALA. Stellen Sie die Platte dann für 30 Minuten auf einen 36-37 Grad Celsius warmen Heizblock, der vor Licht geschützt ist.Während des Eingriffs empfehlen wir, dass die Forscher während der Inkubationsphase einen Heizblock verwenden, um eine konstante Temperatur während der gesamten Inkubationszeit zu erreichen. Zusätzlich empfehlen wir, die Zellen während der Inkubationszeit mit Alufolie abzudecken, um eine frühzeitige Aktivierung des Photosensibilisators zu verhindern. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in jeder Vertiefung mit zwei Millilitern PBS.Und frischen Sie die Kulturen mit zwei Millilitern frischem Nährmedium für die Bestrahlung mit blauem Licht auf. Bevor Sie die Zellen bestrahlen, erwärmen Sie das Blaulichtgerät bei einer Ausgangswellenlänge von 417 Nanometern für einen 1.000-Sekunden-Zyklus und verwenden Sie ein Photometer, um die Bestrahlungsstärke an der Zelloberfläche zu messen, indem Sie den Abstand des Lichts anpassen, um die geeignete Bestrahlungsstärke entsprechend der Intensität der Lichtquelle zu erreichen. Legen Sie dann die mit 5-ALA behandelten Zellen für 1.000 Sekunden auf eine schwarze Oberfläche unter blauem Licht, um eine Gesamtfluenz von 10 Joule pro Quadratzentimeter zu erreichen.Während der Photoaktivierung empfehlen wir, die Zellen auf eine schwarze Oberfläche zu legen, um Lichtreflexionen und ungleichmäßige Dosierung zu vermeiden. Am Ende der Phototherapie-Behandlung waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit zwei Millilitern PBS und lösen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung ab. Nach drei bis fünf Minuten bestätigen Sie die Ablösung und deaktivieren das Trypsin mit 10%FBS und PBS.Übertragen Sie die Zellen aus jeder Vertiefung in einzelne Fünf-Milliliter-Durchflussröhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Geben Sie 200 Mikroliter Fließpuffer mit konjugiertem Annexin-V-Antikörper zu jeder Probe. Suspendieren Sie die Zellen erneut und legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in den Inkubator, um eine Annexin-V-Bindung zu ermöglichen.Am Ende der Inkubation fügen Sie jeder Probe drei Mikroliter 7-AAD hinzu und inkubieren Sie erneut fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Probenanalyse, die gemäß den standardmäßigen durchflusszytometrischen Analyseprotokollen durchgeführt wird. Nach fünf Behandlungen mit ALA- und Blaulicht-Phototherapie wird ein dosisabhängiger Anstieg der Zellapoptose beobachtet. Um den Prozentsatz der Zellen zu berechnen, die sich einer Apoptose unterziehen, wird der Prozentsatz der Zellen in den Quadranten Annexin-V hoch, 7-AAD niedrig und Annexin-V hoch, 7-AAD hoch addiert.Inkonsistenzen in der Länge der fünf ALA-Inkubationsperioden, der Inkubationstemperatur oder der Bestrahlungsdosis der Photoaktivierung können die Wirksamkeit der Phototherapie verändern, was beispielsweise zu einem temperaturabhängigen Anstieg der Apoptose führt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken, einschließlich RTQPCR und Western Blot, durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie PDT die Genexpression und Proteinaktivität verändert. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die sich für photodynamische Therapie interessieren, die Auswirkungen auf Hautkrebszellen und andere Hautkrankheiten in vitro zu entdecken.

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