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Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e identificare le cellule di nicchia limbare umane.

Abstract

Di seguito riportiamo una procedura standard per l'isolamento e l'identificazione delle cellule di nicchia limbare (LNC). Il tessuto di libus ottenuto da una banca degli occhi è stato utilizzato per l'isolamento degli LNC. Il tessuto è stato diviso in 12 pezzi in condizioni asettiche e digerito per 18 ore a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari utilizzando la collagenasi A per ottenere cluster cellulari con LNC e cellule progenitrici epiteliali limbari. I cluster di cellule sono stati ulteriormente digeriti per 15 minuti a 37 °C utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per ottenere singole cellule e quindi coltivati in terreno di coltura con cellule staminali embrionali modificate (MESCM) su una superficie di plastica rivestita con Matrigel al 5%. Le cellule sono state fatte passare dopo una confluenza del 70% e le LNC sono state identificate utilizzando l'immunofluorescenza, la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e la citometria a flusso. Gli LNC primari sono stati isolati e attraversati più di 12 volte. L'attività di proliferazione dei LNC da P4 a P6 è stata la più alta. Le LNC esprimevano marcatori di cellule staminali più elevati rispetto alle BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Inoltre, i risultati hanno mostrato che gli LNC P4 esprimevano uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, ma non Pan-CK, che potrebbe essere utilizzato come marcatore per l'identificazione degli LNC. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato che circa il 95%, 97%, 92% e 11% degli LNC esprimeva rispettivamente CD73, CD90, CD105 e SCF, mentre erano rispettivamente il 68%, il 99%, il 20% e il 3% nelle BMMSC. Il processo standard per l'isolamento e l'identificazione degli LNC potrebbe fornire una base di laboratorio affidabile per l'uso diffuso degli LNC.

Introduction

L'incidenza del deficit di cellule staminali epiteliali corneali (CESD), chiamato anche deficit di cellule staminali limbari (LSCD)1, e la rigenerazione epiteliale corneale (CES) stanno diventando sempre più urgenti a causa di infezioni e lesioni corneali. Se non adeguatamente trattata, la CESD può portare alla cecità che richiede il trapianto di cornea. Di conseguenza, la rigenerazione del CES sta diventando sempre più significativa. Esiste un gruppo di cellule di supporto chiamate cellule di nicchia limbare (LNC) che forniscono un supporto essenziale per la funzione CES. Le cellule staminali stromali limbari sono state isolate per la prima volta da Polisetty et al.2 e identificate da Xie et al.3 come LNC che sono localizzate nell'epitelio limbare sottostante e nello stroma del limbus. Le LNC sono le principali cellule staminali di supporto del bordo corneale e, con la funzione delle MSC derivate dal midollo osseo (BMMSC), potrebbero essere indotte a svilupparsi in cellule epiteliali corneali e cellule stromali corneali, ecc.3,4,5,6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che le qualità delle cellule staminali delle LNC sono più primitive rispetto alle BMMSC8, che sono già ampiamente utilizzate in clinica. Le LNC possono anche diventare la prossima opzione praticabile dopo la MSC, soprattutto per il trattamento della CESD. In quanto importanti cellule di supporto per la CES, le LNC sono anche cellule staminali derivate dalla struttura "di nicchia" del limbus. Le LNC possono svolgere un ruolo chiave nella dedifferenziazione delle cellule epiteliali corneali mature (MCEC) in CES9. Tuttavia, gli studi sugli LNC sono ancora relativamente insufficienti e non c'è consenso sulla terminologia, l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche degli LNC. Alcuni ricercatori hanno chiamato cellule staminali stromali derivate da biopsia limbareLNC 10, cellule staminali mesenchimalilimbari 11, cellule staminali dei fibroblasti limbari12 e cellule stromali mesenchimali limbari13. Poiché le caratteristiche di crescita delle LNC non sono state descritte in dettaglio e a causa delle loro promettenti applicazioni scientifiche e cliniche, e potrebbero essere uno degli strumenti clinici più importanti in futuro, è necessario riassumere l'isolamento, la purificazione, l'identificazione e le caratteristiche delle LNC.

Secondo un precedente studio14, le LNC sono presenti principalmente a livello dell'epitelio limbare sottostante e dello stroma del limbus. Questo protocollo include il trattamento del tessuto limbus utilizzando la collagenasi A, l'ottenimento di un cluster costituito da LEPC e LNC e la digestione in singole cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA (TE). Le LNC sono state quindi coltivate selettivamente in un terreno di cellule staminali embrionali modificate (MESCM) per essere purificate. Il protocollo riportato in questo documento è semplice e ha un'elevata efficienza nell'ottenere LNC umani in grandi quantità.

La procedura dettagliata di isolamento, coltura e identificazione dell'LNC è stata registrata nel video per gli scienziati interessati allo studio dell'LNC e può essere comodamente ripetuta quando necessario.

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Protocol

Il tessuto Limbus proveniente da donatori di età compresa tra i 50 e i 60 anni è stato ottenuto dalla Banca degli Occhi della Croce Rossa, Tongji Hospital (Wuhan, Cina). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico di Tongji ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

1. Isolamento

  1. Ottenere il tessuto limbus dal mezzo di conservazione corneale a medio termine e operare in condizioni asettiche su un banco di lavoro ultra-pulito.
  2. Raschiare e rimuovere l'iride e l'endotelio intorno alla cornea utilizzando una lama rotonda chirurgica sterile.
  3. Tagliare il tessuto limbus in dodici pezzi di uguali dimensioni con una lama chirurgica con 1 mm di sinistra su entrambi i lati della cornea e della sclera.
  4. Trasferire i tessuti limbus su una piastra di coltura di 3,5 cm, aggiungere 1 ml di collagenasi A (2 mg/mL, in terreno DF-12), per immergere tutti i tessuti per la digestione.
  5. Mettere la piastra nell'incubatrice cellulare a 37 °C, digerire i tessuti limbari per 18 ore.
    NOTA: Le procedure di follow-up vengono solitamente eseguite il secondo giorno.
  6. Preparare una piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% (Matrigel).
    1. Rivestire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM [Tabella 1]) sul fondo del pozzetto.
    2. Preparare puntali da 200 μL e 1 mL, una provetta centrifuga da 15 mL e una piastra da 6 pozzetti in una sacca sterilizzata.
    3. Mettere la sacca sterilizzata (compresi i puntali e la provetta centrifuga) e una nuova piastra a 6 pozzetti in un ambiente di -20 °C o -80 °C per 20 minuti. Scongelare la matrice della membrana basale in frigorifero a 4 °C.
    4. Estrarre i puntali preraffreddati, il tubo centrifugo e la piastra a 6 pozzetti dall'ambiente a -20 °C o -80 °C, quindi eseguire le seguenti operazioni sul banco di lavoro ultra-pulito.
    5. Trasferire 50 μL di matrice di membrana basale al 5% in 1 mL di MESCM utilizzando una punta da 200 μL e mescolarli delicatamente e in modo uniforme.
    6. Trasferire la matrice di membrana basale al 5% (disciolta in MESCM) in un pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti utilizzando la punta da 1 mL preraffreddata.
    7. Agitare delicatamente e orizzontalmente la piastra a 6 pozzetti, immergere la piastra di coltura a 6 pozzetti nell'incubatore cellulare a 37 °C per circa 1 ora, quindi eseguire il passaggio successivo.
  7. Dopo 18 ore di digestione, estrarre il tessuto limbare digerito dalla collagenasi A, rimarranno solo alcuni piccoli grappoli visibili e tessuti sclerali non digeriti.
    NOTA: La microscopia ad alto ingrandimento rivela un cluster composto da molte cellule densamente impacchettate (comprese le LNC).
  8. Utilizzare un puntale per pipette da 200 μL per staccare i cluster dai tessuti sclerali non digeriti sotto lo stereomicroscopio.
  9. Trasferire i grappoli sulla piastra di coltura da 3,5 cm e immergerli in TE allo 0,25%, quindi posizionare la piastra nell'incubatore cellulare per 15 minuti.
  10. Aggiungere 1 mL di MESCM con il 10% di siero knockout per arrestare la digestione cellulare e pipettare delicatamente su e giù per risospendere i cluster nelle singole cellule utilizzando un puntale per pipette da 1 mL.
  11. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
  12. Rimuovere il surnatante con cautela senza disturbare la precipitazione cellulare, quindi aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule.
  13. Pipettare su e giù 2-3 volte fino a quando la precipitazione della cellula inferiore non è sospesa uniformemente nel MESCM utilizzando un puntale per pipette da 1 mL e prelevare una sospensione cellulare da 20 μL per il conteggio delle cellule.
  14. Trasferire la sospensione cellulare nella piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% con un puntale per pipette da 1 mL e aumentare il volume di MESCM a 2,5 mL.
  15. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule.
  16. Trasferire le cellule nell'incubatore di coltura dopo essere state sottoposte a imaging e registrate. Osservare e fotografare le cellule ogni giorno e cambiare il terreno ogni 3-4 giorni.

2. Identificazione dei LNC

  1. Colorazione a immunofluorescenza
    1. Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando 1 mL 0,25% TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37°C.
    2. Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.
    3. Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule in sospensione. Preparare una sospensione cellulare da 80 μL (4 × 103 cellule per vetrino) per 4 vetrini (20 μL/vetrino) e utilizzare il sistema di centrifuga per depositare le cellule sui vetrini del microscopio secondo le istruzioni del produttore.
    4. Fissare le cellule (incollate ai vetrini nel passaggio 3) utilizzando paraformaldeide al 4% per circa 10 minuti, quindi permeabilizzare le cellule sui vetrini con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti.
    5. Bloccare le cellule per 1 ora con albumina sierica bovina al 2% (BSA) prima di incubarle con anticorpi primari (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) su un agitatore per una notte a 4 °C. Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi primari non legati lavando (5 min/lavaggio, 3 volte) i vetrini con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
    6. Incubare gli anticorpi secondari corrispondenti (anticorpo IgG anti-topo asino TRITC [1:1000], anti-coniglio asino IgG FITC [1:500], asino anti-topo IgG 488 [1:300], asino anti-coniglio IgG 594 [1:400]) per 1 ora con anticorpi IgG non specifici adatti a loro. Rimuovere l'anticorpo secondario non legato utilizzando PBST (5 min/lavaggio, 3 volte).
    7. Controcolorare i nuclei con 5 μg/mL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo ) e sigillare i vetrini.
    8. Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento: 400x; Tempo di esposizione: 50 ms).
  2. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)
    1. Prendi il kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
    2. Utilizzare un kit di trascrizione del cDNA ad alta capacità per trascrivere inversamente 1-2 μg di RNA totale in cDNA.
    3. Eseguire la trascrizione inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) e la qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cicli) in una soluzione di 20 μL contenente cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), Universal PCR Master Mix (10 μL) e ddH2O (fino a 20 μL).
    4. Utilizzare la tecnica TC comparativa (ΔΔCT)4,9 per esaminare l'espressione genica relativa.

3. Caratterizzazione dei LNC

  1. Conteggio delle cellule (emocitometro)
    1. Digerire gli LNC dal fondo della piastra utilizzando lo 0,25% di TE per 5 minuti nell'incubatore cellulare a 37 °C.
    2. Terminare la digestione aggiungendo 1 mL di MESCM (contenente siero knockout), centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti e aspirare con cura il surnatante.
    3. Aggiungere 1 mL di MESCM per risospendere le cellule, quindi prelevare 10 μL di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione colorante blu Trypan allo 0,4%.
    4. Posizionare una sospensione cellulare colorata da 10 μL sull'area di conteggio dell'emocitometro e coprirla con un vetrino coprioggetti per il conteggio.
      NOTA: Il numero di celle nelle cinque aree del quadrato centrale è definito come "A"; il numero di celle in 1 mL è calcolato come 5A × 104 × 2.
  2. Esame dei marcatori LNC e BMMSC con citometria a flusso15
    1. Rilevare l'espressione di SCF, CD73, CD90 e CD105 nelle LNC e nelle BMMSC utilizzando la citometria a flusso 15 (2-4 ×10 6 eventi/campione, 2.000 cellule sono state ottenute da ciascuno dei campioni, per un totale di 550.000 cellule che sono state gateed contemporaneamente).
    2. Raccogliere e colorare le cellule a 20-30 °C per 15 minuti in un tampone bloccante (3% BSA e 0,05% Tween-20 in PBS) utilizzando anticorpi premarcati (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] e CD105 [1:50]) secondo le istruzioni del kit.
    3. Eseguire l'analisi FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) utilizzando un citometro a flusso. In questo studio sono stati utilizzati i software FACS Diva e FlowJo. Per ogni campione, registrare 10.000 eventi e controllare e analizzare le cellule vive.

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Representative Results

Crescita di LNC
Le LNC sono state isolate con successo secondo il metodo di digestione della collagenasi A (2 mg/mL) di digestione del tessuto corneosclerale, come descritto sopra (Figura 1). Coerentemente con uno studioprecedente riportato 3, dopo la digestione della collagenasi A, sono stati visualizzati al microscopio cluster simili a bruchi (Figura 2). La proporzione di cellule fusiformi aumentava gradualmente con il passaggio cellulare. Le cellule a forma di fuso potrebbero crescere su piastre di matrice di membrana basale rivestite al 5%, a differenza delle loro controparti coltivate su plastica senza matrice di membrana basalerivestita 3. Le cellule da P1 a P12 hanno mostrato un tasso proliferativo uniforme, con un tempo di raddoppio delle cellule compreso tra 2 e 7 giorni (Tabella 2). In questo studio, gli LNC sono stati coltivati fino ai 13 passaggi e ai 34 raddoppi (Figura 3)3. Gli LNC sono stati coltivati da cellule primarie (LNC P0); LNC P0 è cresciuto lentamente e ha richiesto circa 12 giorni. Gli LNC hanno avuto bisogno solo di circa 3 giorni per passare in P1-P8 e il tasso di crescita degli LNC dopo P9 è diminuito significativamente (Tabella 2). In termini di morfologia cellulare, gli LNC erano a forma di fuso e rotondi in P0. Dopo P3, gli LNC erano a forma di fuso con le stesse dimensioni morfologiche (Figura 2). L'entità dell'espansione totale è stata misurata come il numero di raddoppi della popolazione da P0 a P13 utilizzando la seguente formula: numero di raddoppio delle celle (NCD) = log10 (y/x) / log102, dove y è la densità finale delle cellule e x è la densità iniziale di semina delle celle3. Le NCD rappresentano il tasso di crescita dei LNC (Figura 3A). Dalle curve NCD e NCD accumulative (Figura 3B), gli LNC hanno impiegato meno tempo per aumentare in modo esponenziale e sono cresciuti più velocemente rispetto a P3-P5 (Figura 3). Dopo il P5, il tasso di crescita cellulare è diminuito in modo significativo, NCD è tornato a 1,32 in P13 e la crescita si è quasi fermata.

Identificazione dei LNC
Dopo l'isolamento e la cultura dei paesi meno sviluppati, un altro compito importante è stato l'identificazione. LNC espressi per Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFRβ, ma non Pan-CK, secondo gli attuali studi pertinenti sugli LNC (Figura 4)9. La doppia immunocolorazione LNC P4 ha rivelato che queste cellule erano costantemente Pan-CK-/Vim+/CD90+/CD105+/SCF+/PDGFR+ (Figura 4). La qPCR ha anche rivelato una diminuzione dell'espressione di Pan-CK nel P2 e un aumento dei trascritti di Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFR nel P3. I livelli di trascrizione di Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFR sono aumentati notevolmente nel P4 rispetto al P1 (p < 0,01) (Figura 4)9.

Caratteristiche di LNC
Ulteriori analisi hanno mostrato che le LNC esprimevano più marcatori di cellule staminali embrionali (ESC) (Nestin, Rex1 e SSEA4), marcatori di cellule staminali mesenchimali (MSC) (CD73, CD90 e CD105) e marcatori di cellule di nicchia (NC) (MSX1, P75NTR e PDGFRβ) (Figura 5)15. La citometria a flusso ha indicato che le caratteristiche dell'antigene di superficie delle MSC, tra cui CD73, CD90 e CD105, erano espresse sia nelle LNC che nelle BMMSCs15. Le percentuali di LNC che esprimevano CD73, CD90, CD105 e SCF erano rispettivamente del 95%, 97%, 92% e 11% circa, mentre quelle delle BMMSC erano rispettivamente del 68%, 99%, 20% e 3%. Ciò dimostra che le LNC esprimono livelli significativamente più elevati di marcatori MSC-positivi CD73, CD105 e della citochina SCF (p < 0,01) e un livello simile di CD90 (p > 0,05) rispetto alle BMMSC (Figura 6)15.

Figure 1
Figura 1: Il processo di isolamento degli LNC . (A) Tessuto del bordo corneosclerale. (B) Cluster dopo digestione della collagenasi A a 37 °C per 18 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: LNC da P0 a P13 coltivati su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5% in MESCM (Bar = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il modello di crescita dei LNC da P0-P13. (A) La NCD dei LNC da P0-P13; (B) La NCD cumulativa dei LNC da P0 a P13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immunofluorescenza e qPCR. L'immunofluorescenza e la qPCR hanno rivelato che gli LNC esprimevano uniformemente Vim, CD90, CD105, SCF e PDGFRβ, ma non Pan-CK. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Zhu et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Gli LNC esprimono più marcatori ESC, MSC e NC rispetto ai BMMSC. Le LNC P4 e le BMMSC P4 sono state sottoposte a qPCR per l'espressione della trascrizione dei marcatori ESC (A), MSC e marcatori della cresta neurale (B) (n = 3, *P < 0,05, #P < 0,05 e **p < 0,01 rispettivamente). Immunocolorazione di marcatori ESC (C) e MSC, marcatori NC (D), con controcolorante nucleare di Hoechst 33342. Barre di scala = 25 μm. Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Li et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di LNC e BMMSC P4 (A-F). Analisi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) di marcatori MSC tra cui CD73, CD90 e CD105 (n=3). Questa figura è stata riprodotta con il permesso di Li et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagente Concentrazione della soluzione madre Volume Concentrazione finale Ambiente di archiviazione
DME/F-12 1:1(1×) Mezzo di base 180 ml 90% 4 °C
KnockOutTMSR - 20 ml 10% -20 °C
Sostituzione del siero per ESC/iPSC
Fattore inibitorio della leucemia umana (Lif) 50 μg/mL 40 μL 10 ng/mL -80 °C
FGF umano ricombinante-basico 100 μg/mL 8 μL 4 ng/mL -80 °C
ITS (insulina, transferrina, selenito di sodio) 500 μg/mL di insulina 2 mL 5 μg/mL di insulina -20 °C
500 μg/mL di transferrina 5 μg/mL di transferrina
500 ng/ml di selenito di sodio 5 ng/mL di selenito di sodio
Gentamicina 25 μg/mL 2 mL 50 μg/mL 4 °C
Amfotericina B 2500 μg/mL 100 μL 1,25 μg/mL 4 °C

Tabella 1: Formulazione MESCM.

Passaggio Densità di semina (× 105 celle/cm2) Densità finale (× 105celle/cm2) Tempo di coltura (giorni) Numero di raddoppi delle celle (NCD) Malattie non trasmissibili cumulative
P0 0.22 0.385714 12 0.810029 0.810029
P1 0.08 0.365714 4 2.192645 3.002674
P2 0.051429 0.357143 3 2.795859 5.798533
P3 0.037143 0.337143 2 3.182203 8.980737
P4 0.028571 0.311429 6 3.446256 12.42699
P5 0.04 0.385714 3 3.269461 15.69645
P6 0.054286 0.48 4 3.14439 18.84084
P7 (Inglese) 0.057143 0.351429 3 2.620586 21.46143
Punto 8 0.08 0.394286 3 2.30117 23.7626
P9 (Inglese) 0.06 0.345714 6 2.526546 26.28915
P10 0.022857 0.122857 7 2.426265 28.71541
P11 (Inglese) 0.025714 0.122857 5 2.25634 30.97175
P12 (Inglese) 0.028571 0.114286 5 2 32.97175
P13 (Inglese) 0.045714 0.114286 10 1.321928 34.29368

Tabella 2: Passaggi seriali del LNC su plastica.

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Discussion

La trasparenza corneale è tipicamente mantenuta dalla disposizione e dalla distribuzione regolare di piccole fibre (25-30 nm di diametro) nello stroma corneale, che è fondamentale per una normale acuità visiva16. Ci sono 253 milioni di persone ipovedenti in tutto il mondo, 36 milioni delle quali sono cieche17. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) considera la cecità corneale uno dei rischi più gravi per la vista umana, rappresentando il 5,1% di tutti i casi di cecità nel mondo16. Il difetto dell'epitelio corneale con CES normale può guarire rapidamente senza lasciare cicatrici18. Si stima che più di 12,7 milioni di pazienti in tutto il mondo richiedano trapianti di cornea a causa di una perdita della vista da moderata a grave19; Il 30% del fallimento del trapianto di cornea è stato causato da CESD20. Tuttavia, a causa della scarsità di donazione di cornea nella maggior parte dei paesi del mondo, solo uno su settanta pazienti ciechi per cornea potrebbe ricevere il trapianto di cornea21. Attualmente, il trapianto di cellule staminali epiteliali corneali (CEST) può essere utilizzato per trattare la CESD22. I pazienti con CESD monoculare possono ottenere la CES da occhi sani per CEST. Tuttavia, per i pazienti con CESD bilaterale, è possibile ottenere solo CES allogenico per il trattamento. Il rigetto immunitario rimane la ragione principale del fallimento della CEST allogenica. Un metodo promettente per ridurre il trattamento terapeutico per la CESD è quello di trovare una cellula che possa sostituire efficacemente la CES autogena o incoraggiare la differenziazione di altre cellule autogene da altri luoghi per diventare CES. Anche la differenziazione in vitro di cellule autologhe in CES sta diventando popolare, tra cui BMMSC 23, cellule epiteliali della mucosa orale (OMEC)24, cellule staminali della polpa dentale (DPSC)19, cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani (iPSC)25 e cellule staminali adipose (ASC)26. Rohaina et al.23hanno scoperto che le BMMSC coltivate sulle membrane amniotiche per 10 giorni potrebbero differenziarsi in cellule epiteliali corneali e che l'espressione di CK3 e p63 è aumentata significativamente dopo l'induzione della differenziazione. Nel 2020, O'Callaghan et al.24hanno indotto la differenziazione delle cellule epiteliali della mucosa orale in cellule epiteliali corneali utilizzando un nuovo sistema di coltura e lo hanno utilizzato con successo per il trattamento della CESD utilizzando una struttura tissutale 3D (RAFT) come supporto per la coltura di cellule epiteliali della mucosa orale con fibroblasti della mucosa orale umana come trofoblasti. Inoltre, la DPSC si differenzia con successo in cellule corneali, stromali ed epiteliali. Aumentando l'espressione di K3, K12 e CD90, la DPSC può prevenire l'invasione congiuntivale corneale. Un altro studio ha utilizzato DPSC come fogli di cellule amniotiche appoggiati sulla superficie corneale in un modello CESD di coniglio. I risultati hanno mostrato che il gruppo DPSC aveva cornee più pulite e meno angiogenesi rispetto al gruppo di controllo27. Hayashi et al.28hanno raggiunto la differenziazione utilizzando iPSC derivate da fibroblasti che potrebbero essere indotte nelle cellule epiteliali corneali PAX6 (+) e K12 (+) dopo 12 settimane. Le iPSC si sviluppano efficacemente in cellule epiteliali corneali, attivano K12 e sopprimono NANOG25. Zeppieri et al.26 hanno scoperto che le ASC potrebbero differenziarsi in cellule epiteliali corneali per curare la CESD di topo e migliorare la guarigione delle ferite epiteliali corneali in un modello animale indotto dal laser.

Le LNC si localizzano nella nicchia limbare, dove le CES sono protette e supportate, e hanno molte caratteristiche simili alle MSC. Le LNC sono state isolate per la prima volta da Polisetty et al.2 e nominate per la prima volta da Xie et al.3. Secondo studi recenti, le LNC sono cellule staminali più fondamentali delle MSC e possono facilmente differenziarsi in adipociti, condrociti e osteociti 4,29. Rispetto alle BMMSC comunemente usate, le LNC mostrano maggiori caratteristiche delle cellule staminali (maggiore espressione di CD73, CD105, PDGFR, SCF, ecc.) (Figura 5) 30. Gli LNC possono trattare con successo i conigli con CESD causata da ustioni alcaline corneali promuovendo la riparazione dell'epitelio corneale e dello stroma15. La ridotta espressione di fibronectina (FN), fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) e proteina secreta acida e ricca di cisteina (SPARC) nei fibroblasti corneali suggerisce che la secrezione di LNCs migliora la guarigione delle ferite e riduce la fibrosi7.

In un microambiente 3D, ciò che è interessante è che le LNC possono riunirsi con le MCEC, stimolando queste ultime cellule a ripristinare le proprietà delle cellule staminali9. Gli LNC accelerano efficacemente la crescita del CES31 e prevengono le cicatrici corneali10. Tuttavia, la quantità di LNC è limitata; Gli studi hanno indicato che rappresenta solo circa il 3% del numero totale di cellule stromali limbari nella cornea bovina32, con un'espressione significativa di cheratan solfato, cheratocan e ALDH3A133. Possono essere inferiori all'1% nelle cornee umane33.

In questo protocollo, i metodi precedenti di isolamento, purificazione e identificazione degli LNC sono stati ripetuti 3,14,34. Dopo 18 ore di trattamento del tessuto limbus umano con collagenasi A (2 mg/mL), le LNC sono state isolate. P0 LNC si è sviluppato lentamente e ha mostrato varie morfologie cellulari, tra cui LNC a forma di fuso, poligonali e MCEC sferici visibili (Figura 2, P0). Studi precedenti hanno dimostrato che le LNC sono cellule a forma di fuso che si attaccano al fondo della superficie di coltura con morfologia omogenea14. Allo stesso tempo, le MCEC sono intornoal 29, il che è coerente con la morfologia delle cellule coltivate in questo protocollo. Inoltre, gli LNC P0 sono cresciuti lentamente fino a raggiungere circa il 70%-80% della densità cellulare in circa 12 giorni. P1-P12 LNC proliferò molto più velocemente e, in 3-6 giorni, ricoprì praticamente l'intera piastra di coltura. Seguendo P1, le celle annessiali LNC a forma di fuso hanno superato significativamente le MCEC rotonde e le celle poligonali.

È chiaro dai valori di NCD nella Tabella 2 e nella Figura 3 che gli LNC P0 avevano la NCD più bassa (0,810) e che il passaggio cellulare si è verificato nell'arco di 12 giorni. Tuttavia, dopo il P1, la crescita dei LNC ha accelerato drasticamente e il tasso di crescita ha raggiunto il picco di 3,44 nel P4. Dopo il P6, il tasso di crescita dei LNC si è sostanzialmente ridotto (Figura 3). Il tasso di crescita dei LNC e l'attività dei P4 sono stati sostanzialmente i più alti in termini di modello di crescita dei LNC, in linea con i risultati precedenti che indicavano che l'attività di crescita dei LNC P4-P6 è la migliore9. Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni, il numero di LNC P0 varia notevolmente a seconda dell'età del donatore e del momento della morte. Pertanto, quando il tessuto donatore è più giovane e fresco, è possibile isolare più LNC P0. Il fattore più importante per imitare il microambiente del CES in vitro è la necessità di fattori di nicchia universali, come una matrice extracellulare ricca di laminamina35.

In conclusione, le LNC svolgono un ruolo cruciale nel sostenere le cellule staminali epiteliali corneali e nel mantenere la staminalità della CES, compreso l'autorinnovamento e la differenziazione in cellule epiteliali corneali mature. Ci si potrebbe aspettare che LNC sia uno strumento cellulare innovativo per il trattamento di pazienti con CESD 9,15.

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Disclosures

Nessuno degli autori dispone di informazioni finanziarie rilevanti.

Acknowledgments

Grazie a Wei Wang, Lingjuan Xu e Rong Liu per la guida su questo lavoro, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You e Li Guigang per aver fornito parte del materiale, Guanyu Su per aver scritto il manoscritto, Xiao Zhou, Yihong Xiong e Huatao Xie per aver corretto il manoscritto e Guigang Li per la sua guida completa. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82070936, 81470606, 81570819), dal progetto di ricerca scientifica sulla salute e la pianificazione familiare della provincia di Hubei (n. WJ2017M073), I dieci migliori progetti di ricerca medica traslazionale dell'ospedale di Tongji (n. 2016ZHYX20), Progetto di formazione di giovani pionieri medici nella città di Wuhan (n. 2015whzqnyxggrc10), Programma di reclutamento di talenti globali (G2022154028L), Progetto della Commissione sanitaria nazionale della provincia di Hubei nel 2022 (WJ2021ZH0005) e Fondazione per la costruzione di soggetti del dipartimento finanziario dell'Hubei nel 2022 (42000022815T000000102)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole ThermoFisher D1306 5μg/mL
Amphotericin B Sigma V900919 1.25 μg/mL
Anti-CD73 Abcam ab202122 1:50
Bovine Serum Albumin MERCK A1933 -
CD105 Proteintech 67075-1-Ig 1:200
CD105 Abcam ab114052 1:50
CD90 Proteintech 66766-1-Ig 1:100
CD90 Abcam ab307736 1:50
Cell Incubator Shanghai Lishen K1119K4644 HF90(HT)
Centrifuge system StatSpin  StatSpin CytoFuge 12 -
Collagenase A Roche 10103578001 2 mg/mL
Confocal microscope Zeiss  LSM700 -
Culture plate virya 3500356 35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  cytiva SH30023.01 90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A16016 1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher 31568 1:1000
FACS Diva sofware BD Biosciences Tree Star -
Flow Cytometer BD Biosciences Becton Dickinson LSRII -
Fluorescence microscope olympus cx31 
Gentamicin Sigma G1914 50 μg/mL
Hemocytometer MERCK Z359629 Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit ThermoFisher 4374966
Inverted phase-contrast microscope  UOP DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) Sigma I3146 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs gibco 10828-028 10%
Matrigel BioCoat 356234 -
Pan-CK Abcam ab7753 1:1000
Paraformaldehyde NoninBio NBS0135 4.00%
Paraformaldehyde MKBio MM-1505 4%
PDGFRβ Abclonal A1444 1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument Applied Biosystems Step One Plus -
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B 4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) Peprotech 300-05 10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit Qiagen 74104 -
SCF Bioss bs-0545R 1:100
SCF Abcam ab52603 1:50
Stereomicroscope ZEISS SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade Careforde 29500 size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix Applied Biosystems 4448489
Triton X-100 MERCK X100 0.20%
Trypan blue ThermoFisher 15250061 0.40%
Trypsin-EDTA Genview GP3108 0.25%
Tween 20 MERCK P9416 -
Ultra Clean Bench LaiTe LT20200705 SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Vim  Abcam ab92547 1:100

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References

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Cellule di nicchia limbare isolamento identificazione tessuto limbusate cluster di cellule terreno di coltura embrionale di cellule staminali Matrigel immunofluorescenza PCR quantitativa in tempo reale citometria a flusso marcatori di cellule staminali VIM CD90 CD105 PDGFRβ Pan-CK CD73 SCF BMMSCs
Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari
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