Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.
Hier berichten wir über ein Standardverfahren zur Isolierung und Identifizierung von limbalen Nischenzellen (LNCs). Limbusgewebe aus einer Augenbank wurde für die Isolierung von LNCs verwendet. Das Gewebe wurde unter aseptischen Bedingungen in 12 Stücke geteilt und 18 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator unter Verwendung von Kollagenase A aufgeschlossen, um Zellcluster mit LNCs und limbalen Epithel-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Zellcluster wurden 15 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA verdaut, um Einzelzellen zu erhalten, und dann in modifiziertem embryonalem Stammzellmedium (MESCM) auf einer mit 5 % Matrigel beschichteten Kunststoffoberfläche kultiviert. Die Zellen wurden bei 70%iger Konfluenz durchgelassen und LNCs wurden mittels Immunfluoreszenz, quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) und Durchflusszytometrie identifiziert. Primäre LNCs wurden isoliert und mehr als 12 Mal durchquert. Die Proliferationsaktivität von LNCs von P4 bis P6 war am höchsten. LNCs exprimierten höhere Stammzellmarker als BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR und PDGFRβ). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass P4-LNCs einheitlich VIM, CD90, CD105 und PDGFRβ exprimierten, jedoch nicht Pan-CK, was als Marker für die Identifizierung von LNCs verwendet werden könnte. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 95 %, 97 %, 92 % und 11 % der LNCs CD73, CD90, CD105 bzw. SCF exprimierten, während sie bei BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % und 3 % exprimierten. Das Standardverfahren zur LNC-Isolierung und -Identifizierung könnte eine zuverlässige Laborgrundlage für den weit verbreiteten Einsatz von LNCs bieten.
Die Inzidenz von Hornhautepithelzellmangel (CESD), auch Limbusstammzellmangel (LSCD)1 genannt, und Hornhautepithelregeneration (CES) wird aufgrund von Hornhautinfektionen und -verletzungen immer dringlicher. Wenn CESD nicht richtig behandelt wird, kann sie zur Erblindung führen, die eine Hornhauttransplantation erfordert. Dadurch gewinnt die CES-Regeneration an Bedeutung. Es gibt eine Gruppe von unterstützenden Zellen, die als limbale Nischenzellen (LNCs) bezeichnet werden und eine wesentliche Unterstützung für die CES-Funktion bieten. Limba-Stroma-Stammzellen wurden zuerst von Polisetty et al.2 isoliert und von Xie et al.3 als LNCs identifiziert, die im Limbusepithel und Stroma des Limbus lokalisiert sind. LNCs sind die wichtigsten unterstützenden Stammzellen des Hornhautrandes und könnten mit der Funktion von MSC aus dem Knochenmark (BMMSCs) dazu gebracht werden, sich zu Hornhautepithelzellen und Hornhautstromazellen usw. zu entwickeln.3,4,5,6,7. Frühere Studien zeigten, dass die Stammzellqualitäten von LNCs primitiver sind als die von BMMSCs8, die in der Klinik bereits weit verbreitet sind. LNCs könnten sogar die nächste praktikable Option nach MSC werden, insbesondere für die Behandlung von CESD. Als wichtige Stützzellen für CES sind LNCs auch Stammzellen, die aus der “Nischen”-Struktur des Limbus stammen. LNCs könnten eine Schlüsselrolle bei der Dedifferenzierung reifer Hornhautepithelzellen (MCEC) zu CES9 spielen. Die Studien zu LNCs sind jedoch noch relativ unzureichend, und es gibt keinen Konsens über die Terminologie, die Isolierung, die Reinigung, die Identifizierung und die Eigenschaften von LNCs. Einige Forscher haben LNCs aus der Limbusbiopsie gewonnene stromale Stammzellen10, limbale mesenchymale Stammzellen 11, limbale Fibroblasten-Stammzellen 12 und limbale mesenchymale Stromazellen13 genannt. Da die Wachstumseigenschaften von LNCs noch nicht im Detail beschrieben wurden und aufgrund ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen in Zukunft eines der wichtigsten klinischen Werkzeuge sein könnten, ist es notwendig, die Isolierung, Aufreinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNCs zusammenzufassen.
Laut einer früheren Studie14 sind LNCs hauptsächlich am Limbusepithel und Stroma des Limbus vorhanden. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von Limbusgewebe mit Kollagenase A, die Gewinnung eines Clusters aus LEPC und LNCs und die Verdauung in einzelne Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (TE). LNCs wurden dann selektiv in einem modifizierten embryonalen Stammzellmedium (MESCM) kultiviert, um gereinigt zu werden. Das Protokoll, über das in diesem Artikel berichtet wird, ist einfach und hat eine hohe Effizienz bei der Gewinnung menschlicher LNCs in großen Mengen.
Das detaillierte Verfahren der LNC-Isolierung, -Kultur und -Identifizierung wurde in dem Video für Wissenschaftler aufgezeichnet, die an einer LNC-Studie interessiert sind, und kann bei Bedarf bequem wiederholt werden.
Die Transparenz der Hornhaut wird in der Regel durch die regelmäßige Anordnung und Verteilung kleiner Fasern (25-30 nm Durchmesser) im Hornhautstroma aufrechterhalten, was für die normale Sehschärfe entscheidend ist16. Weltweit gibt es 253 Millionen sehbehinderte Menschen, von denen 36 Millionen blind sind17. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betrachtet Hornhautblindheit als eine der schwerwiegendsten Gefahren für das menschliche Sehvermögen und macht 5,1 % aller …
The authors have nothing to disclose.
Vielen Dank an Wei Wang, Lingjuan Xu und Rong Liu für die Anleitung zu dieser Arbeit, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You und Li Guigang für die Bereitstellung eines Teils des Materials, Guanyu Su für das Schreiben des Manuskripts, Xiao Zhou, Yihong Xiong und Huatao Xie für die Korrektur des Manuskripts und Guigang Li für seine vollständige Anleitung. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070936, 81470606, 81570819), dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt für Gesundheit und Familienplanung der Provinz Hubei (Nr. WJ2017M073), Top Ten translationale medizinische Forschungsprojekte des Tongji-Krankenhauses (Nr. 2016ZHYX20), Ausbildungsprojekt junger medizinischer Pioniere in der Stadt Wuhan (Nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), Projekt der Nationalen Gesundheitskommission der Provinz Hubei im Jahr 2022 (WJ2021ZH0005) und Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei im Jahr 2022 (4200002815T000000102)
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |