Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי הנישה הלימבליים האנושיים.
Abstract
כאן אנו מדווחים על הליך סטנדרטי לבידוד וזיהוי של תאי נישה לימבליים (LNCs). רקמת לימבוס שהתקבלה מבנק עיניים שימשה לבידוד LNCs. הרקמה חולקה ל -12 חתיכות בתנאים אספטיים ועוכלה במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא באמצעות collagenase A כדי להשיג אשכולות תאים עם LNCs ותאי אב אפיתל לימבלי. אשכולות התאים עוכלו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C תוך שימוש ב-0.25% טריפסין-EDTA כדי להשיג תאים בודדים, ולאחר מכן גודלו בתרבית במדיום תאי גזע עובריים מהונדסים (MESCM) על משטח פלסטיק מצופה ב-5% מטריג'ל. תאים הועברו במפגש של 70%, ו- LNCs זוהו באמצעות immunofluorescence, PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) וציטומטריית זרימה. LNCs ראשוניים בודדו ועברו יותר מ -12 פעמים. פעילות ההתפשטות של LNCs מ-P4 ל-P6 הייתה הגבוהה ביותר. LNCs ביטאו סמנים גבוהים יותר של תאי גזע מאשר BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ו- PDGFRβ). יתר על כן, התוצאות הראו כי P4 LNCs ביטאו באופן אחיד VIM, CD90, CD105 ו- PDGFRβ, אך לא Pan-CK, שיכול לשמש כסמן לזיהוי LNCs. ניתוח ציטומטרי זרימה הראה כי כ- 95%, 97%, 92% ו- 11% מה- LNCs ביטאו CD73, CD90, CD105 ו- SCF בהתאמה, בעוד שהם היו 68%, 99%, 20% ו- 3% ב- BMMSC. התהליך הסטנדרטי לבידוד וזיהוי LNC יכול לספק בסיס מעבדה אמין לשימוש נרחב ב- LNCs.
Introduction
השכיחות של מחסור בתאי גזע אפיתל בקרנית (CESD), המכונה גם מחסור בתאי גזע לימבליים (LSCD)1, והתחדשות אפיתל הקרנית (CES) הופכים דחופים יותר ויותר בגלל זיהום ופציעה בקרנית. אם לא מטופלים כראוי, CESD יכול להוביל לעיוורון הדורש השתלת קרנית. כתוצאה מכך, התחדשות CES הופכת משמעותית יותר. קיימת קבוצה של תאים תומכים הנקראים תאי נישה לימבליים (LNCs) המספקים תמיכה חיונית לתפקוד CES. תאי גזע סטרומה לימבליים בודדו לראשונה על ידי Polisetty et al.2 וזוהו על ידי Xie et al.3 כ- LNCs אשר ממוקמים באפיתל הלימבלי, subjacent וסטרומה של הלימבוס. LNCs הם תאי הגזע התומכים העיקריים של שפת הקרנית, ועם הפונקציה של MSC הנגזר ממח עצם (BMMSCs), וניתן לגרום להם להתפתח לתאי אפיתל בקרנית ולתאי סטרומה בקרנית, וכו '.3,4,5,6,7. מחקרים קודמים הראו כי תכונות תאי הגזע של LNCs הן פרימיטיביות יותר מאשר BMMSCs8, אשר כבר בשימוש נרחב במרפאה. LNCs עשויים אפילו להפוך את האפשרות המעשית הבאה לאחר MSC, במיוחד לטיפול CESD. כתאים תומכים חשובים עבור CES, LNCs הם גם תאי גזע הנגזרים מהמבנה "הנישתי" של הלימבוס. LNCs עשויים למלא תפקיד מפתח בהתמיינות של תאי אפיתל קרנית בוגרים (MCEC) ל- CES9. עם זאת, מחקרים על LNCs עדיין אינם מספיקים יחסית, ואין הסכמה על המינוח, הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs. כמה חוקרים קראו לתאי גזע סטרומה שמקורם בביופסיה לימבלית 10, תאי גזע מזנכימליים לימבליים 11, תאי גזע פיברובלסטים לימבליים12 ותאי סטרומה מזנכימליים לימבליים13. מכיוון שמאפייני הצמיחה של LNCs לא תוארו בפירוט, ובגלל היישומים המדעיים והקליניים המבטיחים שלהם, ועשויים להיות אחד הכלים הקליניים החשובים ביותר בעתיד, יש צורך לסכם את הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs.
על פי מחקר קודם14, LNCs נמצאים בעיקר באפיתל הלימבל subjacent וסטרומה של הלימבוס. פרוטוקול זה כולל טיפול ברקמת לימבוס באמצעות collagenase A, קבלת אשכול המורכב מ- LEPC ו- LNCs, ועיכול לתאים בודדים עם 0.25% טריפסין-EDTA (TE). לאחר מכן LNCs תורבתו באופן סלקטיבי בתווך תאי גזע עובריים שונה (MESCM) כדי להיות מטוהרים. הפרוטוקול המדווח במאמר זה הוא פשוט ובעל יעילות גבוהה בהשגת LNCs אנושיים בכמויות גדולות.
ההליך המפורט של בידוד, תרבית וזיהוי LNC תועד בסרטון עבור מדענים המעוניינים במחקר LNC, וניתן לחזור עליו בנוחות בעת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת לימבוס מתורמים בגילאי 50 עד 60 שנים התקבלה מבנק העיניים של הצלב האדום, בית החולים טונג'י (ווהאן, סין). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של טונג'י והתנהל בהתאם להצהרת הלסינקי.
1. בידוד
- יש להשיג רקמת לימבוס ממדיום אחסון קרנית לטווח בינוני ולפעול בתנאים אספטיים על שולחן עבודה נקי במיוחד.
- יש לגרד ולהסיר את הקשתית והאנדותל סביב הקרנית באמצעות להב עגול כירורגי סטרילי.
- חותכים רקמת לימבוס לשתים עשרה חתיכות בגודל שווה עם להב כירורגי עם 1 מ"מ שנותר משני צידי הקרנית והסקלרה.
- מעבירים רקמות לימבוס לצלחת תרבית בקוטר 3.5 ס"מ, מוסיפים 1 מ"ל של קולגן A (2 מ"ג/מ"ל, בתווך DF-12), כדי לטבול את כל הרקמות לעיכול.
- הכניסו את הצלחת לאינקובטור התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עיכלו את רקמות הלימבל במשך 18 שעות.
הערה: הליכי מעקב מבוצעים בדרך כלל ביום השני. - הכינו פלטת תרבית 5% ממברנת מרתף (מטריג'ל) מצופה 6 בארות.
- ציפוי 5% מטריצת קרום מרתף (מומס ב-MESCM [טבלה 1]) בתחתית הבאר.
- הכינו קצוות של 200 μL ו-1 מ"ל, צינור צנטריפוגלי אחד של 15 מ"ל וצלחת אחת של 6 בארות בשקית מעוקרת.
- הניחו את השקית המעוקרת (כולל קצוות וצינור צנטריפוגלי) וצלחת חדשה בעלת 6 בארות בסביבה של -20°C או -80°C למשך 20 דקות. הפשירו את מטריצת קרום המרתף במקרר בטמפרטורה של 4°C.
- הוציאו את הקצוות המקוררים מראש, הצינור הצנטריפוגלי וצלחת 6 הבארות מהסביבה -20°C או -80°C, ולאחר מכן בצעו את הפעולות הבאות על שולחן העבודה הנקי במיוחד.
- מעבירים 50 μL 5% ממברנת מרתף ל-1 מ"ל MESCM באמצעות קצה של 200 μL, ומערבבים אותם בעדינות ובאופן שווה.
- מעבירים מטריצת קרום מרתף 5% (מומסת ב-MESCM) לבאר אחת של צלחת תרבית בעלת 6 בארות באמצעות קצה 1 מ"ל מקורר מראש.
- נערו את צלחת 6 הבארות בעדינות ובאופקיות, הניחו את צלחת התרבית בת 6 הבארות באינקובטור התא של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה ולאחר מכן בצעו את השלב הבא.
- לאחר עיכול של 18 שעות, הוציאו רקמת לימבל מעוכלת מסוג Collagenase A, יישארו רק כמה אשכולות קטנים נראים לעין ורקמות סקלרליות לא מעוכלות.
הערה: מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה חושף אשכול המורכב מתאים רבים צפופים (כולל LNCs). - השתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי לנתק את הצבירים מרקמות סקלרליות לא מעוכלות מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- מעבירים את הצבירים לצלחת התרבית בקוטר 3.5 ס"מ וטובלים אותם ב-0.25% TE, ולאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור התא למשך 15 דקות.
- הוסף 1 מ"ל MESCM עם 10% סרום נוקאאוט כדי לעצור את עיכול התאים ופיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הצבירים לתאים בודדים באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.
- העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגלי של 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant בזהירות מבלי להפריע משקעים התא, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים.
- פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים עד משקעים התא התחתון הוא מרחף באופן שווה MESCM באמצעות 1 מ"ל פיפטה קצה, ולקחת 20 μL תא השעיה לספירת התא.
- העבירו את מתלה התא לצלחת 6 בארות מצופות ממברנת מרתף 5% עם קצה פיפטה של 1 מ"ל והגדילו את נפח MESCM ל -2.5 מ"ל.
- נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות אופקית כדי לפזר את התאים באופן שווה.
- מעבירים את התאים לאינקובטור התרבית לאחר שצולמו והוקלטו. להתבונן ולצלם את התאים מדי יום, ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
2. זיהוי LNC
- צביעה אימונופלואורסצנטית
- עיכלו את ה-LNCs מתחתית הצלחת באמצעות 1 מ"ל 0.25% TE במשך 5 דקות באינקובטור התאים בטמפרטורה של 37°C.
- לסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל MESCM (המכיל סרום נוקאאוט), צנטריפוגה את תרחיף התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant בזהירות.
- הוסף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים בהשעיה. הכן תרחיף תאים של 80 μL (4 × 103 תאים לכל שקופית) עבור 4 שקופיות (20 μL / שקופיות) והשתמש במערכת צנטריפוגות כדי להפקיד תאים על שקופיות מיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן.
- תקן תאים (הודבקו לשקופיות בשלב 3) באמצעות 4% פרפורמלדהיד למשך כ-10 דקות, ולאחר מכן חלחל תאים בשקופיות עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות.
- חסום את התאים למשך שעה אחת עם אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) לפני הדגירה עליהם עם נוגדנים ראשוניים (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) על שייקר למשך הלילה ב-4°C. לאחר הדגירה, יש להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים על ידי שטיפה (5 דקות / שטיפה, 3x) את המגלשות עם PBST (PBS + 0.1% Tween 20).
- לדגור על הנוגדנים המשניים המתאימים (חמור נגד עכבר IgG נוגדן משני TRITC [1:1000], חמור נגד ארנב IgG FITC [1:500], חמור נגד עכבר IgG 488 [1:300], חמור נגד ארנב IgG 594 [1:400]) במשך שעה אחת עם נוגדני IgG לא ספציפיים מתאימים IgG. הסר את הנוגדן המשני הלא קשור באמצעות PBST (5 דקות / שטיפה, 3x).
- מכתימים את הגרעינים ב-DAPI של 5 מיקרוגרם/מ"ל (4',6-Diamidino-2-Phenylindole ) ואוטמים את המגלשות.
- ביצוע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה: 400x; זמן חשיפה: 50 מילישניות).
- תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR)
- קח ערכת בידוד RNA כדי לחלץ את הרנ"א הכולל בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש בערכת שעתוק cDNA בעלת קיבולת גבוהה כדי לתעתק לאחור 1-2 מיקרוגרם של RNA כולל ל- cDNA.
- בצע את התעתיק ההפוך (42°C, 2 דקות; 50°C, 85 דקות) ואת qPCR (95°C, 5 דקות; 95°C, 10 שניות, 40 מחזורים) בתמיסה של 20-μL המכילה cDNA (100 ננוגרם), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), PCR Master Mix אוניברסלי (10 μL) ו-ddH2O (עד 20 μL).
- השתמש בטכניקת CT השוואתית (ΔΔCT)4,9 כדי לבחון את ביטוי הגן היחסי.
3. אפיון LNC
- ספירת תאים (המוציטומטר)
- עיכלו את ה-LNCs מתחתית הצלחת באמצעות 0.25% TE במשך 5 דקות באינקובטור התאים של 37°C.
- לסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל MESCM (המכיל סרום נוקאאוט), צנטריפוגה את תרחיף התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant בזהירות.
- הוסף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן לקחת 10 μL השעיית תאים בצינור צנטריפוגה 0.5 מ"ל. הוסף נפח שווה של 0.4% תמיסת צביעה כחולה טריפאן.
- מניחים 10 μL תרחיף תאים מוכתמים על אזור הספירה של ההמוציטומטר ומכסים אותו עם כיסוי לספירה.
הערה: מספר התאים בחמשת האזורים הריבועיים האמצעיים מוגדר כ- "A"; מספר התא ב- 1 מ"ל מחושב כ- 5A × 104 × 2.
- בדיקת סמני LNC ו-BMMSC עם ציטומטריית זרימה15
- זהה את הביטוי של SCF, CD73, CD90 ו- CD105 ב- LNCs וב- BMMSCs באמצעות ציטומטריית זרימה 15 (2-4 ×10 6 אירועים לדגימה, התקבלו 2,000 תאים מכל אחת מהדגימות, בסך הכל 550,000 תאים שהיו מגודרים בו זמנית).
- יש לאסוף ולהכתים את התאים בטמפרטורה של 20-30°C למשך 15 דקות במאגר חוסם (3% BSA ו-0.05% Tween-20 ב-PBS) באמצעות נוגדנים מסומנים מראש (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] ו-CD105 [1:50]) בהתאם להוראות הערכה.
- בצע ניתוח מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות ציטומטר זרימה. במחקר זה נעשה שימוש בתוכנת FACS Diva ובתוכנת FlowJo. עבור כל דגימה, תעד 10,000 אירועים ושער ונתח תאים חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צמיחה של LNC
ה-LNCs בודדו בהצלחה על-פי שיטת העיכול של עיכול collagenase A (2 מ"ג/מ"ל) של רקמת שפה קורנאוסקלרלית, כפי שתואר לעיל (איור 1). בהתאם למחקר3 שדווח בעבר, לאחר עיכול collagenase A, צבירים דמויי זחלים הודגמו תחת המיקרוסקופ (איור 2). חלקם של תאי הציר גדל בהדרגה עם מעבר התא. תאים בצורת ציר יכלו לגדול על לוחות מטריצת קרום מרתף מצופים 5%, בניגוד למקביליהם המעובדים על פלסטיק ללא מטריצת קרום מרתףמצופה 3. תאים מ-P1 עד P12 הציגו קצב התרבות אחיד, עם זמן הכפלה של תאים בין 2 ל-7 ימים (טבלה 2). במחקר זה, LNCs תורבתו ל-13 קטעים, ול-34 הכפלות (איור 3)3. LNCs גודלו בתרבית מתאים ראשוניים (LNC P0); LNC P0 גדל לאט ולקח בערך 12 ימים. LNCs נזקקו רק כ-3 ימים כדי לעבור ב-P1-P8, וקצב הגידול של LNCs לאחר P9 ירד משמעותית (טבלה 2). במונחים של מורפולוגיה של תאים, LNCs היו בצורת ציר, ועגולים ב-P0. אחרי P3, LNCs היו בצורת ציר עם אותו גודל מורפולוגי (איור 2). מידת ההתפשטות הכוללת נמדדה כמספר האוכלוסייה שהוכפלה מ-P0 ל-P13 באמצעות הנוסחה הבאה: מספר הכפלת התאים (NCD) = log10 (y/x) / log102, כאשר y היא הצפיפות הסופית של תאים ו-x היא צפיפות הזריעה הראשונית של תאים3. NCD מייצג את קצב הצמיחה של LNCs (איור 3A). מעקומות NCD ו-Accmulative-NCD (איור 3B), ל-LNCs לקח הכי פחות זמן לגדול באופן אקספוננציאלי והם גדלו הכי מהר מ-P3-P5 (איור 3). לאחר P5, קצב גדילת התאים ירד באופן משמעותי, NCD חזר ל 1.32 ב P13, והצמיחה כמעט נעצרה.
זיהוי LNC
לאחר הבידוד והתרבות של LNCs, משימה חשובה נוספת הייתה זיהוי. LNCs מבוטא עבור Vim, CD90, CD105, SCF ו- PDGFRβ, אך לא Pan-CK, על פי מחקרים רלוונטיים נוכחיים על LNCs (איור 4)9. LNC P4 עם צביעה חיסונית כפולה גילה שהתאים האלה היו באופן עקבי Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (איור 4). qPCR חשף גם ירידה בביטוי Pan-CK ב-P2 ועלייה בתעתיקים של Vim, CD90, CD105, SCF ו-PDGFR ב-P3. רמות התמלול של Vim, CD90, CD105, SCF ו-PDGFR עלו באופן דרמטי ב-P4 בהשוואה ל-P1 (p < 0.01) (איור 4)9.
מאפייני LNC
ניתוח נוסף הראה כי LNCs ביטאו יותר סמנים של תאי גזע עובריים (ESC) (Nestin, Rex1 ו-SSEA4), סמנים של תאי גזע מזנכימליים (MSC) (CD73, CD90 ו-CD105), וסמנים של תאי נישה (NC) (MSX1, P75NTR ו-PDGFRβ) (איור 5)15. ציטומטריית זרימה הצביעה על כך שמאפייני אנטיגן פני השטח של MSCs, כולל CD73, CD90 ו- CD105, באו לידי ביטוי הן ב- LNCs והן ב- BMMSCs15. אחוז ה- LNCs שביטאו CD73, CD90, CD105 ו- SCF היו כ- 95%, 97%, 92% ו- 11%, בהתאמה, ואילו אלה של BMMSCs היו 68%, 99%, 20% ו- 3%, בהתאמה. זה מראה כי LNCs מבטאים רמות גבוהות משמעותית של סמנים חיוביים MSC CD73, CD105, ואת SCF ציטוקינים (p < 0.01) ורמה דומה של CD90 (p > 0.05) בהשוואה BMMSCs (איור 6)15.
איור 1: תהליך הבידוד של LNCs . (A) רקמת שפה קורנאוסקלרלית. (B) אשכולות לאחר עיכול collagenase A ב-37°C במשך 18 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: LNCs P0 עד P13 שגודלו בתרבית על 5% מטריצת קרום מרתף מצופה 6 בארות ב-MESCM. (Bar = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דפוס הצמיחה של LNCs מ-P0-P13. (A) NCD של LNCs מ-P0-P13; (B) NCD המצטבר של LNCs מ-P0-P13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אימונופלואורסנציה ו-qPCR. Immunofluorescence ו- qPCR גילו כי LNCs ביטאו באופן אחיד Vim, CD90, CD105, SCF ו- PDGFRβ, אך לא Pan-CK. נתון זה שוחזר באישור Zhu et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: LNCs מבטאים יותר סמני ESC, MSC ו-NC מאשר BMMSC. P4 LNCs ו- P4 BMMSCs היו כפופים ל- qPCR עבור ביטוי שעתוק של סמני ESC (A), MSC וסמני פסגה עצבית (B) (n = 3, *P < 0.05, #P < 0.05 ו- **p < 0.01 בהתאמה). Immunostaining של סמני ESC (C) ו- MSC, סמני NC (D), עם כתם נגד גרעיני על ידי Hoechst 33342. פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר. נתון זה שוחזר באישור Li et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות של P4 LNCs ו-BMMSCs (A-F). ניתוח מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של סמני MSC כולל CD73, CD90 ו- CD105 (n = 3). נתון זה שוחזר באישור Li et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב | ריכוז תמיסת מלאי | נפח | ריכוז סופי | סביבת אחסון |
| DME/F-12 1:1(1×) | מדיום בסיסי | 180 מ"ל | 90% | 4 °C |
| KnockOutTMSR | - | 20 מ"ל | 10% | -20 °C |
| תחליף סרום לתאי גזע עובריים/iPSCs | ||||
| גורם מעכב לוקמיה אנושי Recominant (Lif) | 50 מיקרוגרם/מ"ל | 40 מיקרוליטר | 10 נ"ג/מ"ל | -80 °C |
| רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי | 100 מיקרוגרם/מ"ל | 8 מיקרוליטר | 4 נ"ג/מ"ל | -80 °C |
| ITS (אינסולין, טרנספרין, נתרן סלניט) | 500 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין | 2 מ"ל | 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין | -20 °C |
| 500 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין | 5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין | |||
| 500 נ"ג/מ"ל נתרן סלניט | 5 נ"ג/מ"ל נתרן סלניט | |||
| גנטמיצין | 25 מיקרוגרם/מ"ל | 2 מ"ל | 50 מיקרוגרם/מ"ל | 4 °C |
| אמפוטריצין ב | 2,500 מיקרוגרם/מ"ל | 100 מיקרוליטר | 1.25 מיקרוגרם/מ"ל | 4 °C |
טבלה 1: ניסוח MESCM.
| מעבר | צפיפות זריעה (× 105 תאים/ס"מ2) | צפיפות סופית (×10 5תאים/ס"מ2) | זמן תרבות (ימים) | מספר הכפלות תאים (NCD) | NCD מצטבר |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| עמ' 3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| עמ' 4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| עמ' 6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| עמ' 7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| עמ' 8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| עמ' 9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| עמ' 10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| עמ' 11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| עמ' 12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| עמ' 13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
טבלה 2: מעברים טוריים של LNC על פלסטיק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שקיפות הקרנית נשמרת בדרך כלל על ידי סידור ופיזור קבוע של סיבים קטנים (בקוטר 25-30 ננומטר) בסטרומה של הקרנית, שהוא חיוני לחדות ראייה תקינה16. ישנם 253 מיליון אנשים לקויי ראייה ברחבי העולם, מתוכם 36 מיליון עיוורים17. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחשיב עיוורון קרנית כאחד הסיכונים החמורים ביותר לראייה האנושית, ומהווה 5.1% מכלל העיוורון בעולם16. פגם אפיתל הקרנית עם CES רגיל יכול לרפא במהירות מבלי להשאיר צלקת18. ההערכה היא כי יותר מ -12.7 מיליון חולים ברחבי העולם זקוקים להשתלות קרנית עקב אובדן ראייה בינוני עד חמור19; 30% מכישלון השתלת הקרנית נגרם על ידי CESD20. עם זאת, בשל המחסור בתרומת קרנית ברוב מדינות העולם, רק אחד מכל שבעים חולים עיוורי קרנית יכול בסופו של דבר לעבור השתלת קרנית21. נכון לעכשיו, השתלת תאי גזע אפיתל הקרנית (CEST) ניתן להשתמש לטיפול CESD22. חולים עם CESD מונוקולרי יכולים לקבל CES מעיניים בריאות עבור CEST. עם זאת, עבור חולים עם CESD דו צדדי, רק CES אלוגני ניתן להשיג לטיפול. דחייה חיסונית נותרה הסיבה העיקרית לכישלון של CEST אלוגני. שיטה מבטיחה להפחית את הטיפול ב- CESD היא למצוא תא שיכול להחליף ביעילות CES אוטוגני או לעודד התמיינות של תאים אוטוגניים אחרים ממקומות אחרים להפוך ל- CES. התמיינות חוץ גופית של תאים אוטולוגיים ל-CES הופכת גם היא לפופולרית, כולל BMMSC23, תאי אפיתל של רירית הפה (OMEC)24, תאי גזע של מוך השן (DPSC)19, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פיברובלסטים אנושיים (iPSC)25, ותאי גזע שומניים (ASC)26. Rohaina et al.23מצאו כי BMMSCs שגודלו בתרבית על קרומי שפיר במשך 10 ימים יכלו להתמיין לתאי אפיתל בקרנית, וכי ביטוי CK3 ו- p63 גדל באופן משמעותי לאחר השראת ההתמיינות. בשנת 2020, O'Callaghan et al.24גרמו להתמיינות של תאי אפיתל רירית הפה לתאי אפיתל של הקרנית באמצעות מערכת תרבית חדשה, והשתמשו בו בהצלחה לטיפול ב- CESD באמצעות מבנה רקמה תלת ממדי (RAFT) כתמיכה בתרבית תאי אפיתל רירית הפה עם פיברובלסטים של רירית הפה האנושית כטרופובלסטים. בנוסף, DPSC מתמיין בהצלחה לתאי סטרומה ואפיתל בקרנית. על ידי ויסות הביטוי של K3, K12 ו- CD90, DPSC יכול למנוע פלישה של לחמית הקרנית. מחקר אחר השתמש ב- DPSC כיריעות תאי מי שפיר שהונחו על פני הקרנית במודל CESD של ארנב. התוצאות הראו כי לקבוצת DPSC היו קרניות נקיות יותר ופחות אנגיוגנזה מאשר לקבוצת הביקורת27. Hayashi et al.28השיגו התמיינות באמצעות iPSC שמקורו בפיברובלסטים שניתן היה להשרות בתאי אפיתל קרנית PAX6(+) ו-K12(+) לאחר 12 שבועות. iPSC מתפתח ביעילות לתאי אפיתל בקרנית, מפעיל K12 ומדכא את NANOG25. Zeppieri et al.26 גילו כי ASCs יכולים להתמיין לתאי אפיתל הקרנית כדי לרפא CESD עכבר ולשפר ריפוי פצע אפיתל הקרנית במודל בעלי חיים המושרה בלייזר.
LNCs ממוקמים בנישה הלימבלית, שבה CES מוגנים ונתמכים, ויש להם מאפיינים רבים הדומים ל- MSCs. LNCs בודדו לראשונה על ידי Polisetty et al.2 ונקראו לראשונה על ידי Xie et al.3. על פי מחקרים אחרונים, LNCs הם תאי גזע בסיסיים יותר מאשר MSCs והוא יכול בקלות להתמיין אדיפוציטים, כונדרוציטים, ואוסטיאוציטים 4,29. בהשוואה ל- BMMSCs הנפוצים, LNCs מראים מאפיינים גדולים יותר של תאי גזע (ביטוי גבוה יותר של CD73, CD105, PDGFR, SCF וכו ') (איור 5) 30. LNCs יכולים לטפל בהצלחה בארנבים עם CESD הנגרם על ידי כוויות אלקליות בקרנית על ידי קידום תיקון אפיתל הקרנית וסטרומה15. הביטוי המופחת של פיברונקטין (FN), גורם גדילה של רקמת חיבור (CTGF) והפרשת חלבון חומצי וציסטאין עשיר (SPARC) בפיברובלסטים בקרנית מצביעים על כך שהפרשת LNCs משפרת ריפוי פצעים ומפחיתה פיברוזיס7.
במיקרו-סביבה תלת-ממדית, מה שמעניין הוא ש-LNCs עשויים להתאחד עם MCECs, ולעורר את התאים האחרונים לשחזר את תכונות תאי הגזע9. LNCs מאיצים ביעילות את צמיחת CES31 ומונעים הצטלקות בקרנית10. עם זאת, כמות LNCs מוגבלת; מחקרים הצביעו על כך שהוא מייצג רק כ-3% מכלל תאי הסטרומה הלימבליים בקרנית הבקר32, עם ביטוי משמעותי של קרטן גופרתי, קרטוקן ו-ALDH3A133. הם עשויים להיות פחות מ -1% בקרניות אנושיות33.
בפרוטוקול זה, שיטות קודמות של בידוד, טיהור וזיהוי LNCs חזרו על עצמן 3,14,34. לאחר 18 שעות של טיפול ברקמת לימבוס אנושית עם collagenase A (2 מ"ג / מ"ל), LNCs בודדו. P0 LNC התפתח לאט והציג מורפולוגיות שונות של התא, כולל LNCs בצורת ציר, מצולעים אחרים ו-MCEC כדורי נראה לעין (איור 2, P0). מחקרים קודמים הראו כי LNCs הם תאים בצורת ציר המתחברים לתחתית משטח התרבית עם מורפולוגיה הומוגנית14. יחד עם זאת, MCECs הם עגולים29, אשר עולה בקנה אחד עם המורפולוגיה של התאים בתרבית בפרוטוקול זה. בנוסף, P0 LNCs גדלו לאט לתאים שגדלו מלאים בערך 70%-80% מצפיפות התאים בתוך כ -12 ימים. P1-P12 LNC התפשט באופן משמעותי מהר יותר, ותוך 3-6 ימים, כיסה למעשה את כל צלחת התרבית. בעקבות P1, תאי LNC אדנקסאליים בצורת ציר עלו משמעותית על מספר תאי MCEC עגולים ותאים מצולעים.
ברור מערכי NCD בטבלה 2 ובאיור 3 כי LNCs P0 היה בעל NCD הנמוך ביותר (0.810) וכי מעבר התאים התרחש במשך 12 ימים. עם זאת, לאחר P1, הצמיחה של LNCs הואצה באופן דרמטי, ואת קצב הצמיחה הגיע לשיא של 3.44 P4. לאחר P6, קצב הצמיחה של LNCs הופחת באופן משמעותי (איור 3). קצב הצמיחה של ה-LNCs והפעילות של ה-P4 היו באופן משמעותי הגבוהים ביותר במונחים של דפוס הצמיחה של ה-LNCs, בהתאם לממצאים קודמים שהצביעו על כך שפעילות הצמיחה של P4-P6 LNCs היא הטובה ביותר9. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות מסוימות, מספר LNC P0 משתנה מאוד בהתאם לגיל התורם ואת זמן המוות. לכן, כאשר הרקמה התורמת צעירה ורעננה יותר, ניתן לבודד יותר P0 LNC. הגורם החשוב ביותר בחיקוי המיקרו-סביבה של CES במבחנה הוא הצורך בגורמי נישה אוניברסליים, כגון מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינמין35.
לסיכום, LNCs ממלאים תפקיד מכריע בתמיכה בתאי גזע אפיתל בקרנית ובשמירה על גזע CES, כולל התחדשות עצמית והתמיינות לתאי אפיתל קרנית בוגרים. LNC צפוי להיות כלי תאי חדשני לטיפול בחולים עם CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהמחברים אין גילויים כספיים רלוונטיים.
Acknowledgments
תודה לוויי וואנג, לינג-ג'ואן שו ורונג ליו על ההדרכה בעבודה זו, יונגיאו טאן, בי-הווי ג'ין, צ'ון-שיו יו ולי גוויגאנג על אספקת חלק מהחומר, גואניו סו על כתיבת כתב היד, שיאו ג'ואו, יי-הונג שיונג והואטאו שיה על תיקון כתב היד, וגוויגאנג לי על הדרכתו המלאה. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82070936, 81470606, 81570819), פרויקט מחקר מדעי לבריאות ותכנון המשפחה במחוז חוביי (מס '. WJ2017M073), עשרת פרויקטי המחקר הרפואי התרגומי המובילים מבית החולים טונג'י (No.2016ZHYX20), פרויקט הכשרה של חלוצים רפואיים צעירים בעיר ווהאן (No.2015whzqnyxggrc10), תוכנית גיוס כישרונות גלובלית (G2022154028L), פרויקט ועדת הבריאות הלאומית של מחוז חוביי בשנת 2022 (WJ2021ZH0005), ופרויקט בניית נושא של מחלקת הכספים של חוביי בשנת 2022 (42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
