Summary
신경 질환의 유전자 변형과 녹아웃 마우스 모델은 정상 및 비정상 신경 생리학에있는 유전자의 역할을 공부하는 데 유용합니다. 이 문서는 장기 상승 작용, 유전자 변형에, 학습과 기억의 기초 및 신경 병리학의 마우스 모델을 행동 자유롭게 녹아웃 수있는 세포 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
시냅스 효능의 장기 상승 작용의 연구는 잠재적 인 세포 메커니즘을 기본 학습 및 정보 저장 등이 매력적 특성을 갖는 활동에 의존하는 시냅스 현상은 오래 해마, 편도체의 다양한 신경 회로의 생리를 규명하는 데 사용되었습니다 및 기타 변연계와 대뇌 피질의 구조. 이 염두에두고, 신경 질환의 유전자 변형 마우스 모델은 학습, 감정과 정보에 관련된 신경 네트워크의 정상 및 비정상 시냅스 통신 유전자의 역할에 대한 이해를 개발하는 장기 potentiation (LTP) 연구를 수행하는 데 유용 플랫폼을 나타냅니다 처리. 이 문서는 안정적으로 자유롭게 행동 마우스에서 LTP를 유도하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 유전자 도입의 연구에 사용될 수 있고 자유롭게 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델을 행동 녹아웃.
Introduction
유전자를 조작 할 수있는 기술의 개발은 거의 모든 신경 변성 및 신경 질환의 유전자 녹아웃 마우스 모델을 생산하고있다. 이것은 이전에 마우스 동물 모델에 큰 설치류에 사용되는 전기 생리학 연구 기법의 번역을 필요하게되었다. 하나의 신경 생리 학적 조사 기술은 여러 가지 신경 병리학 적 질환과 관련된 신경 세포의 네트워크 내에서 시냅스 연결의 효능을 테스트하기 위해 사용하는 장기 potentiation (LTP)입니다. 이 프로토콜은 자유롭게 마우스를 행동에 LTP의 믿을 수있는 전기 생리학 연구에 대한 기술에 대해 설명합니다. 기타 이상이 프로토콜의 장점은 간단하고 구현하기 쉬운이며 그것이 고가의 컴퓨터 제어 마이크로 드라이브 시스템 또는 이용 전계 효과 트랜지스터 headstages의 이용도를 요구하지 않는 한도 적은 비용이다하고, 우리의 지식, 만성 전기 생리 레코딩의 t의 첫번째 비디오 프로토콜O 자유롭게 마우스를 행동에 LTP를 공부합니다. 이를 위해, 우리는이 문서에서 자유롭게 행동 생쥐의 장기 상승 작용을 연구하기위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 신경 병리학 적 질환의 유전자 녹아웃 마우스 모델로 번역 할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 3, 18 세 30 ~ 50 g을 대략 체중 개월)의 마우스에 적합합니다. 마우스는 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 얻을 수 있습니다. 모든 수술 및 실험 프로토콜은 트리니티 대학 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라되었습니다했다.
1. 동물 준비 및 외과 적 치료
- 케타민 (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.5 ㎎ / ㎖)을 포함 마취 칵테일을 준비합니다. 그 후 페달 금단 휘어진하여 마취 깊이 안정을 유지하기 위해 0.2 ㎖ / kg 주입에 의해 매 45 분을 보충 복부의 우측 사분면에 1 ㎖ / kg 체중을 주입한다.
- 전기 면도기를 사용하여 두개골에 모피를 면도 수술 마취 마우스를 준비합니다. 면도 영역은 귀 중간에 눈의 중간 부분을 포함해야한다. whiske 면도하지 않도록하십시오그들은 마우스 배럴 감각 시스템의 일부로서 RS.
- 머리에 면도 영역에 베타 딘 다음에 이소 프로필 알코올을 적용하기 위해 면봉을 사용합니다. 이어서,도 면봉을 사용하면, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 미네랄 오일의 소량을 적용한다.
- 고정대 장치에 동물의 머리를 탑재 유아 쥐의 귀 팔목 대신 일반 귀 막대를 사용하십시오. 이렇게하려면, 먼저 왼쪽 귀 팔목의 왼쪽 귀를 탑재합니다. 부드럽게 부드럽게 한 손으로 동물의 머리를 지원하고 다른 손으로 귀 팔목을 진행하여 오른쪽 팔목에 오른쪽 귀를 완화. 다음, 동물의 신체하에 가열 패드를 배치하고 체온을 유지하기 위해 86 ° F로 설정.
- 그런 측면, 헤드 측 이동을 시도하여 양자 강성을 확인합니다. 헤드는 고정식 및 좌우로 이동 될 수 있지만, 간단하게 상하 요동과 때 동물 적절히 고정대에 장착된다.
- 부드럽게 휴식코 / 치아 표시 줄에 마우스의 주둥이 어셈블리 앞니 코 / 치아 바의 치아 구멍 내에서 조심스럽게 안전하게 쉬고 있는지 확인하고.
- 멸균 메스를 사용하여 귀 중간 눈의 중간부터 정중선 절개를. 메스는 45 ° 각도로 유지하고 과도한 출혈 원인이됩니다 두개골을 통해 기본 근막을 통해하지만 절단하기에 충분한 압력을 적용 할 수 있는지 확인합니다.
- 근막을 분리하여 두개골을 노출하기 위해 면봉을 사용합니다. 두개골 브레 그마 관광 명소 및 람다 (그림 1A) 명확하게 볼 수 있어야합니다. 동물 브레 그마 및 람다 랜드 마크 같은 dorsoventral (DV) 위치 (+ 0.1 mm)에 있는지 등 코 / 치아 막대를 조정하여 두개골 평평한 위치에 있는지 확인하십시오.
- 노출 된 지역에 멸균 식염수의 작은 금액을 적용하고 부드럽게 두개골을 청소 면봉을 사용합니다. 그런 다음 완전히 건조 공기에 두개골에 대한 2 ~ 3 분을 기다립니다진행하기 전에.
- 브레 그마 및 람다의 DV 위치를 측정하기 위해 왼쪽 정위 팔에 바늘을 장착합니다. 이 두 랜드 마크의 DV 위치는 서로 0.1 mm 이내이어야한다. 그렇지 않다면, 고정대의 노즈 바는 조정될 수 있으며, 다운이를 위해.
- 그 전후방 (AP), 측면 (LAT)와 dorsoventral (DV) 측정을 기록 브레 그마에 바늘을 배치합니다. 바늘이 바로 두개골을 접촉하고 침투하지 않는해야합니다.
- 람다에 비해 해마의 각 번들과 치아 이랑 (dentate gyrus) (DG)의 중간 perforant 통로 (MPP)를 : 같은 목표 구조의 좌표를 결정하기 위해, 1 "정위에서 마우스 뇌 좌표"로 마우스 뇌 아틀라스를 사용 브레 그마 및는 각각 (표 1 참조). 그런 다음, 두개골에 이러한 점을 표시하는 좋은 볼펜이나 연필을 사용합니다.
- 또한, 두개골의 반대쪽에 두 개 이상의 지점을 표시합니다. 이 점 wHICH 접지 (GND) 및 참조 (REF)이 될 것입니다 중간 선에서 약 3mm해야하며, (그림 1A, 표 1) 서로에 대해 길이 방향으로 위치.
- 왼쪽 정위 팔에서 바늘 마커를 제거하고 정위 마운트를 장착 한 전기 치과 드릴로 교체합니다. 표시된 각 지점에 드릴을 놓고 직경 약 0.5 mm의 작은 버 구멍을 만든다. 드릴링, 반복적 상하 움직임을 사용하고 드릴 뇌 표면을 노출 두개골을 관통 여부 자주 확인하는 경우.
- 부드럽지만 확실히 그들은 단지를 관통하지 않고 대뇌 피질의 표면을 만지지 않도록 (그림 1A (# 0-80 스테인리스 기계 나사의 1 / 8, 머리 납작 슬롯) 반대측 구멍 (GND와 REF)에 각각 나사 전극을 구동 ). 이 두 개의 나사 전극은 접지와 기준의 역할을한다.
- 전기 마운트의 자극 및 기록 전극드 좌우 정위 팔 홀더였다.
- 다음 전기 생리학 차동 증폭기 (1,000 이득, 대역 통과 필터 = 1 Hz에서 3 kHz에서) 및 유발 반응의 육안 검사를위한 디지털 오실로스코프에 현재의 고립과 기록 전극 단자와 전기 생리학 자극에 자극 전극 단자를 연결합니다. 또한, 차동 증폭기에 GND 및 REF 전극 단자를 연결한다.
- 부드럽게 천천히 시각적으로 600 ~ 800 개 uA의 자극 충격을 유발 반응을 모니터링하면서 0.5 mm 단위로 자극과 기록 전극 모두 낮은. 그들은 각각의 대상 DV 위치에 도달하고 틀에 박힌 신호 오실로스코프 (그림 1B)에서 관찰 될 때까지 각 전극을 낮추기 위해 계속합니다.
- 그 후, 장소에 전극 단자를 개최 모자를 만들기 위해 치과 아크릴 시멘트를 사용, 피부에 닿는 모든 치과 시멘트 닦아냅니다즉시. 치과 용 시멘트가 완전히 깨끗한 설치류 케이지에 고정대에서 동물을 전송 경화되면. 코어 온도를 유지하도록 가열 램프 또는 패드를 사용한다.
- 이 의식을 회복 할 때까지 동물마다 시간을 모니터링합니다. flunixin의 주입은 진통제로 투여 될 수있다.
2. LTP 유도
- 동물 5-7일 수술에서 회복 할 수 있습니다. 방음 소재로 장착 된 패러데이 케이지 (122cm X 43cm X 43cm)와 전극이 자극 / 녹화 설정에 이르게 연결하는 5 채널 회전 정류기로 구성된 기록 환경에서 동물을 놓습니다.
- 동물 (1.17 단계를 참조하십시오) 자극 및 녹음 기기에 전극을 연결하기 전에 녹음 환경에서 1 ~ 2 시간 동안 적응 할 수 있습니다.
- 출력 400 uA의에 자극 컨트롤을 설정하고 확인 일을 만드는 반응을 유발 (10)의 평균 진폭을 기록자극 사이에 적어도 10 초 경과에. 유발 반응을 정량화하기 위해 그림 1C에 도시 된 방법을 사용합니다. 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400 개 uA에 대해이 절차를 반복합니다.
- 자극 강도 대 유발 반응의 평균 진폭을 플로팅하여 입력 / 출력 곡선 작도. 이 도표에서 측정 된 최대 진폭의 50 %에 해당하는 자극의 강도를 결정합니다. 실험의 나머지 50 %의 강도를 사용합니다.
- 그 후, 50 %의 자극 강도를 사용하여, 5의 평균 진폭 응답 15 분 동안 매 순간을 유발 기록하여 기준선을 구하십시오. 다시 확인 자극 사이에 적어도 10 초 경과 확인하십시오.
- 그 후 중간 perforant 통로 5 Hz의 버스트 속도 400 Hz에서 전달 10 펄스의 10 버스트로 구성된 파상풍의 자극을 제공합니다. 젖은 강아지 쉐이크 등의 발작의 표시를 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 동물 발작에게 experim가있는 경우ENT가 종료되어야하고 그 동물의 모든 데이터는 연구 결과에서 제외되어야한다.
- 그런 다음, 5의 평균 진폭 응답 30 분 posttetanization에 대한 모든 분을 유발 기록을 계속합니다. 그 후,베이스 라인의 퍼센트 변화 (그림 2)을 계산하여 2.5 단계에서 얻어진 기준 진폭이 진폭을 비교합니다.
- 실험의 결론에 따라, 동물은 미국의 의학 협회의 안락사에 대한 가이드 라인과 일치 이소 플루 란 - 방법의 흡입에 의해 안락사된다.
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Representative Results
. 표 1은이 프로토콜에서 사용되는 DG와 MPP의 좌표 그림 1A는 두개골의 대상 구조의 표시를 보여줍니다 보여준다. 또한 접지 전극과 기준 전극의 위치는 제시된 그림 1B는 담당자가 응답을 추적 모두 사전 되살려줍니다 와 같은 동물에서 posttetanization. posttetanization가 응답.도 1c는 응답 진폭을 정량화하는 데 사용되는 방법을 도시 LTP 유도 2 나타낸다 pretetanization 응답보다 큰 유발합니다. 사실, 그림 2는 모두 사전 및 posttetanization의 기간에 걸친 시간의 과정을 통해 응답 진폭의 퍼센트 변화를 보여줍니다. 이것은 LTP 피크 값이 100 %를 초과하는 것을 주목하여야한다. 향상된 응답 진폭 다음 tetanization의 이러한 결과는이 프로토콜은 LTP 공부를위한 성공적인 따라서 신뢰할 수 있음을 나타냅니다자유롭게 행동 마우스 모델에서.
중간 perforant 경로 (MPP)과 GND에 대한 사람들은 람다를 기준으로하면서 표 1. 좌표 대상 구조물. 전후방 (AP)는 치아 이랑 (dentate gyrus) (DG) 및 REF 좌표는 브레 그마를 기준으로합니다. 모든 DV 좌표는 경막 아래의 대뇌 피질의 표면을 기준으로합니다.
그림 1. 전극의 위치 및 유발 반응의 대표 흔적. 마우스 SKU에 전극의 상대 위치의 A) 개략도LL. B) 유발 반응의 전형적인 흔적은 모두 사전 및 posttetanization. C) 알고리즘 유발 반응의 크기를 정량화하는 데 사용.
중간 perforant 경로 치아 이랑 (dentate gyrus)의 시냅스에 2. LTP 그림. 자유롭게 행동 마우스의 MPP-DG 시냅스의 LTP 유도의 대표적인 결과입니다. LTP 유도 나타내는 유발 반응 진폭의 posttetanic 자극 향상을합니다.
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Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 자유롭게 행동 마우스에 DG에서 LTP 공부를위한 안정적이고 간단한 방법을 증명하고있다. 깨어있는 쥐에서 LTP의 많은 연구가 3,4를 수행하는 동안, 거의가 주로 생쥐의 제한 두개골 부동산 및 평균 체중을 기준으로 전극 headstages의 무게에 의해 제기 된 기술적 인 복잡성에 깨어 마우스에서 수행되었다 마우스 5. 자유롭게 마이크로 드라이브 전극 시스템 또는 접합 전계 효과 트랜지스터 반드시 동물 6-10 행 전극 페이로드에 추가 부담 headstage에 통합 (JFET) 프리 앰프 하나 살린 생쥐에서 행동 DG의 LTP를 보여준 몇몇 연구. 본 프로토콜의 의미는 그것이 마이크로 드라이브 전극 시스템의 사용 또는 headstage JFET의 일어나지 않도록 자유롭게 생쥐에서 행동 DG에서 LTP를 유도하기위한 기존의 방법에 비해 개선을 나타내고 있다는 것이다.
그것은 impor에있다이 프로토콜의 중요한 단계를 강조 TANT. 풍향이 좌우 강성 있도록 고정대에서 마우스의 머리 1) 설치 (그것은 연습과 기술에 대한 지식을 필요로이 단계가 가장 어려울 수있다) 2) 전극의 최적의 위치 응답의 크기를 최대화하기를 수 브레 그마 및 람다 통상 브레 그마 및 람다 dorsoventral 위치의 차이가 더 크다 mm 0.1보다는 없도록 고정대 치아 막대를 조절함으로써 달성 될 수있는 동일 평면 상에 있다는 것을 확실히함으로써 강화 될 3)의 기록 단계 동안 실험은, 그것은 동물 촬영 환경의 신규성 수집 유발 된 응답 데이터에 변동이 스며들 수 있기 때문에 시간이 기록 환경 길들을 허용 할 것을 권장하며 전극 4) 적당한 선택은 신호 품질 및 정확도 향상 것이다 : 바이폴라 전극 ( 0.2 mm 스테인레스 스틸 스테인레스 스틸 피하 튜브0.5 mm의 팁 분리)와 와이어 인서트 모노 폴라 전극 (epoxylite 절연 단일 가닥 텅스텐 와이어) 신경 조직에서 기록을 위해 사용되는 동안 자극 바람직하다; 5) 마우스는 케타민의 혼합물을 복강 내 주사하여 마취 수 (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.5 ㎎ / ㎖). 이 마취제 혼합물을 마취의 안정적인 깊이를 유지하기 위해 0.2 ㎖ / ㎏ 매 45 분에 의해 보충 약 20 분에서 일반적으로 효과가 1ml/kg의 용량으로 투여해야한다.
언급 부담이 프로토콜의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 이온 채널 메커니즘 또는 LTP를 보조하다 할 수 있습니다 수용체 단백질 합성에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 따라서 부족한 정보가 기록되는 인구에있는 신경 세포의 실제 숫자와 관련된 사용할 수 있습니다. 또 다른 제한이 유발 응답이 깨어있는 동물에 수집되고 이후는 ascert 어려운 것입니다아인과 스트레스, 처리, 또는 가짜 감각 활동에 의해 기록 된 신호의 오염 등의 요인의 영향을 해부하다. 이러한 제한은 그 응답이 달리 조용한 깨어있는 각성 상태로 알려진 동물이 비활성하지만 경보 상태 인 경우에만 기록됩니다 유발함으로써 극복 될 수있다.
그럼에도 불구하고,이 프로토콜에 설명 된 기술은 뇌의 전기적 활동 내부 동작을 조사하는 대부분의 생리학 관련 플랫폼을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라, 어떤 뇌 구조는 마우스의 뇌 (1)의지도 책에 의해 주어진 적절한 좌표를 사용하여 대상이 될 수 있습니다. 그것은 성인 쥐 고정대 적합한 유아 래트 귀 커프 대신 정규 귀 바를 사용하는 것을 제공 생쥐에서 사용할 수 있음을주의하는 것이 중요하다. 귀 팔목 마우스의 귀를 손상시키지 않고 머리를 무력화합니다. 마지막으로, 여기에 제시된 방법은 readil이 될 수 있습니다Y는 신경 질환의 호스트의 유전자 녹아웃 마우스 모델에서 전기 생리학 연구에 번역.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
박사 조셉 Bronzino 박사 카 미스 아부 Hassaballah 씨 RJ 오스틴 LaFrance 및 양 제시카 Koranda : 저자는 다음을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
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