Summary
يوصف بروتوكول بسيط لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية لاستخدامها كمصدر للمستضدات في المقايسات T-الخلية الوظيفية. هذا الأسلوب يسمح للقياس T-الخلية الردود على الأنسجة المشتقة من المستضدات
Abstract
العديد من الأهداف مستضد من الاستجابة المناعية التكيفية، معترف بها من قبل والخلايا B T، لم تعرف 1. هذا صحيح بصفة خاصة في أمراض المناعة الذاتية والسرطان 2. هدفنا هو التحقيق في مستضدات الخلايا T التي تعترف بها الإنسان في نوع 1 من داء السكري أمراض المناعة الذاتية 1،3،4،5. لتحليل خلايا T الإنسان استجابات ضد الأنسجة حيث لا تحديد مستضدات الخلايا T معترف بها من قبل وضعنا طريقة لاستخراج البروتين من مولدات المضادات الأنسجة البشرية في تنسيق متوافق مع المقايسات الفنية 6. لا يمكن أن الردود سابقا، T-خلية الأنسجة غير منقى لمقتطفات أن تقاس لأن طرق استخراج تسفر عن المحللة التي تحتوي المنظفات التي كانت سامة للخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج البروتينات من الأنسجة البشرية في شكل غير سامة للخلايا T الإنسان. والمتجانس النسيج في خليط من الأسيتونيتريل، butan-1-ol و واتإيه (BAW). يتم قياس تركيز البروتين في استخراج أنسجة وaliquoted كتلة معروفة من البروتين في أنابيب. بعد الاستخراج، يتم إزالة المذيبات العضوية من قبل تجفيد. ويمكن تخزين مقتطفات الأنسجة مجفف بالتجميد حتى المطلوبة. لاستخدامها في فحوصات وظائف المناعة، وتعليق من الخلايا المناعية، في وسائل الإعلام الملائمة الثقافة، يمكن إضافة مباشرة إلى استخراج مجفف بالتجميد. تم قياس بسهولة وانتشار إنتاج السيتوكينات بواسطة PBMC، ردا على مقتطفات إعدادها باستخدام هذا الأسلوب. وبالتالي، لدينا أسلوب يسمح للإعداد السريع للأنسجة البشرية لست] التي يمكن استخدامها كمصدر للمستضدات في تحليل الخلايا T-الردود. نقترح أن هذا الأسلوب سيسهل تحليل الاستجابات المناعية التكيفية في زرع الأنسجة لوالسرطان والمناعة الذاتية.
Protocol
1. إعداد الأنسجة الطحال
- ينبغي أن يعامل الملاحظات جميع المواد التي قد تكون معدية الإنسان وينبغي أن تجري جميع الإجراءات في مجلس الوزراء من الفئة الثانية تدفق الصفحي. باستخدام مقص ملقط معقم و، وإزالة الأنسجة الدهنية والليفية من أقسام الطحال (~ 1-2 سم في حجم) وتقليم قبالة أكبر قدر من المواد كبسولة الخارجي قدر الإمكان.
- قطع قطعة صغيرة (1-2 سم 3) من الأنسجة الطحال ووضع كل قطعة في أنبوب العقيمة 50 مل فالكون.
- الأداة الإضافية تجميد قطعة من الأنسجة عن طريق الغمر في السائل N 2.
- المحل في -80 درجة مئوية. بروتوكول مماثلة مناسبة لالأنسجة الأخرى (ق).
2. إعداد الإنسان للجزيرة التخزين
- الجزر الثقافة في وسائل الإعلام CMRL. جمع الجزر في أنبوب 10 مل المخروطية وغسل أسفل مرتين في برنامج تلفزيوني بواسطة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. صب قبالة PBS واستنزاف المخزن المؤقت المتبقية عن طريق وضع أنبوب مقلوب لفترة وجيزة على منشفة ورقية. يجب الحرص على عدملإزاحة الجزر.
- استنزفت مرة واحدة، وإعادة رسملة الأنبوب والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. إعداد مستخلصات
- إعداد مزيج BAW (10:30:60٪ V / V) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأنبوب من C. ° -80 ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة ما يكفي من الجليد الباردة BAW لتغطية قطعة من نسيج الجسم. لاستخدام الجزر 3-5 مل. لاستخدام الأنسجة الطحال 10-20 مل تبعا لحجم قطعة من نسيج الجسم.
- تجميع الخالط الأنسجة. تنظيف ل 'المجانسة "10-20 مل من الايثانول 70٪ / المياه.
- تجانس الأنسجة في رشقات نارية عدة، بعد وضع التحقيق في أنبوب الخالط مع الأنسجة وحل BAW. إبقاء الأنبوب في دلو الجليد بعد ذلك.
- تنظيف بدقة الخالط بين العينات، من خلال التجانس 10-20 مل من الايثانول 70٪ / الماء ثم العازلة BAW. هذا يمنع انتقال التلوث من الأنسجة بين samples.Dismantleand نظيفة مع الايثانول 70٪ / من بعدنا المياهه.
- إذا كان المطلوب مقتطف تحتوي على مواد قابلة للذوبان فقط، المتجانس أجهزة الطرد المركزي في استخراج أنسجة 4،000 دورة في الدقيقة في RT لمدة 10 دقيقة. إذا كنت بحاجة لاستخراج مزيد من النفط الخام، وتدور في 1،000 دورة في الدقيقة في RT لمدة 5 دقائق. الأسلوب الأكثر ملائمة لاستخراج البروتينات غير قابلة للذوبان BAW يعتمد على تحليل المصب من البروتينات. لاستخدامها في المقايسات المناعية الوظيفية نقترح محاولة حل جزء غير قابل للذوبان في اليوريا M 8 إذ أننا وجدنا في السابق أن هذا جيد التحمل 6.
- نقل طاف لأنبوب نظيفة ووضعها على الجليد.
- تحديد تركيز البروتين في استخراج باستخدام مقايسة BCA أو ما شابه ذلك.
4. تجميد التجفيف مقتطفات
- اعتمادا على كتلة المطلوبة من البروتين (أي 100 ميكروغرام لكل أنبوب)، وفقا لتخفيف جناسة والاستغناء مأخوذة في المسمى عقيمة مل 5.0، الصقر (12x75 ملم) الأنابيب. ونحن كثيرا ما تستخدم 100 ميكروغرام / الأنبوب.
- استخدام 18-20 إبرة قياس محقنة معقمة تقديم 3 ثقوب في سقف كل أنبوب.
- تجميد أنابيب إما عن طريق وضعها على الثلج الجاف ل10 دقيقة ~ أو في الفريزر -80 ° C للساعة 1>. المحل في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لوضع على مجفاد.
- تشغيل أكثر جفافا للتجمد والسماح للتوازن (-100 درجة مئوية). هذا يستغرق حوالي 30 دقيقة.
- وهذا يتوقف على حجم، ويمكن الانتهاء تجميد التجفيف بعد 3 ساعة ولكن نترك بشكل روتيني عينات لدينا ليلة وضحاها.
- بعد الانتهاء من دورة التجفيف، وإيقاف مضخة فراغ، والسماح ببطء الى غرفة الضغط. إزالة الحامل.
- في غطاء محرك السيارة العقيمة، تنزع الأغطية من أنابيب مثقبة واستبدالها بأخرى جديدة (فالكون 352032).
- أنابيب مخزن في -20 ° C. يمكن تشكيل العينات في وسائل الإعلام والثقافة، وأو مخازن أخرى، وتستخدم في وظيفة أو المقايسات الكيميائية الحيوية.
5. ممثل النتائج
ويظهر الشكل 1 تلطيخ من البروتينتحميل هلام مع مقتطف من الطحال والبنكرياس جزيرة الأنسجة المنضب (المسمى عنيبية) وتنقيته الجزر الإنسان (الجزر المسماة). النتائج تظهر تمثيل جيد للبروتينات ذات الوزن الجزيئي من مختلف لكل الأنسجة.
تم اختبار قدرة مقتطفات الأنسجة البشرية لتحفيز تكاثر الخلايا T-باستخدام مقايسة انتشار CFSE القائم 7 (الشكل 2). تم عزل PBMC المستخدمة في هذا الاختبار من أي فرد يعانون من مرض السكري من النوع 1. يتم التعبير عن حجم الاستجابة كنسبة من عدد الخلايا CFSE قاتمة في 5000 CD4 + الخلايا CFSE، ومشرق دون مستضد: من الخلايا CFSE قاتمة في 5000 CD4 +، وخلايا CFSE مشرقة مع مستضد ثلاث نسخ من عينات 7. النتائج تظهر ضعيفة، ولكن يمكن اكتشافها، والانتشار ردا على عنيبية (CD1 = 3.5) وأقوى استجابة لاستخراج جزيرة (6.8). يتم تضمين فيروس الأنفلونزا المعطل (CDI = 142.6) وذلكإيجابية السيطرة.
الشكل 1. هلام بروتين.
الشكل 2. نتائج الفحص من انتشار CFSE القائم ضد عنيبية واستخراج جزيرة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا أردنا لتوليد مقتطف من الأنسجة البشرية التي كانت خالية من المواد الكيميائية السامة مثل المنظفات. على وجه التحديد وقد استخدمنا ذلك لإعداد مقتطفات من الأنسجة البشرية التي يمكن استخدامها في فحوصات وظائف المناعة البشرية في المختبر. يمكن أيضا مقتطفات إعدادها باستخدام هذا البروتوكول في أي تشكيل العازلة والتحليلات الكيميائية الحيوية المستخدمة لكثيرة، مثل اللوني الغربية النشاف أو السائل. وهذا يجعل هذه التقنية التي تنطبق على تطبيقات المصب كثيرة.
باستخدام بروتوكول لدينا الرد على مقتطفات الأنسجة ليست قوية. ومن المتوقع هذا لأننا نبحث عن الردود على مولدات المضادات "الذات"، وفي حالتنا T-خلية الاستجابات ضد مستضدات كثيرا ما تكون ضعيفة جزيرة 1. وجدت في السابق ونحن يمكن أن يتم الكشف عن CD4 + الإنسان استجابات الخلايا T إلى طليعة الأنسولين المؤتلف والجلوتاميك كربوكسيل حمض (GAD)، مستضدات الذاتية في مرض السكري من النوع 1، وذلك باستخدام لدينا CFSE القائمانتشار الفحص 7،8. لقد اخترنا لاستخدام مقتطفات الأنسجة لتجنب المشاكل المرتبطة باستخدام الببتيدات الاصطناعية 9 و البروتينات المؤتلف 10.
نحن لا بشكل روتيني إضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني الاستخراج لدينا. قد وجود مثبطات الأنزيم البروتيني تمنع معالجة المستضد وعرض 11 و تمنع بالتالي خلية T-الردود. بدلا من ذلك نقوم باستخراج على الجليد في محاولة لمنع تدهور البروتيني بوساطة. لتطبيقات أخرى قد إدراج مثبطات الأنزيم البروتيني يكون مفيدا إذا تدهور البروتين هو المشكلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من المنح المقدمة من الصحة الوطنية الاسترالية ومجلس البحوث الطبية (NHMRC # 559007) والأحداث السكري مؤسسة أبحاث (JDRF 4-2006-1025) ومخطط البنية التحتية التشغيلية لحكومة فيكتوريا. نشكر أعضاء ماندل توم برنامج زرع جزيرة عزل فريق جزيرة لتوفير الأنسجة البشرية. تم جمع الأنسجة البشرية واستخدامها مع الموافقة الأخلاقية المحلية (مستشفى سانت فنسنت HREC-A 011/04 والصحة سانت فنسنت HREC-A 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
