Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering og identifikation af de humane limbale nicheceller.
Abstract
Her rapporterer vi en standardprocedure til isolering og identifikation af limbal nicheceller (LNC'er). Limbusvæv opnået fra en øjenbank blev brugt til LNCs isolering. Vævet blev opdelt i 12 stykker under aseptiske forhold og fordøjet i 18 timer ved 37 °C i cellekulturinkubatoren under anvendelse af collagenase A for at opnå celleklynger med LNC'er og limkeepitelstamceller. Celleklyngerne blev yderligere fordøjet i 15 minutter ved 37 °C ved anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA for at opnå enkeltceller og derefter dyrket i modificeret embryonalt stamcellemedium (MESCM) på en plastoverflade belagt med 5% Matrigel. Celler blev passeret ved 70% sammenløb, og LNC'er blev identificeret ved anvendelse af immunofluorescens, kvantitativ PCR (qPCR) i realtid og flowcytometri. Primære LNC'er blev isoleret og passeret mere end 12 gange. LNC'ernes spredningsaktivitet fra P4 til P6 var den højeste. LNC'er udtrykte højere stamcellemarkører end BMMSC'er (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR og PDGFRβ). Desuden viste resultaterne, at P4 LNC'er ensartet udtrykte VIM, CD90, CD105 og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, som kunne bruges som markør til identifikation af LNC'er. Flowcytometrisk analyse viste, at ca. 95%, 97%, 92% og 11% af LNC'erne udtrykte henholdsvis CD73, CD90, CD105 og SCF, mens de var 68%, 99%, 20% og 3% i BMMSC'er. Standardprocessen for LNC-isolering og -identifikation kunne udgøre et pålideligt laboratoriegrundlag for udbredt anvendelse af LNC'er.
Introduction
Forekomsten af hornhindeepitelstamcellemangel (CESD), også kaldet limbal stamcellemangel (LSCD)1, og hornhindepitelregenerering (CES) bliver mere og mere presserende på grund af hornhindeinfektion og skade. Hvis CESD ikke behandles korrekt, kan det føre til blindhed, der kræver hornhindetransplantation. Som følge heraf bliver CES-regenerering mere betydningsfuld. Der er en gruppe af støttende celler kaldet limbal nicheceller (LNC'er), der giver væsentlig støtte til CES-funktion. Limbal stromale stamceller blev først isoleret af Polisetty et al.2 og identificeret af Xie et al.3 som LNC'er, der er lokaliseret i limbalepitel subjacent og stroma i limbus. LNC'er er den vigtigste understøttende stamcelle i hornhinderanden og med funktionen af knoglemarvsafledte MSC (BMMSC'er) og kan induceres til at udvikle sig til hornhindepitelceller og hornhindestromaceller osv.3,4,5,6,7. Tidligere undersøgelser viste, at stamcellekvaliteterne hos LNC'er er mere primitive end BMMSC8, som allerede er meget udbredt i klinikken. LNC'er kan endda blive den næste levedygtige mulighed efter MSC, især til behandling af CESD. Som vigtige støtteceller til CES er LNC'er også stamceller afledt af limbusens "niche" -struktur. LNC'er kan spille en central rolle i dedifferentieringen af modne hornhindeepitelceller (MCEC) til CES9. Undersøgelser af LNC'er er dog stadig relativt utilstrækkelige, og der er ingen konsensus om terminologi, isolering, oprensning, identifikation og karakteristika for LNC'er. Nogle forskere har navngivet LNC'er limbalbiopsiafledte stromale stamceller 10, limbal mesenkymale stamceller11, limbalfibroblaststamceller 12 og limbal mesenkymale stromale celler13. Da vækstegenskaberne ved LNC'er ikke er beskrevet i detaljer og på grund af deres lovende videnskabelige og kliniske anvendelser og kan være et af de vigtigste kliniske værktøjer i fremtiden, er det nødvendigt at opsummere isolering, oprensning, identifikation og karakteristika ved LNC'er.
Ifølge en tidligere undersøgelse14 er LNC'er hovedsageligt til stede ved limbalepitel subjacent og stroma i limbus. Denne protokol omfatter behandling af limbusvæv ved hjælp af kollagenase A, opnåelse af en klynge bestående af LEPC og LNC'er og fordøjelse af det i enkeltceller med 0,25% trypsin-EDTA (TE). LNC'er blev derefter selektivt dyrket i et modificeret embryonalt stamcellemedium (MESCM), der skulle renses. Protokollen rapporteret i dette papir er enkel og har høj effektivitet til at opnå humane LNC'er i store mængder.
Den detaljerede procedure for LNC-isolering, kultur og identifikation blev optaget i videoen for forskere, der er interesseret i LNC-undersøgelse, og det kan bekvemt gentages, når det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Limbusvæv fra donorer mellem 50 og 60 år blev opnået fra Røde Kors Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollen blev godkendt af Tongjis etiske komité og blev gennemført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.
1. Isolation
- Udtag limbusvæv fra mellemfristet hornhindelagringsmedium, og arbejd under aseptiske forhold på et ultrarent arbejdsbord.
- Skrab og fjern iris og endotel omkring hornhinden ved hjælp af et sterilt kirurgisk rundt blad.
- Skær limbusvæv i tolv lige store stykker med et kirurgisk blad med 1 mm tilbage på begge sider af hornhinden og sclera.
- Overfør limbusvæv til en 3,5 cm kulturplade, tilsæt 1 ml kollagenase A (2 mg / ml i DF-12-medium) for at nedsænke alt væv til fordøjelse.
- Sæt pladen i 37 ° C celleinkubatoren, fordøje limbalvævet i 18 timer.
BEMÆRK: Opfølgningsprocedurer udføres normalt den anden dag. - Forbered en 5% kældermembranmatrix (Matrigel) belagt 6-brønds kulturplade.
- Coat 5% kældermembranmatrix (opløst i MESCM [tabel 1]) i bunden af brønden.
- Forbered 200 μL og 1 ml spidser, et 15 ml centrifugalrør og en 6-brønds plade i en steriliseret pose.
- Den steriliserede pose (inklusive spidser og centrifugalrør) og en ny 6-brønds plade anbringes i -20 °C eller -80 °C i 20 minutter. Optø kældermembranmatrixen i køleskabet ved 4 °C.
- De forkølede spidser, centrifugalrøret og 6-brøndspladen tages ud af -20 °C eller -80 °C-miljøet, og udfør derefter følgende handlinger på det ultrarene arbejdsbord.
- Overfør 50 μL 5% kældermembranmatrix til 1 ml MESCM ved hjælp af en 200 μL spids, og bland dem forsigtigt og jævnt.
- Overfør 5% kældermembranmatrix (opløst i MESCM) til en brønd i en 6-brønds kulturplade ved hjælp af den forkølede 1 ml spids.
- 6-brøndspladen rystes forsigtigt og vandret, 6-brønds kulturpladen anbringes i celleinkubatoren med 37 °C i ca. 1 time, og næste trin udføres.
- Efter 18-timers fordøjelse skal du tage kollagenase A-fordøjet limbalvæv ud, kun nogle synlige små klynger og ufordøjet scleralvæv forbliver.
BEMÆRK: Højforstørrelsesmikroskopi afslører en klynge sammensat af mange tæt pakkede celler (inklusive LNC'er). - Brug en 200 μL pipettespids til at løsne klyngerne fra ufordøjet scleralvæv under stereomikroskopet.
- Overfør klyngerne til 3,5 cm kulturpladen og nedsænk dem i 0,25% TE, og placer derefter pladen i celleinkubatoren i 15 minutter.
- Tilsæt 1 ml MESCM med 10% knockout-serum for at stoppe cellefordøjelsen, og pipette forsigtigt op og ned for at resuspendere klyngerne i individuelle celler ved hjælp af en pipettespids på 1 ml.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml centrifugalrør og centrifuger ved 200 x g i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre celleudfældningen, og der tilsættes derefter 1 ml MESCM for at opslæmme cellerne igen.
- Pipetten pipetteres op og ned 2-3 gange, indtil bundcelleudfældningen er jævnt suspenderet i MESCM ved hjælp af 1 ml pipettespids, og tag 20 μL cellesuspension til celletælling.
- Overfør cellesuspensionen til den 5% kældermembranmatrixbelagte 6-brønds plade med en 1-ml pipettespids, og øg MESCM-volumenet til 2,5 ml.
- Ryst forsigtigt 6-brøndpladen vandret for at fordele cellerne jævnt.
- Overfør cellerne til kulturinkubatoren efter at være blevet afbildet og optaget. Observer og fotografer cellerne dagligt, og skift mediet hver 3-4 dage.
2. Identifikation af LNC
- Immunofluorescens farvning
- Fordøje LNC'erne fra bunden af pladen ved hjælp af 1 ml 0,25% TE i 5 minutter i 37 °C celleinkubatoren.
- Forrådnelsen afsluttes ved tilsætning af 1 ml MESCM (indeholdende knockout-serum), cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 min, og supernatanten suges forsigtigt.
- Der tilsættes 1 ml MESCM for at resuspendere cellerne i suspension. Forbered 80 μL cellesuspension (4 × 103 celler pr. dias) til 4 dias (20 μL / dias) og brug centrifugesystem til at deponere celler på mikroskopglas i henhold til producentens anvisninger.
- Fix celler (klæbet til dias i trin 3) ved hjælp af 4% paraformaldehyd i ca. 10 min, og permeabiliser derefter celler på diasene med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 min.
- Bloker cellerne i 1 time med 2% bovin serumalbumin (BSA), før de inkuberes med primære antistoffer (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) på en shaker natten over ved 4 °C. Efter inkubationen fjernes ubundne primære antistoffer ved vask (5 min/vask, 3x) objektglassene med PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
- Inkuber de tilsvarende sekundære antistoffer (æselanti-mus IgG sekundært antistof TRITC [1:1000], æselanti-kanin IgG FITC [1:500], æselanti-mus IgG 488 [1:300], æselantikanin IgG 594 [1:400]) i 1 time med passende IgG uspecifikke IgG-antistoffer. Det ubundne sekundære antistof fjernes ved hjælp af PBST (5 min/vask, 3x).
- Modbejdse kernerne med 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) og forsegl diasene.
- Udfør fluorescensbilleddannelse ved hjælp af et fluorescensmikroskop (forstørrelse: 400x; Eksponeringstid: 50 ms).
- Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qPCR)
- Tag RNA Isolation Kit for at ekstrahere det samlede RNA i henhold til producentens anvisninger.
- Brug et cDNA-transkriptionssæt med høj kapacitet til at vende transskribere 1-2 μg total RNA til cDNA.
- Revers transkription (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) og qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cyklusser) udføres i en 20 μL opløsning indeholdende cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), universal PCR Master Mix (10 μL) og ddH2O (til 20 μL).
- Brug den komparative CT-teknik (ΔΔCT)4,9 til at undersøge den relative genekspression.
3. Karakterisering af LNC
- Celletælling (hæmocytometer)
- Fordøje LNC'erne fra bunden af pladen ved hjælp af 0,25% TE i 5 minutter i 37 °C-celleinkubatoren.
- Forrådnelsen afsluttes ved tilsætning af 1 ml MESCM (indeholdende knockout-serum), cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 min, og supernatanten suges forsigtigt.
- Der tilsættes 1 ml MESCM for at resuspendere cellerne, og derefter tages 10 μL cellesuspension i et 0,5 ml centrifugerør. Tilsæt et lige stort volumen på 0,4% Trypan blå farvningsopløsning.
- Anbring 10 μL farvet cellesuspension på hæmocytometerets tælleområde og dæk det med et dæksel til tælling.
BEMÆRK: Antallet af celler i de fem midterste kvadratiske områder er defineret som "A"; celletallet i 1 ml beregnes som 5A × 104 × 2.
- Undersøgelse af LNC- og BMMSC-markører med flowcytometri15
- Detekter ekspressionen af SCF, CD73, CD90 og CD105 i LNC'erne og BMMSC'erne ved hjælp af flowcytometri 15 (2-4 ×10 6 hændelser / prøve, 2.000 celler blev opnået fra hver af prøverne, i alt 550.000 celler, der blev lukket samtidigt).
- Opsaml og pletter cellerne ved 20-30 °C i 15 minutter i en blokerende buffer (3% BSA og 0,05% Tween-20 i PBS) ved hjælp af forudmærkede antistoffer (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] og CD105 [1:50]) i henhold til kitinstruktionerne.
- Udfør fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse ved hjælp af et flowcytometer. I denne undersøgelse blev FACS Diva software og FlowJo software brugt. For hver prøve skal du registrere 10.000 hændelser og gate og analysere levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vækst af LNC
LNC'erne blev med succes isoleret i henhold til metoden til nedbrydning af kollagenase A (2 mg/ml) fordøjelse af hornhindeoskleralt randvæv, som beskrevet ovenfor (figur 1). I overensstemmelse med en tidligere rapporteret undersøgelse3, efter kollagenase A-fordøjelse, blev larvelignende klynger visualiseret under mikroskopet (figur 2). Andelen af spindelceller steg gradvist med cellepassagen. Spindelformede celler kunne vokse på coatede 5% kældermembranmatrixplader, i modsætning til deres modstykker dyrket på plast uden belagt kældermembranmatrix3. Celler fra P1 til P12 udviste en ensartet proliferativ hastighed med en cellefordoblingstid mellem 2 og 7 dage (tabel 2). I denne undersøgelse blev LNC'er dyrket til de 13 passager og 34 fordoblinger (figur 3)3. LNC'er blev dyrket fra primære celler (LNC P0); LNC P0 voksede langsomt og tog cirka 12 dage. LNC'er behøvede kun ca. 3 dage til passage i P1-P8, og vækstraten for LNC'er efter P9 faldt signifikant (tabel 2). Med hensyn til cellemorfologi var LNC'er spindelformede og runde i P0. Efter P3 var LNC'er spindelformede med samme morfologiske størrelse (figur 2). Omfanget af den samlede ekspansion blev målt som antallet af populationsfordobling fra P0 til P13 ved hjælp af følgende formel: antal cellefordoblinger (NCD) = log10 (y / x) / log102, hvor y er den endelige tæthed af celler og x er den oprindelige såtæthed af celler3. NCD repræsenterer vækstraten for LNC'erne (figur 3A). Fra NCD- og akkumulativ-NCD-kurverne (figur 3B) tog LNC'er mindst tid at stige eksponentielt og voksede hurtigst fra P3-P5 (figur 3). Efter P5 faldt cellevæksthastigheden betydeligt, NCD vendte tilbage til 1,32 i P13, og væksten stoppede næsten.
Identifikation af LNC
Efter LNC'ernes isolation og kultur var en anden vigtig opgave identifikation. LNC'er udtrykt for Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, ifølge aktuelle relevante undersøgelser af LNC'er (figur 4)9. Dobbelt immunfarvning LNC P4 afslørede, at disse celler konsekvent var Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (figur 4). qPCR afslørede også nedsat Pan-CK-ekspression i P2 og øgede Vim-, CD90-, CD105-, SCF- og PDGFR-transkripter i P3. Transskriptionsniveauer af Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFR steg dramatisk i P4 sammenlignet med P1 (p < 0,01) (figur 4)9.
Karakteristik af LNC
Yderligere analyse viste, at LNC'er udtrykte flere embryonale stamcellemarkører (ESC) (Nestin, Rex1 og SSEA4), mesenkymale stamcellemarkører (MSC) (CD73, CD90 og CD105) og nichecellemarkører (NC) (MSX1, P75NTR og PDGFRβ) (figur 5)15. Flowcytometri indikerede, at overfladeantigenkarakteristika for MSC'er, herunder CD73, CD90 og CD105, blev udtrykt i både LNC'er og BMMSC'er15. Procentdelene af LNC'er, der udtrykte CD73, CD90, CD105 og SCF, var henholdsvis ca. 95%, 97%, 92% og 11%, mens BMMSC'erne var henholdsvis 68%, 99%, 20% og 3%. Dette viser, at LNC'er udtrykker signifikant højere niveauer af MSC-positive markører CD73, CD105 og cytokin-SCF (p < 0,01) og et lignende niveau af CD90 (p > 0,05) sammenlignet med BMMSC'er (figur 6)15.
Figur 1: LNC'ernes isolationsproces . (A) Corneoscleral randvæv. (B) Klynger efter kollagenase A fordøjelse ved 37 °C i 18 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: P0 til P13 LNC'er dyrket på 5% kældermembranmatrixbelagt 6-brønds plade i MESCM. (Bar = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vækstmønsteret for LNC'er fra P0-P13. (A) NCD for LNC'er fra P0-P13; B) Den kumulative NCD for LNC'er fra P0-P13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunofluorescens og qPCR. Immunofluorescens og qPCR afslørede, at LNC'er ensartet udtrykte Vim, CD90, CD105, SCF og PDGFRβ, men ikke Pan-CK. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Zhu et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: LNC'er udtrykker flere ESC-, MSC- og NC-markører end BMMSC'er. P4 LNC'er og P4 BMMSC'er blev udsat for qPCR til transkriptionsekspression af ESC-markører (A), MSC og neurale kammarkører (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 og **p < 0,01). Immunfarvning af ESC-markører (C) og MSC, NC-markører (D), med nuklear modfarvning af Hoechst 33342. Skalastænger = 25 μm. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Li et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fluorescensaktiveret cellesortering af P4 LNC'er og BMMSC'er (A-F). Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse af MSC-markører, herunder CD73, CD90 og CD105 (n = 3). Denne figur er gengivet med tilladelse fra Li et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Koncentration af stamopløsning | Lydstyrke | Endelig koncentration | Opbevaringsmiljø |
| DME/F-12 1:1(1×) | Grundlæggende medium | 180 ml | 90% | 4 °C |
| KnockOutTMSR | - | 20 ml | 10% | -20 °C |
| Serumerstatning til ESC'er/iPSC'er | ||||
| Recominant human leukæmi hæmmende faktor (Lif) | 50 μg/ml | 40 μL | 10 ng/ml | -80 °C |
| Rekombinant human FGF-grundlæggende | 100 μg/ml | 8 μL | 4 ng/ml | -80 °C |
| ITS (insulin, transferrin, natriumselenit) | 500 μg/ml insulin | 2 ml | 5 μg/ml insulin | -20 °C |
| 500 μg/ml transferrin | 5 μg/ml transferrin | |||
| 500 ng/ml natriumselenit | 5 ng/ml natriumselenit | |||
| Gentamicin | 25 μg/ml | 2 ml | 50 μg/ml | 4 °C |
| Amfotericin B | 2500 μg/ml | 100 μL | 1,25 μg/ml | 4 °C |
Tabel 1: MESCM-formulering.
| Passage | Såtæthed (× 105 celler/cm2) | Endelig massefylde (× 105celler/cm2) | Kulturtid (dage) | Antal cellefordoblinger (NCD) | Akkumulerende NCD |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabel 2: Serielle passager af LNC på plast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhindens gennemsigtighed opretholdes typisk ved regelmæssig arrangement og fordeling af små fibre (25-30 nm i diameter) i hornhindestromaet, hvilket er afgørende for normal synsstyrke16. Der er 253 millioner synshandicappede på verdensplan, hvoraf 36 millioner er blinde17. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) betragter hornhindeblindhed som en af de alvorligste farer for menneskets syn og tegner sig for 5,1 % af al blindhed på verdensplan16. Hornhindepiteldefekt med normal CES kan helbrede hurtigt uden at efterlade et ar18. Det anslås, at mere end 12,7 millioner patienter verden over har behov for hornhindetransplantationer på grund af moderat til alvorligt synstab19; 30 % af fejlslagene i hornhindetransplantationen skyldtes CESD20. På grund af manglen på hornhindedonation i de fleste lande verden over kunne kun en ud af halvfjerds hornhindeblinde patienter i sidste ende modtage hornhindetransplantation21. I øjeblikket kan hornhindeepitelstamcelletransplantation (CEST) anvendes til behandling af CESD22. Patienter med monokulær CESD kan få CES fra raske øjne til CEST. For patienter med bilateral CESD kan der dog kun opnås allogen CES til behandling. Immunafvisning er fortsat hovedårsagen til svigt af allogen CEST. En lovende metode til at reducere den terapeutiske behandling af CESD er at finde en celle, der effektivt kan erstatte autogen CES eller tilskynde til differentiering af andre autogene celler fra andre steder for at blive CES. In vitro-differentiering af autologe celler til CES er også ved at blive populær, herunder BMMSC 23, mundslimhindeepitelceller (OMEC)24, stamceller af tandmasse (DPSC)19, humane fibroblastafledte pluripotente stamceller (iPSC)25 og fedtstamceller (ASC)26. Rohaina et al.23fandt, at BMMSC'er dyrket på fosterhinder i 10 dage kunne differentiere sig til hornhindepitelceller, og at CK3- og p63-ekspression steg signifikant efter induktion af differentiering. I 2020 inducerede O'Callaghan et al.24differentieringen af orale slimhindepitelceller i hornhindepitelceller ved hjælp af et nyt dyrkningssystem og brugte det med succes til behandling af CESD ved hjælp af en 3D-vævsstruktur (RAFT) som støtte til oral slimhindeepitelcellekultur med humane orale slimhindefibroblaster som trofoblaster. Derudover differentierer DPSC sig med succes i hornhindestromale og epitelceller. Ved at opregulere ekspressionen af K3, K12 og CD90 kan DPSC forhindre hornhindekonjunktival invasion. En anden undersøgelse brugte DPSC som fostercelleplader piggybacked på hornhindeoverfladen i en kanin CESD-model. Resultaterne viste, at DPSC-gruppen havde renere hornhinder og mindre angiogenese end kontrolgruppen27. Hayashi et al.28opnåede differentiering ved hjælp af fibroblastafledt iPSC, der kunne induceres i PAX6(+) og K12(+) hornhindepitelceller efter 12 uger. iPSC udvikler sig effektivt til hornhindepitelceller, aktiverer K12 og undertrykker NANOG25. Zeppieri et al.26 opdagede, at ASC'er kunne differentiere sig til hornhindepitelceller for at helbrede muse-CESD og forbedre hornhindepitelsårheling i en laserinduceret dyremodel.
LNC'er lokaliseres i limbal-nichen, hvor CES er beskyttet og understøttet, og har mange egenskaber, der ligner MSC'er. LNC'er blev først isoleret af Polisetty et al.2 og først navngivet af Xie et al.3. Ifølge nylige undersøgelser er LNC'er mere grundlæggende stamceller end MSC'er og kan let differentiere sig til adipocytter, chondrocytter og osteocytter 4,29. Sammenlignet med de almindeligt anvendte BMMSC'er viser LNC'er større stamcelleegenskaber (højere ekspression af CD73, CD105, PDGFR, SCF osv.) (Figur 5) 30. LNC'er kan med succes behandle kaniner med CESD forårsaget af alkaliske hornhindeforbrændinger ved at fremme reparationen af hornhindepitelet og stroma15. Den reducerede ekspression af fibronectin (FN), bindevævsvækstfaktor (CTGF) og udskilt protein surt og cysteinrigt (SPARC) i hornhindefibroblaster tyder på, at LNCs sekretion forbedrer sårheling og reducerer fibrose7.
I et 3D-mikromiljø er det interessante, at LNC'er kan genforenes med MCEC'er, hvilket stimulerer sidstnævnte celler til at gendanne stamcelleegenskaber9. LNC'er fremskynder effektivt CES-vækst31 og forhindrer hornhindeardannelse10. Mængden af LNC'er er imidlertid begrænset; Undersøgelser har vist, at det kun repræsenterer ca. 3% af det samlede antal limbal stromale celler i kvæghinden32, med signifikant ekspression af keratansulfat, keratocan og ALDH3A133. De kan være mindre end 1% i humane hornhinder33.
I denne protokol blev tidligere metoder til isolering, rensning og identifikation af LNC'er gentaget 3,14,34. Efter 18 timers behandling af humant limbusvæv med kollagenase A (2 mg/ml) blev LNC'er isoleret. P0 LNC udviklede sig langsomt og udviste forskellige cellemorfologier, herunder spindelformede LNC'er, polygonale andre og synlig sfærisk MCEC (figur 2, P0). Tidligere undersøgelser har vist, at LNC'er er spindelformede celler, der fastgøres til bunden af kulturoverfladen med homogen morfologi14. Samtidig er MCEC'er runde29, hvilket er i overensstemmelse med morfologien af de celler, der dyrkes i denne protokol. Derudover voksede P0 LNC'er langsomt til cellerne, der voksede fuldt ca. 70% -80% af celletætheden på cirka 12 dage. P1-P12 LNC spredte sig væsentligt hurtigere og dækkede praktisk talt hele kulturpladen på 3-6 dage. Efter P1 var spindelformede LNC'er adnexale celler signifikant i undertal omkring MCEC og polygonale celler.
Det fremgår klart af NCD-værdierne i tabel 2 og figur 3 , at LNC'erne P0 havde den laveste NCD (0,810), og at cellepassagen fandt sted over 12 dage. Efter P1 accelererede væksten af LNC'er imidlertid dramatisk, og vækstraten toppede på 3,44 i P4. Efter P6 blev vækstraten for LNC'erne væsentligt reduceret (figur 3). Lnc'ernes vækstrate og aktivitet i P4 var væsentligt den højeste med hensyn til LNCs vækstmønster, i overensstemmelse med tidligere resultater, der tyder på, at P4-P6 LNCs vækstaktivitet er den bedste9. Denne metode har dog visse begrænsninger, antallet af LNC P0 varierer meget alt efter donorens alder og dødstidspunktet. Derfor, når donorvævet er yngre og friskere, kan mere P0 LNC isoleres. Den vigtigste faktor i efterligning af mikromiljøet i CES in vitro er behovet for universelle nichefaktorer, såsom en laminaminrig ekstracellulær matrix35.
Afslutningsvis spiller LNC'er en afgørende rolle i at understøtte hornhindepitelstamceller og opretholde stammen af CES, herunder selvfornyelse og differentiering i modne hornhindepitelceller. LNC kunne forventes at være et innovativt celleværktøj til behandling af patienter med CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen relevante finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Tak til Wei Wang, Lingjuan Xu og Rong Liu for vejledningen om dette arbejde, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You og Li Guigang for at levere noget af materialet, Guanyu Su for at skrive manuskriptet, Xiao Zhou, Yihong Xiong og Huatao Xie for at rette manuskriptet og Guigang Li for hans fulde vejledning. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei-provinsens videnskabelige forskningsprojekt om sundhed og familieplanlægning (nr. WJ2017M073), Top ti translationelle medicinske forskningsprojekter fra Tongji Hospital (nr. 2016ZHYX20), træningsprojekt for unge medicinske pionerer i Wuhan City (nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), National Health Commission of Hubei-provinsprojektet i 2022 (WJ2021ZH0005) og Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei i 2022 (4200002815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
