Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och identifiera de humana limbala nischcellerna.
Abstract
Här redovisar vi en standardprocedur för isolering och identifiering av limbala nischceller (LNC). Limbusvävnad erhållen från en ögonbank användes för isolering av LNC. Vävnaden delades i 12 delar under aseptiska förhållanden och spjälkades i 18 timmar vid 37 °C i cellodlingsinkubatorn med kollagenas A för att erhålla cellkluster med LNC och limbala epitelceller. Cellklustren rötades vidare i 15 minuter vid 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA för att erhålla enskilda celler och odlades sedan i modifierat embryonalt stamcellsmedium (MESCM) på en plastyta belagd med 5 % Matrigel. Celler passerade vid 70 % sammanflöde och LNC identifierades med hjälp av immunofluorescens, kvantitativ PCR (qPCR) i realtid och flödescytometri. Primära LNC isolerades och passerade mer än 12 gånger. Spridningsaktiviteten för LNC från P4 till P6 var den högsta. LNC uttryckte högre stamcellsmarkörer än BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR och PDGFRβ). Vidare visade resultaten att P4 LNC enhetligt uttryckte VIM, CD90, CD105 och PDGFRβ, men inte Pan-CK, som kunde användas som en markör för identifiering av LNCs. Flödescytometrisk analys visade att cirka 95 %, 97 %, 92 % och 11 % av LNC uttryckte CD73, CD90, CD105 respektive SCF, medan de var 68 %, 99 %, 20 % och 3 % i BMMSCs. Standardprocessen för isolering och identifiering av LNC skulle kunna ge en tillförlitlig laboratoriegrund för en utbredd användning av LNC.
Introduction
Förekomsten av hornhinneepitelstamcellsbrist (CESD), även kallad limbal stamcellsbrist (LSCD)1, och hornhinneepitelregenerering (CES) blir mer och mer akut på grund av hornhinneinfektion och hornhinneskada. Om CESD inte behandlas på rätt sätt kan det leda till blindhet som kräver hornhinnetransplantation. Som ett resultat av detta blir CES-regenerering allt viktigare. Det finns en grupp stödceller som kallas limbala nischceller (LNC) som ger viktigt stöd för CES-funktionen. Limbala stromastamceller isolerades först av Polisetty et al.2 och identifierades av Xie et al.3 som LNC som är lokaliserade i limbalt epitel subjacent och stroma i limbus. LNC är den viktigaste stödjande stamcellen i hornhinnans kant och med funktionen av benmärgshärledd MSC (BMMSC), och kan induceras att utvecklas till hornhinneepitelceller och hornhinnestromaceller, etc.3,4,5,6,7. Tidigare studier har visat att stamcellsegenskaperna hos LNC är mer primitiva än BMMSCs8, som redan används i stor utsträckning i kliniken. LNC kan till och med bli nästa gångbara alternativ efter MSC, särskilt för behandling av CESD. Som viktiga stödceller för CES är LNC också stamceller som härrör från limbus "nisch"-struktur. LNC kan spela en nyckelroll i dedifferentieringen av mogna hornhinneepitelceller (MCEC) till CES9. Studier om LNC är dock fortfarande relativt otillräckliga, och det finns ingen konsensus om terminologin, isoleringen, reningen, identifieringen och egenskaperna hos LNC. Vissa forskare har namngett LNCs limbala biopsi-härledda stromastamceller10, limbala mesenkymala stamceller 11, limbala fibroblaststamceller 12 och limbala mesenkymala stromaceller13. Eftersom tillväxtkarakteristika för LNC inte har beskrivits i detalj, och på grund av deras lovande vetenskapliga och kliniska tillämpningar, och kan vara ett av de viktigaste kliniska verktygen i framtiden, är det nödvändigt att sammanfatta isolering, rening, identifiering och egenskaper hos LNC.
Enligt en tidigare studie14 finns LNC huvudsakligen vid limbalt epitel subjacent och stroma i limbus. Detta protokoll inkluderar behandling av limbusvävnad med kollagenas A, erhållande av ett kluster bestående av LEPC och LNC och nedbrytning av det till enstaka celler med 0,25 % trypsin-EDTA (TE). LNC odlades sedan selektivt i ett modifierat embryonalt stamcellsmedium (MESCM) för att renas. Protokollet som rapporteras i detta dokument är enkelt och har hög effektivitet när det gäller att erhålla mänskliga LNC i stora mängder.
Den detaljerade proceduren för LNC-isolering, odling och identifiering spelades in i videon för forskare som är intresserade av LNC-studier, och den kan bekvämt upprepas vid behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Limbusvävnad från donatorer mellan 50 och 60 år erhölls från Röda Korsets Ögonbank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollet godkändes av Tongjis etiska kommitté och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
1. Isolering
- Skaffa limbusvävnad från mellanliggande hornhinnelagringsmedium och arbeta under aseptiska förhållanden på en ultraren arbetsbänk.
- Skrapa och ta bort iris och endotelet runt hornhinnan med ett sterilt kirurgiskt runt blad.
- Skär limbusvävnad i tolv lika stora bitar med ett kirurgiskt blad med 1 mm kvar på båda sidor av hornhinnan och sklera.
- Överför limbusvävnader till en 3,5 cm odlingsplatta, tillsätt 1 ml kollagenas A (2 mg/ml, i DF-12-medium), för att sänka ner alla vävnader för matsmältningen.
- Lägg plattan i 37 °C cellinkubatorn och smält de limbala vävnaderna i 18 timmar.
OBS: Uppföljningsprocedurer utförs vanligtvis den andra dagen. - Förbered en 5 % basalmembranmatris (Matrigel) belagd 6-håls odlingsplatta.
- Täck 5 % basalmembranmatris (upplöst i MESCM [Tabell 1]) i botten av brunnen.
- Förbered 200 μL och 1 ml spetsar, ett 15 ml centrifugalrör och en 6-hålsplatta i en steriliserad påse.
- Placera den steriliserade påsen (inklusive spetsar och centrifugalrör) och en ny 6-hålsplatta vid -20 °C eller -80 °C miljö i 20 minuter. Tina basalmembranet i kylskåp vid 4 °C.
- Ta ut de förkylda spetsarna, centrifugalröret och 6-hålsplattan från miljön -20 °C eller -80 °C och utför sedan följande operationer på den ultrarena arbetsbänken.
- Överför 50 μL 5 % basalmembranmatris till 1 ml MESCM med en 200 μL spets och blanda dem försiktigt och jämnt.
- Överför 5 % basalmembranmatris (upplöst i MESCM) till en brunn på en odlingsplatta med 6 brunnar med hjälp av den förkylda 1 ml-spetsen.
- Skaka 6-hålsplattan försiktigt och horisontellt, lägg 6-hålsodlingsplattan i 37 °C-cellinkubatorn i cirka 1 timme och utför sedan nästa steg.
- Efter 18 timmars matsmältning, ta ut kollagenas A-smält limbal vävnad, endast några synliga små kluster och osmälta sklerala vävnader kommer att finnas kvar.
OBS: Mikroskopi med hög förstoring avslöjar ett kluster som består av många tätt packade celler (inklusive LNC). - Använd en 200 μL pipettspets för att lossa klustren från osmälta sklerala vävnader under stereomikroskopet.
- Överför klustren till den 3,5 cm stora odlingsplattan och sänk ner dem i 0,25 % TE och placera sedan plattan i cellinkubatorn i 15 minuter.
- Tillsätt 1 ml MESCM med 10 % knockout-serum för att stoppa cellernas matsmältning och pipettera försiktigt upp och ner för att återsuspendera klustren i enskilda celler med hjälp av en 1 ml pipettspets.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugalrör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten försiktigt utan att störa cellutfällningen och tillsätt sedan 1 ml MESCM för att återsuspendera cellerna.
- Pipettera upp och ner 2-3 gånger tills den nedre cellutfällningen är jämnt suspenderad i MESCM med 1 ml pipettspets, och ta 20 μL cellsuspension för cellräkning.
- Överför cellsuspensionen till den 5 % basalmembranmatrisbelagda 6-hålsplattan med en 1 ml pipettspets och öka volymen av MESCM till 2,5 ml.
- Skaka försiktigt 6-hålsplattan horisontellt för att fördela cellerna jämnt.
- Överför cellerna till odlingsinkubatorn efter att ha avbildats och registrerats. Observera och fotografera cellerna dagligen och byt medium var 3-4:e dag.
2. Identifiering av LNC
- Immunofluorescensfärgning
- Smält LNC från botten av plattan med 1 ml 0,25 % TE i 5 minuter i 37°C cellinkubator.
- Avsluta uppslutningen genom att tillsätta 1 ml MESCM (innehållande knockoutserum), centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten försiktigt.
- Tillsätt 1 ml MESCM för att återsuspendera cellerna i suspension. Bered 80 μL cellsuspension (4 × 103 celler per objektglas) för 4 objektglas (20 μL/objektglas) och använd centrifugsystem för att deponera celler på objektglas enligt tillverkarens instruktioner.
- Fixera celler (vidhäftade till objektglas i steg 3) med 4 % paraformaldehyd i cirka 10 minuter och permeabilisera sedan celler på objektglasen med 0,2 % Triton X-100 i PBS i 15 minuter.
- Blockera cellerna i 1 timme med 2 % bovint serumalbumin (BSA) innan de inkuberas med primära antikroppar (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) i en skakapparat över natten vid 4 °C. Efter inkubationen avlägsnas obundna primära antikroppar genom att tvätta (5 min/tvätt, 3 gånger) glasen med PBST (PBS + 0,1 % Tween 20).
- Inkubera motsvarande sekundära antikroppar (åsna antimus IgG sekundär antikropp TRITC [1:1000], åsna anti-kanin IgG FITC [1:500], åsna antimus IgG 488 [1:300], åsna anti-kanin IgG 594 [1:400]) i 1 timme med lämpliga IgG ospecifika IgG-antikroppar. Ta bort den obundna sekundära antikroppen med PBST (5 min/tvätt, 3 gånger).
- Motfärga kärnorna med 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindol) och försegla objektglasen.
- Utför fluorescensavbildning med ett fluorescensmikroskop (Förstoring: 400x; Exponeringstid: 50 ms).
- Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR)
- Ta RNA Isolation Kit för att extrahera det totala RNA:t enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd ett cDNA-transkriptionskit med hög kapacitet för att omvänt transkribera 1-2 μg totalt RNA till cDNA.
- Utför omvänd transkription (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) och qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cykler) i en 20-μL lösning innehållande cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), universell PCR Master Mix (10 μL) och ddH2O (till 20 μL).
- Använd den jämförande CT-tekniken (ΔΔCT)4,9 för att undersöka det relativa genuttrycket.
3. Karakterisering av LNC
- Cellräkning (hemocytometer)
- Smält LNA från botten av plattan med 0,25 % TE i 5 minuter i 37 °C cellinkubator.
- Avsluta uppslutningen genom att tillsätta 1 ml MESCM (innehållande knockoutserum), centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten försiktigt.
- Tillsätt 1 ml MESCM för att återsuspendera cellerna och ta sedan 10 μL cellsuspension i ett 0,5 ml centrifugrör. Tillsätt en lika stor volym av 0,4 % Trypan blå färgningslösning.
- Placera 10 μL färgad cellsuspension på hemocytometerns räkneområde och täck den med ett täckglas för räkning.
OBS: Antalet celler i de fem mellersta kvadratiska områdena definieras som "A"; cellantalet i 1 ml beräknas som 5A × 104 × 2.
- Undersökning av LNC- och BMMSC-markörer med flödescytometri15
- Detektera uttrycket av SCF, CD73, CD90 och CD105 i LNC och BMMSCs med hjälp av flödescytometri 15 (2-4 ×10 6 händelser/prov, 2 000 celler erhölls från vart och ett av proverna, totalt 550 000 celler som var inhägnade samtidigt).
- Samla upp och färga cellerna vid 20–30 °C i 15 minuter i en blockerande buffert (3 % BSA och 0,05 % Tween-20 i PBS) med hjälp av förmärkta antikroppar (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] och CD105 [1:50]) enligt instruktionerna på satsen.
- Utför fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys (FACS) med hjälp av en flödescytometer. I denna studie användes programvaran FACS Diva och programvaran FlowJo. För varje prov, registrera 10 000 händelser och grinda och analysera levande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillväxt av LNC
LNC isolerades framgångsrikt enligt metoden för uppslutning av kollagenas A (2 mg/ml) uppslutning av corneoscleral kantvävnad, som beskrivits ovan (Figur 1). I överensstämmelse med en tidigare rapporterad studie3, efter kollagenas A-nedbrytning, visualiserades larvliknande kluster under mikroskopet (Figur 2). Andelen spindelceller ökade gradvis med cellpassagen. Spindelformade celler kunde växa på belagda 5% basalmembranmatrisplattor, till skillnad från deras motsvarigheter odlade på plast utan belagd basalmembranmatris3. Celler från P1 till P12 uppvisade en enhetlig proliferativ hastighet, med en cellfördubblingstid mellan 2 och 7 dagar (tabell 2). I denna studie odlades LNC till de 13 passagerna och 34 fördubblingar (Figur 3)3. LNC odlades från primära celler (LNC P0); LNC P0 växte långsamt och tog cirka 12 dagar. LNA behövde bara cirka 3 dagar för att passera i P1-P8, och tillväxthastigheten för LNC efter P9 minskade signifikant (Tabell 2). När det gäller cellmorfologi var LNC spindelformade och runda i P0. Efter P3 var LNC spindelformade med samma morfologiska storlek (figur 2). Omfattningen av den totala expansionen mättes som antalet populationsfördubblingar från P0 till P13 med hjälp av följande formel: antal cellfördubblingar (NCD) = log10 (y/x) / log102, där y är den slutliga tätheten av celler och x är den initiala såddtätheten av celler3. NCD representerar tillväxttakten för LNC (figur 3A). Från NCD- och ackumulativ-NCD-kurvorna (figur 3B) tog det minst tid för LNC att öka exponentiellt och växte snabbast från P3-P5 (figur 3). Efter P5 minskade celltillväxthastigheten signifikant, NCD återgick till 1,32 i P13 och tillväxten avstannade nästan.
Identifiering av LNC
Efter isoleringen och kulturen av LNC var en annan viktig uppgift identifiering. LNC uttrycks för Vim, CD90, CD105, SCF och PDGFRβ, men inte Pan-CK, enligt aktuella relevanta studier om LNC (figur 4)9. Dubbel immunfärgning av LNC P4 avslöjade att dessa celler genomgående var Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (Figur 4). qPCR visade också minskat Pan-CK-uttryck i P2 och ökade Vim-, CD90-, CD105-, SCF- och PDGFR-transkript i P3. Transkriptionsnivåerna av Vim, CD90, CD105, SCF och PDGFR ökade dramatiskt i P4 jämfört med P1 (p < 0,01) (Figur 4)9.
Egenskaper hos LNC
Ytterligare analys visade att LNC uttryckte fler markörer för embryonala stamceller (ESC) (Nestin, Rex1 och SSEA4), mesenkymala stamcellsmarkörer (MSC) (CD73, CD90 och CD105) och nischcellsmarkörer (NC) (MSX1, P75NTR och PDGFRβ) (Figur 5)15. Flödescytometri indikerade att ytantigenegenskaper hos MSC, inklusive CD73, CD90 och CD105, uttrycktes i både LNC och BMMSCs15. Procentandelarna LNC som uttryckte CD73, CD90, CD105 och SCF var cirka 95 %, 97 %, 92 % respektive 11 %, medan BMMSC:erna var 68 %, 99 %, 20 % respektive 3 %. Detta visar att LNC uttrycker signifikant högre nivåer av MSC-positiva markörer CD73, CD105 och cytokinen SCF (p < 0,01) och en liknande nivå av CD90 (p > 0,05) jämfört med BMMSCs (Figur 6)15.
Figur 1: LNCs isoleringsprocess . (A) Corneoscleral rimvävnad. (B) Klasar efter kollagenas A uppslutning vid 37 °C i 18 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: P0 till P13 LNC odlade på 5 % basalmembranmatrisbelagd 6-hålsplatta i MESCM. (Bar = 50 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tillväxtmönstret för LNC från P0-P13. A) NCD för LNC från P0-P13. (B) Den kumulativa NCD för LNC från P0-P13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofluorescens och qPCR. Immunofluorescens och qPCR visade att LNC enhetligt uttryckte Vim, CD90, CD105, SCF och PDGFRβ, men inte Pan-CK. Denna figur har återgetts med tillstånd från Zhu et al.9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: LNC uttrycker fler ESC-, MSC- och NC-markörer än BMMSC. P4 LNC och P4 BMMSCs utsattes för qPCR för transkriptionsuttryck av ESC-markörer (A), MSC och neurala toppmarkörer (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 respektive **p < 0,01). Immunfärgning av ESC-markörer (C) och MSC, NC-markörer (D), med nukleär motfärgning av Hoechst 33342. Skalstreck = 25 μm. Denna figur har återgetts med tillstånd från Li et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Fluorescensaktiverad cellsortering av P4 LNC och BMMSC (A-F). Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys av MSC-markörer inklusive CD73, CD90 och CD105 (n=3). Denna figur har återgetts med tillstånd från Li et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Stamlösningens koncentration | Volym | Slutlig koncentration | Lagringsmiljö |
| DME/F-12 1:1(1×) | Grundläggande medium | 180 ml | 90% | 4 °C |
| KnockOutTMSR (på engelska) | - | 20 ml | 10% | -20 °C |
| Serumersättning för ESCs/iPSCs | ||||
| Rekominant humanleukemihämmande faktor (Lif) | 50 μg/ml | 40 μL | 10 ng/ml | -80 °C |
| Rekombinant human FGF-basisk | 100 μg/ml | 8 μL | 4 ng/ml | -80 °C |
| ITS (insulin, transferrin, natriumselenit) | 500 μg/ml insulin | 2 ml | 5 μg/ml insulin | -20 °C |
| 500 μg/ml transferrin | 5 μg/ml transferrin | |||
| 500 ng/ml natriumselenit | 5 ng/ml natriumselenit | |||
| Gentamicin | 25 μg/ml | 2 ml | 50 μg/ml | 4 °C |
| Amfotericin B | 2500 μg/ml | 100 μL | 1,25 μg/ml | 4 °C |
Tabell 1: MESCM-formulering.
| Passage | Såddtäthet (× 105 celler/cm2) | Slutlig densitet (× 105celler/cm2) | Kulturtid (dagar) | Antal cellfördubblingar (NCD) | Ackumulerad icke smittsam sjukdom |
| P0 | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6 | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7 | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12 | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
Tabell 2: Seriepassager av LNC på plast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinnans transparens upprätthålls vanligtvis genom regelbunden placering och fördelning av små fibrer (25-30 nm i diameter) i hornhinnans stroma, vilket är avgörande för normal synskärpa16. Det finns 253 miljoner synskadade i världen, varav 36 miljonerär blinda. Världshälsoorganisationen (WHO) anser att hornhinneblindhet är en av de allvarligaste farorna för människans syn och står för 5,1 % av all blindhet i världen16. Hornhinneepiteldefekt med normal CES kan läka snabbt utan att lämna ett ärr18. Det uppskattas att mer än 12,7 miljoner patienter världen över behöver hornhinnetransplantationer på grund av måttlig till svår synförlust19; 30 % av hornhinnetransplantationerna orsakades av CESD20. Men på grund av bristen på hornhinnedonation i de flesta länder i världen kunde endast en av sjuttio hornhinneblinda patienter så småningom få hornhinnetransplantation21. För närvarande kan stamcellstransplantation av hornhinneepitel (CEST) användas för att behandla CESD22. Patienter med monokulär CESD kan få CES från friska ögon för CEST. För patienter med bilateral CESD kan dock endast allogen CES erhållas för behandling. Immunavstötning är fortfarande den främsta orsaken till att allogen CEST misslyckas. En lovande metod för att minska den terapeutiska behandlingen av CESD är att hitta en cell som effektivt kan ersätta autogen CES eller uppmuntra differentiering av andra autogena celler från andra platser för att bli CES. In vitro-differentiering av autologa celler till CES blir också populärt, inklusive BMMSC23, orala slemhinneepitelceller (OMEC)24, tandpulpastamceller (DPSC)19, humana fibroblast-härledda pluripotenta stamceller (iPSC)25 och fettstamceller (ASC)26. Rohaina et al.23fann att BMMSC:er odlade på fosterhinnor i 10 dagar kunde differentiera till hornhinneepitelceller och att CK3- och p63-uttrycket ökade signifikant efter induktion av differentiering. År 2020 inducerade O'Callaghan et al.24differentieringen av orala slemhinneepitelceller till hornhinneepitelceller med hjälp av ett nytt odlingssystem och använde det framgångsrikt för att behandla CESD med hjälp av en 3D-vävnadsstruktur (RAFT) som ett stöd för oral mukosal epitelcellodling med humana orala slemhinnefibroblaster som trofoblaster. Dessutom differentierar DPSC framgångsrikt till stroma- och epitelceller i hornhinnan. Genom att uppreglera uttrycket av K3, K12 och CD90 kan DPSC förhindra invasion av hornhinnans konjunktival. I en annan studie användes DPSC som fostervattenceller som åkte snålskjuts på hornhinnans yta i en kanin-CESD-modell. Resultaten visade att DPSC-gruppen hade renare hornhinnor och mindre angiogenes än kontrollgruppen27. Hayashi et al.28uppnådde differentiering med hjälp av fibroblast-härledd iPSC som kunde induceras i PAX6(+) och K12(+) hornhinneepitelceller efter 12 veckor. iPSC utvecklas effektivt till hornhinneepitelceller, aktiverar K12 och undertrycker NANOG25. Zeppieri et al.26 upptäckte att ASC:er kunde differentiera till hornhinneepitelceller för att bota CESD hos möss och förbättra sårläkning av hornhinneepitel i en laserinducerad djurmodell.
LNC:er lokaliseras i den limbala nischen, där CES skyddas och stöds, och har många egenskaper som liknar MSC. LNC:er isolerades först av Polisetty et al.2 och namngavs först av Xie et al.3. Enligt nya studier är LNC mer grundläggande stamceller än MSC och kan lätt differentieras till adipocyter, kondrocyter och osteocyter 4,29. Jämfört med de vanliga BMMSC:erna visar LNC större stamcellsegenskaper (högre uttryck av CD73, CD105, PDGFR, SCF, etc.) (Figur 5) 30. LNC kan framgångsrikt behandla kaniner med CESD orsakad av hornhinnealkalibrännskador genom att främja reparationen av hornhinnans epitel och stroma15. Det minskade uttrycket av fibronektin (FN), bindvävstillväxtfaktor (CTGF) och utsöndrat protein surt och cysteinrikt (SPARC) i hornhinnans fibroblaster tyder på att LNCs utsöndring förbättrar sårläkning och minskar fibros7.
Det intressanta i en 3D-mikromiljö är att LNC kan återförenas med MCEC, vilket stimulerar de senare cellerna att återställa stamcellernas egenskaper9. LNC påskyndar effektivt CES-tillväxten31 och förhindrar ärrbildning på hornhinnan10. Mängden LNC är dock begränsad; Studier har visat att det endast representerar cirka 3 % av det totala antalet limbala stromaceller i hornhinnanhos nötkreatur 32, med signifikant uttryck av keratansulfat, keratokan och ALDH3A133. De kan vara mindre än 1 % i mänskliga hornhinnor33.
I detta protokoll upprepades tidigare metoder för att isolera, rena och identifiera LNC 3,14,34. Efter 18 timmars behandling av human limbusvävnad med kollagenas A (2 mg/ml) isolerades LNC. P0 LNC utvecklades långsamt och uppvisade olika cellmorfologier, inklusive spindelformade LNCs, polygonala andra och synlig sfärisk MCEC (Figur 2, P0). Tidigare studier har visat att LNC är spindelformade celler som fäster på botten av odlingsytan med homogen morfologi14. Samtidigt är MCEC runt29, vilket överensstämmer med morfologin hos cellerna som odlas i detta protokoll. Dessutom växte P0 LNC långsamt till cellerna som växte fullt cirka 70%-80% av celltätheten på cirka 12 dagar. P1-P12 LNC förökade sig betydligt snabbare och täckte på 3-6 dagar praktiskt taget hela odlingsplattan. Efter P1 var spindelformade LNCs adnexala celler betydligt fler än runda MCEC- och polygonalceller.
Det framgår tydligt av NCD-värdena i tabell 2 och figur 3 att LNC P0 hade den lägsta NCD (0,810) och att cellpassagen skedde under 12 dagar. Men efter P1 accelererade tillväxten av LNC dramatiskt, och tillväxttakten nådde en topp på 3,44 i P4. Efter P6 minskade tillväxttakten för LNA avsevärt (figur 3). LNCs tillväxttakt och aktivitet för P4 var väsentligt de högsta när det gäller LNCs tillväxtmönster, vilket överensstämmer med tidigare resultat som indikerar att P4-P6 LNCs tillväxtaktivitet är den bästa9. Denna metod har dock vissa begränsningar, antalet LNC P0 varierar mycket beroende på donatorns ålder och tidpunkten för dödsfallet. Därför, när donatorvävnaden är yngre och fräschare, kan mer P0 LNC isoleras. Den viktigaste faktorn för att efterlikna mikromiljön i CES in vitro är behovet av universella nischfaktorer, såsom en laminaminrik extracellulär matris35.
Sammanfattningsvis spelar LNC en avgörande roll för att stödja hornhinneepitelstamceller och upprätthålla stammen i CES, inklusive självförnyelse och differentiering till mogna hornhinneepitelceller. LNC kan förväntas vara ett innovativt cellverktyg för behandling av patienter med CESD 9,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några relevanta finansiella upplysningar.
Acknowledgments
Tack till Wei Wang, Lingjuan Xu och Rong Liu för vägledningen i detta arbete, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You och Li Guigang för att ha tillhandahållit en del av materialet, Guanyu Su för att ha skrivit manuskriptet, Xiao Zhou, Yihong Xiong och Huatao Xie för att ha korrigerat manuskriptet, och Guigang Li för hans fullständiga vägledning. Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 82070936, 81470606, 81570819), Hubei-provinsens hälso- och familjeplaneringsvetenskapliga forskningsprojekt (nr. WJ2017M073), Topp tio translationella medicinska forskningsprojekt från Tongji Hospital (No.2016ZHYX20), Utbildningsprojekt för unga medicinska pionjärer i Wuhan City (No.2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), National Health Commission of Hubei Province project 2022(WJ2021ZH0005) och Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei 2022(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
- Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
- Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
- Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
- Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
- Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
- Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
- Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16 (2020).
- Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1 (2022).
- Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172 (2014).
- Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
- Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
- Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471 (2022).
- Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
- Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566 (2018).
- Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
- Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441 (2022).
- Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562 (2022).
- Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
- Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
- O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265 (2020).
- Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
- Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115 (2017).
- Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
- Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
- Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
- Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
- González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
- Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
- Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y.
- Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).
