Summary
여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
여기서는 변연 틈새 세포(LNC)의 분리 및 식별을 위한 표준 절차를 보고합니다. 안구 은행에서 얻은 림버스 조직을 LNC 분리에 사용했습니다. 조직을 무균 조건에서 12개의 조각으로 나누고, LNC 및 변연 상피 전구 세포가 있는 세포 클러스터를 얻기 위해 콜라겐분해효소 A를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 동안 절단했습니다. 세포 클러스터를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 15분 동안 추가로 절단하여 단일 세포를 얻은 후 5% Matrigel로 코팅된 플라스틱 표면에 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 배양했습니다. 세포는 70% 합류 시 통과되었으며 면역형광, 실시간 정량 PCR(qPCR) 및 유세포 분석을 사용하여 LNC를 식별했습니다. 1차 LNC는 12회 이상 격리 및 통과되었습니다. P4에서 P6까지 LNC의 확산 활동이 가장 높았습니다. LNC는 BMMSC보다 더 높은 줄기세포 마커를 발현했습니다(SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, PDGFRβ). 또한, P4 LNC는 VIM, CD90, CD105 및 PDGFRβ를 균일하게 발현하는 것으로 나타났지만, LNC 식별을 위한 마커로 사용할 수 있는 Pan-CK는 발현하지 않았습니다. 유세포 분석 결과, LNC의 약 95%, 97%, 92% 및 11%가 각각 CD73, CD90, CD105 및 SCF를 발현한 반면, BMMSC에서는 68%, 99%, 20% 및 3%였습니다. LNC 분리 및 식별을 위한 표준 공정은 LNC의 광범위한 사용을 위한 신뢰할 수 있는 실험실 기반을 제공할 수 있습니다.
Introduction
각막 감염 및 손상으로 인해 각막 상피 줄기세포 결핍증(LSCD)1이라고도 하는 각막 상피 줄기세포 결핍증(CESD)과 각막 상피 재생(CES)의 발생률이 점점 더 시급해지고 있습니다. CESD를 제대로 치료하지 않으면 각막 이식이 필요한 실명으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, CES 재생이 더욱 중요해지고 있습니다. CES 기능에 필수적인 지원을 제공하는 LNC(limbal niche cell)라고 하는 지지 세포 그룹이 있습니다. Limbal stromal stem cell은 Polisetty et al.2에 의해 처음 분리되었고, Xie et al.3에 의해 limbus의 limbal epithelium subjacent 및 stroma에 국한된 LNC로 확인되었습니다. LNC는 각막 가장자리의 핵심 지원 줄기세포이며 골수 유래 MSC(BMMSC)의 기능을 가지고 있으며 각막 상피 세포 및 각막 기질 세포 등으로 발달하도록 유도될 수 있습니다.3,4,5,6,7. 이전 연구에 따르면 LNC의 줄기세포 품질은 이미 임상에서 널리 사용되고 있는 BMMSCs8보다 더 원시적입니다. LNC는 특히 CESD 치료에 MSC 다음으로 실행 가능한 옵션이 될 수도 있습니다. CES의 중요한 지원 세포인 LNC는 림버스의 "틈새" 구조에서 파생된 줄기 세포이기도 합니다. LNC는 성숙한 각막 상피 세포(MCEC)를 CES9에 대한 역분화에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 그러나 LNC에 대한 연구는 여전히 상대적으로 미흡하며, LNC의 용어, 분리, 정제, 식별 및 특성에 대한 합의가 이루어지지 않고 있다. 일부 연구자들은 LNC를 윤부 생검 유래 기질 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)10, 윤부 중간엽 줄기 세포(limbal mesenchymal stem cells)11, 윤부 섬유아세포 줄기 세포(limbal fibroblast stem cells) 12, 그리고 윤부 중간엽 기질 세포(limbal mesenchymal stromal cells)13로 명명했다. LNC의 성장 특성이 상세히 기술되지 않았고, 유망한 과학 및 임상 응용이 가능하고, 향후 가장 중요한 임상 도구 중 하나가 될 수 있기 때문에 LNC의 분리, 정제, 식별 및 특성을 요약할 필요가 있습니다.
선행 연구14에 따르면, LNC는 주로 변연 상피(limbal epithelium subjacent)와 변연(limbus)의 기질(stroma)에 존재한다. 이 프로토콜에는 콜라겐분해효소 A를 사용하여 변연 조직을 처리하고, LEPC 및 LNC로 구성된 클러스터를 얻고, 0.25% 트립신-EDTA(TE)를 사용하여 단일 세포로 분해하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 LNC를 변형된 배아 줄기 세포 배지(MESCM)에서 선택적으로 배양하여 정제했습니다. 이 논문에 보고된 프로토콜은 간단하며 인간 LNC를 대량으로 얻는 데 높은 효율성을 가지고 있습니다.
LNC 연구에 관심이 있는 과학자들을 위해 LNC 분리, 배양, 동정에 대한 자세한 절차를 영상에 담았으며, 필요할 때 편리하게 반복할 수 있습니다.
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Protocol
50세에서 60세 사이의 기증자로부터 림버스 조직을 Tongji Hospital(중국 우한)의 적십자 안구 은행에서 얻었습니다. 이 의정서는 통지 윤리위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.
1. 격리
- 중간 각막 보관 배지에서 연봉 조직을 얻고 매우 깨끗한 작업대에서 무균 조건에서 작업합니다.
- 멸균 수술용 원형 칼날을 사용하여 각막 주변의 홍채와 내피를 긁어내고 제거합니다.
- 각막과 공막의 양쪽에 1mm가 남은 수술용 칼날을 사용하여 변막 조직을 동일한 크기의 12개 조각으로 자릅니다.
- 연엽 조직을 3.5cm 배양 플레이트에 옮기고 콜라겐분해효소 A 1mL(DF-12 배지 2mg/mL)를 추가하여 모든 조직을 소화를 위해 담급니다.
- 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에 넣고 18시간 동안 윤부 조직을 소화합니다.
알림: 후속 절차는 일반적으로 둘째 날에 수행됩니다. - 5% 기저막 매트릭스(Matrigel)로 코팅된 6웰 배양 플레이트를 준비합니다.
- 우물 바닥에 5% 기저막 매트릭스(MESCM[표 1]에 용해됨)를 코팅합니다.
- 멸균 백에 200μL 및 1mL 팁, 15mL 원심 튜브 1개, 6웰 플레이트 1개를 준비합니다.
- 멸균 백(팁 및 원심 튜브 포함)과 새 6웰 플레이트를 -20°C 또는 -80°C 환경에서 20분 동안 놓습니다. 기저막 매트릭스를 4°C의 냉장고에서 해동합니다.
- -6°C 또는 -20°C 환경에서 예냉식 팁, 원심 튜브 및 80웰 플레이트를 꺼낸 후 매우 깨끗한 작업대에서 다음 작업을 수행합니다.
- 200μL 팁을 사용하여 50μL 5% 기저막 매트릭스를 1mL MESCM으로 옮기고 부드럽고 고르게 혼합합니다.
- 사전 냉각된 1mL 팁을 사용하여 5% 기저막 매트릭스(MESCM에 용해됨)를 6웰 배양 플레이트의 웰 1개로 옮깁니다.
- 6-웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔들고 6-웰 배양 플레이트를 37°C 세포 인큐베이터에 약 1시간 동안 넣은 후 다음 단계를 수행합니다.
- 18시간 소화 후 콜라겐분해효소 A-소화된 변부 조직을 꺼내면 눈에 보이는 작은 덩어리와 소화되지 않은 공막 조직만 남게 됩니다.
참고: 고배율 현미경은 조밀하게 채워진 많은 세포(LNC 포함)로 구성된 클러스터를 보여줍니다. - 200μL 피펫 팁을 사용하여 실체현미경으로 소화되지 않은 공막 조직에서 클러스터를 분리합니다.
- 클러스터를 3.5cm 배양 플레이트로 옮기고 0.25% TE에 담근 다음 플레이트를 세포 인큐베이터에 15분 동안 둡니다.
- 10% 녹아웃 혈청이 포함된 1mL MESCM을 추가하여 세포 분해를 중지하고 1mL 피펫 팁을 사용하여 클러스터를 개별 세포에 재현탁시키기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
- 셀 현탁액을 15mL 원심 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 세포 침전을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거한 다음 1mL MESCM을 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.
- 1mL 피펫 팁을 사용하여 하단 셀 침전이 MESCM에 고르게 현탁될 때까지 피펫팅을 2-3회 위아래로 수행하고 세포 계수를 위해 20μL 세포 현탁액을 사용합니다.
- 세포 현탁액을 1mL 피펫 팁이 있는 5% 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트로 옮기고 MESCM의 부피를 2.5mL로 늘립니다.
- 6웰 플레이트를 수평으로 부드럽게 흔들어 셀이 고르게 분포되도록 합니다.
- 세포를 이미징하고 기록한 후 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 매일 세포를 관찰하고 사진을 찍고 3-4일마다 배지를 교체합니다.
2. LNC의 식별
- 면역형광 염색
- 37°C 세포 인큐베이터에서 5분 동안 1mL 0.25% TE를 사용하여 플레이트 바닥에서 LNC를 분해합니다.
- 1mL MESCM(녹아웃 혈청 포함)을 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
- 1mL MESCM을 추가하여 현탁 중인 세포를 재현탁시킵니다. 4개의 슬라이드(20μL/슬라이드)를 위한 80μL 셀 현탁액(슬라이드당 4 × 103 개의 셀)을 준비하고 원심분리 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 현미경 슬라이드에 세포를 증착합니다.
- 약 3 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 세포 (4 단계의 슬라이드에 부착)를 고정 한 다음 PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 슬라이드의 세포를 15 분 동안 투과시킵니다.
- 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 세포를 차단한 후 1차 항체(Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100])로 4°C에서 밤새 배양합니다. 배양 후 PBST(PBS + 0.1% Tween 20)로 슬라이드를 세척(5분/세척, 3회)하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
- 해당 2차 항체(당나귀 항 마우스 IgG 2차 항체 TRITC [1:1000], 당나귀 항 토끼 IgG FITC [1:500], 당나귀 항 마우스 IgG 488 [1:300], 당나귀 항 토끼 IgG 594 [1:400])를 적절한 IgG 비특이적 IgG 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다. PBST(5분/세척, 3회)를 사용하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
- 5 μg/mL DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)로 핵을 대조염색하고 슬라이드를 밀봉합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다(배율: 400x; 노출 시간: 50 ms).
- 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)
- RNA Isolation Kit를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 전체 RNA를 추출합니다.
- 고용량 cDNA 전사 키트를 사용하여 총 RNA 1-2μg을 cDNA로 역전사합니다.
- cDNA(100ng), TaqMan 유전자 발현 분석 믹스(1μL), 범용 PCR 마스터 믹스(10μL) 및 ddH 2O(20μL)를 포함하는20μL용액에서 역전사(42°C, 2분, 50°C, 85분) 및 qPCR(95°C, 5분, 95°C, 10초, 40사이클)을 수행합니다.
- 비교 CT 기법(ΔΔCT)4,9을 사용하여 상대적인 유전자 발현을 검사합니다.
3. LNC의 특성화
- 세포 계수(혈구계)
- 37°C 세포 인큐베이터에서 5분 동안 0.25% TE를 사용하여 플레이트 바닥에서 LNC를 분해합니다.
- 1mL MESCM(녹아웃 혈청 포함)을 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 200 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
- 1mL MESCM을 추가하여 세포를 재현탁시킨 다음 0.5mL 원심분리 튜브에 10μL 세포 현탁액을 넣습니다. 동일한 부피의 0.4% 트리판 블루 염색 용액을 추가합니다.
- 혈구계의 계수 영역에 10μL 염색 세포 현탁액을 놓고 계수를 위해 커버슬립으로 덮습니다.
참고: 5개의 중간 사각형 영역에 있는 셀 수는 "A"로 정의됩니다. 1mL의 세포 수는 5A × 104 × 2로 계산됩니다.
- 유세포 분석을 통한 LNC 및 BMMSC 마커 검사15
- 유세포 분석 15를 사용하여 LNC 및 BMMSC에서 SCF, CD73, CD90 및 CD105의 발현을 검출합니다(2-4 ×10 6 이벤트/샘플, 각 샘플에서 2,000개의 세포를 획득하여 총 550,000개의 세포를 동시에 게이트됨).
- 키트 지침에 따라 사전 표지된 항체(SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] 및 CD105 [1:50])를 사용하여 차단 완충액(PBS에서 3% BSA 및 0.05% Tween-20)에서 20-30°C에서 15분 동안 세포를 수집하고 염색합니다.
- 유세포 분석기를 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 수행합니다. 본 연구에서는 FACS Diva 소프트웨어와 FlowJo 소프트웨어를 사용하였다. 각 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 기록하고 살아있는 세포를 게이트 및 분석합니다.
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Representative Results
LNC의 성장
LNC는 상술한 바와 같이 각막 공막 테두리 조직의 콜라겐분해효소 A(2mg/mL) 분해 방법에 따라 성공적으로 분리하였다(그림 1). 이전에 보고된 연구3과 일치하게, 콜라겐분해효소 A 분해 후 애벌레와 같은 클러스터가 현미경으로 시각화되었습니다(그림 2). 방추 셀의 비율은 세포 통로에 따라 점차적으로 증가했습니다. 방추 모양의 세포는 코팅된 기저막 매트릭스3 없이 플라스틱에서 배양된 세포와 달리 코팅된 5% 기저막 매트릭스 플레이트에서 자랄 수 있습니다. P1에서 P12까지의 세포는 2일에서 7일 사이의 세포 배증 시간으로 균일한 증식 속도를 나타냈습니다(표 2). 이 연구에서 LNC는 13개의 통로와 34개의 더블링으로 배양되었습니다(그림 3)3. LNC는 1차 세포(LNC P0)로부터 배양하였다; LNC P0는 천천히 성장하여 약 12일이 걸렸습니다. LNC는 P1-P8을 통과하는 데 약 3일밖에 걸리지 않았으며, P9 이후 LNC의 성장률은 크게 감소했다(표 2). 세포 형태 측면에서 LNC는 방추형 모양이었고 P0에서 둥글었습니다. P3 이후 LNC는 동일한 형태학적 크기를 가진 방추체 모양이었습니다(그림 2). 총 팽창 정도는 다음 공식을 사용하여 P0에서 P13까지 두 배로 증가하는 개체군의 수로 측정되었습니다: 세포 이중화 수(NCD) = log10(y/x) / log102, 여기서 y는 세포의 최종 밀도이고 x는 세포의 초기 시드 밀도3입니다. NCD는 LNC의 성장률을 나타냅니다(그림 3A). NCD 및 누적 NCD 곡선(그림 3B)에서 LNC는 기하급수적으로 증가하는 데 가장 적은 시간이 걸렸으며 P3-P5에서 가장 빠르게 성장했습니다(그림 3). P5 이후, 세포 성장률은 현저히 감소했고, NCD는 P13에서 1.32로 돌아갔으며, 성장은 거의 멈췄습니다.
LNC 식별
LNC의 격리 및 배양 이후 또 다른 중요한 작업은 식별이었습니다. LNC에 대한 현재 관련 연구에 따르면 Vim, CD90, CD105, SCF 및 PDGFRβ에 대해 발현되는 LNC는 Pan-CK에 대해 발현되지 않습니다(그림 4)9. 이중 면역염색 LNC P4는 이러한 세포가 일관되게 Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+임을 보여주었습니다(그림 4). qPCR은 또한 P2에서 Pan-CK 발현을 감소시키고 P3에서 Vim, CD90, CD105, SCF 및 PDGFR 전사체를 증가시켰습니다. Vim, CD90, CD105, SCF 및 PDGFR의 전사 수준은 P1에 비해 P4에서 극적으로 증가했습니다(p < 0.01)(그림 4)9.
LNC의 특징
추가 분석 결과, LNC는 배아 줄기 세포(ESC) 마커(Nestin, Rex1 및 SSEA4), 중간엽 줄기 세포(MSC) 마커(CD73, CD90 및 CD105) 및 틈새 세포(NC) 마커(MSX1, P75NTR 및 PDGFRβ)를 더 많이 발현하는 것으로 나타났습니다(그림 5)15. 유세포 분석법은 CD73, CD90 및 CD105를 포함하는 MSC의 표면 항원 특성이 LNC 및 BMMSC 모두에서 발현되었음을 나타냈다15. CD73, CD90, CD105 및 SCF를 발현하는 LNC의 비율은 각각 약 95%, 97%, 92% 및 11%인 반면, BMMSC의 비율은 각각 68%, 99%, 20% 및 3%였습니다. 이는 LNC가 BMMSC에 비해 MSC 양성 마커 CD73, CD105 및 사이토카인 SCF(p < 0.01)와 유사한 수준의 CD90(p > 0.05)을 훨씬 더 많이 발현한다는 것을 보여줍니다(그림 6)15).
그림 1: LNC 분리 공정. (A) 각막 공막 테두리 조직. (B) 콜라겐분해효소 A 분해 후 37°C에서 18시간 동안 축적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MESCM의 5% 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에서 배양된 P0 - P13 LNC. (Bar = 50μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: P0-P13에서 LNC의 성장 패턴. (A) P0-P13의 LNC의 NCD; (B) P0-P13의 LNC의 누적 NCD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역형광 및 qPCR. 면역형광 및 qPCR은 LNC가 Vim, CD90, CD105, SCF 및 PDGFRβ를 균일하게 발현하지만 Pan-CK는 발현하지 않는 것으로 나타났습니다. 이 그림은 Zhu et al.9의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LNC는 BMMSC보다 ESC, MSC 및 NC 마커를 더 많이 표현합니다. P4 LNC 및 P4 BMMSC는 ESC 마커 (A), MSC 및 신경능선 마커 (B)의 전사 발현을 위해 qPCR을 실시하였다(각각 n=3, *P < 0.05, #P < 0.05 및 **p < 0.01). Hoechst 33342에 의한 핵 대조염색을 사용한 ESC 마커(C) 및 MSC, NC 마커(D)의 면역염색. 스케일 바 = 25 μm. 이 그림은 Li et al.15의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: P4 LNC 및 BMMSC(A-F)의 형광 활성화 세포 분류. CD73, CD90 및 CD105를 포함한 MSC 마커의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석(n=3). 이 그림은 Li et al.15의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 원액의 농도 | 음량 | 최종 농도 | 보관 환경 |
| DME/F-12 1:1(1×) | 베이직 미디엄 | 180 mL | 90% | 4 캜 |
| 넉아웃TMSR | - | 20 mL | 10% | -20 캜 |
| ESC/iPSC를 위한 혈청 대체 | ||||
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor (인간 백혈병 억제 인자) | 50μg/mL | 40 μL | 10ng/mL | -80 캜 |
| 재조합 인간 FGF-basic | 100μg/mL | 8 μL | 4ng/mL | -80 캜 |
| ITS(인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨) | 500μg/mL 인슐린 | 2mL | 5μg/mL 인슐린 | -20 캜 |
| 500μg/mL 트랜스페린 | 5μg/mL 트랜스페린 | |||
| 500ng/Ml 셀렌산나트륨 | 5ng/mL 셀렌산나트륨 | |||
| 겐타마이신 | 25μg/mL | 2mL | 50μg/mL | 4 캜 |
| 암포테리신 B | 2500μg/mL | 100 μL | 1.25μg/mL | 4 캜 |
표 1: MESCM 공식화.
| 통로 | 파종 밀도(× 105셀/cm2) | 최종 밀도(× 105셀/cm2) | 문화권 시간(일) | 세포 더블링 수(NCD) | 누적 NCD |
| P0 (피0) | 0.22 | 0.385714 | 12 | 0.810029 | 0.810029 |
| P1 (피1) | 0.08 | 0.365714 | 4 | 2.192645 | 3.002674 |
| P2 (P2) | 0.051429 | 0.357143 | 3 | 2.795859 | 5.798533 |
| P3 시리즈 | 0.037143 | 0.337143 | 2 | 3.182203 | 8.980737 |
| P4 시리즈 | 0.028571 | 0.311429 | 6 | 3.446256 | 12.42699 |
| P5 시리즈 | 0.04 | 0.385714 | 3 | 3.269461 | 15.69645 |
| P6 (영어) | 0.054286 | 0.48 | 4 | 3.14439 | 18.84084 |
| P7 (피7) | 0.057143 | 0.351429 | 3 | 2.620586 | 21.46143 |
| P8 시리즈 | 0.08 | 0.394286 | 3 | 2.30117 | 23.7626 |
| P9 시리즈 | 0.06 | 0.345714 | 6 | 2.526546 | 26.28915 |
| P10 시리즈 | 0.022857 | 0.122857 | 7 | 2.426265 | 28.71541 |
| P11 | 0.025714 | 0.122857 | 5 | 2.25634 | 30.97175 |
| P12 (영어) | 0.028571 | 0.114286 | 5 | 2 | 32.97175 |
| P13 | 0.045714 | 0.114286 | 10 | 1.321928 | 34.29368 |
표 2: 플라스틱에 대한 LNC의 직렬 통로.
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Discussion
각막 투명도는 일반적으로 각막 기질에 작은 섬유(직경 25-30nm)의 규칙적인 배열과 분포에 의해 유지되며, 이는 정상 시력에 매우 중요하다16. 전 세계적으로 2억 5,300만 명의 시각 장애인이 있으며, 그 중 3,600만 명이 시각 장애인입니다17. 세계보건기구(WHO)는 각막 실명을 인간의 시력에 가장 심각한 위험 중 하나로 간주하며, 전 세계 실명의 5.1%를 차지합니다16. 정상적인 CES의 각막 상피 결손은 흉터를 남기지 않고 빠르게 치유될 수 있다18. 전 세계적으로 1,270만 명 이상의 환자가 중등도에서 중증의 시력 상실로 인해 각막 이식이 필요한 것으로 추정됩니다19; 각막 이식 실패의 30%는 CESD20에 의해 발생했습니다. 그러나 전 세계 대부분의 국가에서 각막 기증이 부족하기 때문에 각막 실명 환자 70명 중 1명만이 결국 각막 이식을 받을 수 있었다21. 현재 각막 상피 줄기 세포 이식(CEST)은 CESD22를 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 단안 CESD 환자는 CEST를 위해 건강한 눈에서 CES를 얻을 수 있습니다. 그러나 양측 CESD 환자의 경우 동종 CES만 치료할 수 있습니다. 면역 거부 반응은 동종 CEST의 실패의 주요 원인으로 남아 있습니다. CESD의 치료 방법을 줄이는 유망한 방법은 자가 CES를 효과적으로 대체하거나 다른 곳에서 다른 자가 세포의 분화를 촉진하여 CES가 될 수 있는 세포를 찾는 것입니다. BMMSC23, 구강 점막 상피 세포(OMEC)24, 치수 줄기 세포(DPSC)19, 인간 섬유아세포 유래 만능 줄기 세포(iPSC)25 및 지방 줄기 세포(ASC)26를 포함하여 CES로의 자가 세포의 체외 분화도 대중화되고 있습니다. Rohaina et al.23은 양막에서 10일 동안 배양한 BMMSC가 각막 상피 세포로 분화할 수 있고 분화 유도 후 CK3 및 p63 발현이 크게 증가했음을 발견했습니다. 2020년 O'Callaghan et al.24은 새로운 배양 시스템을 사용하여 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 세포로 분화시키고, 인간 구강 점막 섬유아세포를 영양아세포로 하여 구강 점막 상피 세포 배양을 위한 지원으로 3D 조직 구조(RAFT)를 사용하여 CESD 치료에 성공적으로 사용했습니다. 또한 DPSC는 각막 기질 세포와 상피 세포로 성공적으로 분화합니다. DPSC는 K3, K12, CD90의 발현을 상향 조절하여 각막 결막 침범을 예방할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 토끼 CESD 모델에서 DPSC를 각막 표면에 편승한 양수 세포 시트로 사용했습니다. 그 결과, DPSC 그룹은 대조군보다 각막이 더 깨끗하고 혈관신생이 더 적은 것으로 나타났다27. Hayashi et al.28은 12주 후 PAX6(+) 및 K12(+) 각막 상피 세포에서 유도될 수 있는 섬유아세포 유래 iPSC를 사용하여 분화를 달성했습니다. iPSC는 각막 상피세포로 효과적으로 발달하여 K12를 활성화하고 NANOG25를 억제합니다. Zeppieri et al.26은 ASC가 각막 상피 세포로 분화하여 쥐 CESD를 치료하고 레이저 유도 동물 모델에서 각막 상피 상처 치유를 향상시킬 수 있음을 발견했습니다.
LNC는 CES가 보호되고 지원되는 변측 틈새에 국한되며 MSC와 유사한 많은 특성을 가지고 있습니다. LNC는 Polisetty et al.2에 의해 처음 분리되었으며 Xie et al.3에 의해 처음 명명되었습니다. 최근 연구에 따르면 LNC는 MSC보다 더 근본적인 줄기세포이며 지방세포, 연골세포 및 골세포로 쉽게 분화할 수 있습니다 4,29. 일반적으로 사용되는 BMMSC에 비해 LNC는 더 큰 줄기세포 특성(CD73, CD105, PDGFR, SCF 등의 더 높은 발현)을 나타냅니다. (그림 5) 30. LNC는 각막 상피와 기질의 회복을 촉진하여 각막 알칼리 화상으로 인한 CESD가 있는 토끼를 성공적으로 치료할 수 있습니다15. 각막 섬유아세포에서 피브로넥틴(FN), 결합조직성장인자(CTGF), 분비된 산성 및 시스테인 풍부 단백질(SPARC)의 발현이 감소하면 LNC의 분비가 상처 치유를 촉진하고 섬유증을 감소시킨다는 것을 알 수 있다7.
3D 미세환경에서 흥미로운 점은 LNC가 MCEC와 재결합하여 MCEC의 세포를 자극하여 줄기세포 특성을 복원할 수 있다는 점이다9. LNC는 CES 성장을 효과적으로 촉진하고31 각막 흉터를 예방한다10. 그러나 LNC의 수량은 제한되어 있습니다. 연구에 따르면 소 각막의 총 변연 기질 세포 수의 약 3%에 불과하며(32), 케라탄 황산염, 케라토칸 및 ALDH3A133이 크게 발현됩니다. 인간의 각막에서는 1% 미만일 수 있다33.
이 프로토콜에서는 LNC를 분리, 정제 및 식별하는 이전 방법을 반복했습니다 3,14,34. 콜라겐분해효소 A(2mg/mL)로 인간 림버스 조직을 18시간 처리한 후, LNC를 분리했습니다. P0 LNC는 천천히 발달했으며 방추형 LNC, 다각형 기타 및 가시 구형 MCEC를 포함한 다양한 세포 형태를 나타냈습니다(그림 2, P0). 이전 연구들은 LNC가 균질한 형태(homogeneous morphology)를 갖는 배양 표면의 바닥에 부착되는 방추형 세포(spindle-shaped cell)임을 보여주었다14. 동시에, MCEC는29 라운드이며, 이는 이 프로토콜에서 배양된 세포의 형태와 일치합니다. 또한, P0 LNC는 약 12일 내에 세포 밀도의 약 70%-80%까지 완전히 성장하는 세포로 천천히 성장했습니다. P1-P12 LNC는 상당히 빠르게 증식하여 3-6일 만에 전체 배양판을 실질적으로 덮었습니다. P1에 이어 방추형 LNC 부속 세포가 원형 MCEC 및 다각형 세포보다 훨씬 많았습니다.
표 2 및 그림 3의 NCD 값에서 LNC P0가 가장 낮은 NCD(0.810)를 가지며 세포 통과가 12일 동안 발생했음을 알 수 있습니다. 그러나 P1 이후 LNC의 성장이 급격히 가속화되어 P4에서 성장률은 3.44로 정점을 찍었습니다. P6 이후 LNC의 성장률은 크게 감소했습니다(그림 3). LNC의 성장률과 P4의 활성도는 LNC의 성장 패턴 측면에서 실질적으로 가장 높았으며, 이는 P4-P6 LNC의 성장 활성이 가장 우수하다는 것을 나타내는 이전 결과와 일치합니다9. 그러나 이 방법은 특정 한계가 있으며, LNC P0의 수는 기증자의 연령과 사망 시간에 따라 크게 다릅니다. 따라서 기증자 조직이 더 젊고 신선할 때 더 많은 P0 LNC를 분리할 수 있습니다. 시험관 내에서 CES의 미세환경을 모방하는 데 있어 가장 중요한 요인은 라미나민이 풍부한 세포외 기질(35)과 같은 보편적인 틈새 인자에 대한 필요성이다.
결론적으로, LNC는 각막 상피 줄기세포를 지원하고 성숙한 각막 상피 세포로의 자가 재생 및 분화를 포함하여 CES의 줄기세포를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. LNC는 CESD 9,15 환자를 치료하기 위한 혁신적인 세포 도구가 될 것으로 기대할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 관련 재무 공개를 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업을 지도해 준 Wei Wang, Lingjuan Xu, Rong Liu, 일부 자료를 제공한 Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You, Li Guigang, 원고를 작성해 준 Guanyu Su, 원고를 수정해 준 Xiao Zhou, Yihong Xiong, Huatao Xie, 완전한 지도를 해준 Guigang Li에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82070936, 81470606, 81570819), 후베이 성 건강 및 가족 계획 과학 연구 프로젝트 (No. WJ2017M073), 퉁지병원 10대 중개의학 연구 프로젝트(No.2016ZHYX20), 우한시 젊은 의료 개척자 양성 프로젝트(No.2015whzqnyxggrc10), 글로벌 인재 모집 프로그램(G2022154028L), 2022년 후베이성 국가위생건강위원회 프로젝트(WJ2021ZH0005), 2022년 후베이성 재무부 주제 건설 재단(42000022815T000000102)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
References
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