Summary
Modelos de camundongos transgênicos e knockout de doenças neurológicas são úteis para estudar o papel dos genes em neurofisiologia normal e anormal. Este artigo descreve metodologias que podem ser usados para estudar a potenciação a longo prazo, um mecanismo celular que pode ser a base de aprendizagem e de memória, em transgénicos e knockout livremente comportando modelos de rato de neuropatologia.
Abstract
Estudos da potenciação de longa duração de eficácia sináptica, um fenômeno sináptica dependente de atividade que tem propriedades que o tornam atraente como um potencial mecanismo celular subjacente aprendizagem e armazenamento de informações, têm sido muito utilizados para elucidar a fisiologia de vários circuitos neuronais no hipocampo, amígdala e outras estruturas límbicas e corticais. Com isto em mente, os modelos de camundongos transgênicos de doenças neurológicas representam plataformas úteis para conduzir potenciação de longa duração (LTP) estudos para desenvolver uma maior compreensão do papel dos genes na comunicação sináptica normal e anormal em redes neuronais envolvidos na aprendizagem, emoção e informação processamento. Este artigo descreve as metodologias para indução de forma confiável LTP no rato comportando livremente. Estas metodologias podem ser utilizadas em estudos sobre transgênicos e knockout comportando livremente modelos do rato de doenças neurodegenerativas.
Introduction
O desenvolvimento da tecnologia para manipular genes produziu modelos de ratos transgênicos e knockout de quase todas as doenças neurodegenerativas e neurológicos. Isso exigiu a tradução de técnicas de pesquisa eletrofisiológicos anteriormente utilizados em espécies de roedores maiores para o modelo animal mouse. Uma tal técnica de investigação neurofisiológicos é o uso de potenciação de longo prazo (LTP), para testar a eficácia das conexões sinápticas nas redes neuronais envolvidas em várias doenças neuropatológicas. Este protocolo descreve técnicas para a investigação eletrofisiológica confiável de LTP em comportar livremente ratos. A vantagem deste protocolo sobre os outros é que é simples e fácil de implementar, é também um pouco menos dispendioso, uma vez que não requer nem a utilização de sistemas de micro-unidade caros controlados por computador nem transistor de efeito de campo headstages, e, para o nosso conhecimento, é o primeiro protocolo de vídeo de registros eletrofisiológicos crônicas to estudo LTP em comportar livremente ratos. Para este fim, descrevemos no artigo metodologias simples para estudar a potenciação a longo prazo em murganhos comportando livremente. Estas metodologias podem ser facilmente traduzido para modelos transgênicos e knockout rato de distúrbios neuropatológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo é apropriado para os ratinhos de 3 e 18 meses de idade e peso corporal aproximado de 30-50 g). Ratos podem ser obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Todos os protocolos cirúrgicos e experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Trinity College e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparação Animal e Procedimentos Cirúrgicos
- Prepare coquetel contendo anestesia de cetamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / mL) e acepromazina (0,5 mg / ml). Injectar 1 mL / kg de peso corporal no quadrante inferior direito do abdómen completada por injecções 0,2 ml / kg a cada 45 minutos depois disso a manter uma profundidade de anestesia estável utilizando o reflexo de retirada do pedal.
- Prepare rato anestesiado para a cirurgia raspando a pele em seu crânio com um barbeador elétrico. A área raspada deve incluir no meio dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se de não fazer a barba a Whiskers como eles fazem parte do sistema sensorial barril mouse.
- Use cotonetes para aplicar álcool isopropílico seguido de Betadine para a área raspada na cabeça. Em seguida, também usando cotonetes, aplicar uma pequena quantidade de óleo mineral sobre os olhos para evitar os globos oculares de secagem.
- Use punhos da orelha de ratos infantis em vez de barras de ouvido regulares para montar a cabeça do animal sobre o aparelho quadro estereotáxico. Para fazer isso, a primeira montagem da orelha esquerda no punho da orelha esquerda. Então aliviar suavemente a orelha direita para a braçadeira direita, apoiando suavemente a cabeça do animal com uma mão e fazer avançar o manguito ouvido com a outra mão. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento sob o corpo do animal e configurá-lo para 86 ° F para manter a temperatura corporal.
- Em seguida, verifique se há rigidez bilateral ao tentar mover o lado da cabeça para o outro. O animal está correctamente montada na armação estereotáxica quando a cabeça é rígido e não pode ser movida de lado a lado, mas pode facilmente rodar para cima e para baixo.
- Delicadamente, coloque ofocinho de rato na barra de nariz / dente montagem certificando-se que os incisivos estão descansando suavemente, mas de forma segura dentro da abertura da lâmina da barra nariz / dente.
- Usando um bisturi estéril, fazer uma incisão na linha média a partir de meados dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se que o bisturi é ser realizada em um ângulo de 45 ° e aplicar pressão suficiente para cortar através da fáscia subjacente, mas não através do crânio como que vai causar sangramento excessivo.
- Use cotonetes para separar a fáscia e expor o crânio. Crânio marcos bregma e lambda deve ser claramente visível (Figura 1A). Assegure-se que o animal se encontra na posição crânio plana, ajustando a barra de nariz / dente de tal modo que bregma e lambda são marcos na mesma posição do dorso-ventral (DV) (+ 0,1 mm).
- Aplicar uma pequena quantidade de soro fisiológico estéril para a área exposta e usar cotonetes para limpar suavemente o crânio. Então espere 2-3 min para o crânio completamente o ar secoantes de prosseguir.
- Montar uma agulha no braço estereotáxico esquerda para medir a posição de DV bregma e lambda. O posicionamento DV destes dois pontos de referência deve estar dentro de 0,1 milímetros um do outro. Se não, a barra de nariz da estrutura estereotáxica pode ser ajustado para cima e para baixo para alcançar este objectivo.
- Posicione a agulha no bregma para gravar seu ântero-posterior (AP), lateral (LAT) e medições dorsoventral (DV). Verifique se a agulha toca apenas o crânio e não penetrá-la.
- Use um mouse atlas do cérebro, tais como "O Rato do cérebro em estereotáxica Coordenadas" 1, para determinar as coordenadas para as estruturas-alvo: medial via perfurante (MPP) no feixe angular e giro denteado (DG) do hipocampo, em relação a lambda e bregma, respectivamente (ver também Tabela 1). Em seguida, use uma caneta de ponta fina ou lápis para marcar esses pontos no crânio.
- Além disso, marcar mais dois pontos no lado contralateral do crânio. Estes pontos which servirá de terra (GND) e de referência (REF) deve ser cerca de 3 mm a partir da linha média e posicionada longitudinalmente em relação umas às outras (Figura 1A, também a Tabela 1).
- Retire o marcador agulha do braço estereotáxico esquerda e substituí-lo por uma broca dental elétrico equipado com um monte estereotáxica. Posicione a broca sobre cada ponto marcado e fazer pequenos furos rebarba de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Quando a perfuração, use um movimento para cima e para baixo repetitivo e verificar com freqüência se a broca penetrou no crânio para expor a superfície do cérebro.
- Delicadamente, mas com firmeza, dirigir um eletrodo parafuso (# 0-80 1/8 em parafusos de aço inoxidável, com fenda cabeça oval) em cada um dos buracos contralateral (GND e REF) de tal forma que apenas tocar a superfície cortical, sem penetrá-lo (Figura 1A ). Estes dois eletrodos parafuso servir como base e referência.
- Mount estimulantes e gravação eletrodos em electrode titulares nos braços estereotáxica esquerdo e direito, respectivamente.
- Conecte os terminais do eletrodo estimulando a um estimulador eletrofisiológico com isolamento atual e do terminal de eletrodo de registro a um amplificador diferencial eletrofisiológico (ganho = 1.000, filtro de banda = 1 Hz-3 kHz) e, em seguida, para um osciloscópio digital para inspeção visual de respostas evocadas. Além disso, conecte GND e terminais do eletrodo REF para o amplificador diferencial.
- Suavemente e abaixe lentamente tanto estimulante e eletrodos de registro em incrementos de 0,5 mm enquanto monitorando visualmente a resposta evocada a um choque de estímulo 600-800 uA. Continue a baixar cada um dos eléctrodos, até que eles atinjam a sua posição respectiva DV-alvo e um sinal estereotipado é observado no osciloscópio (Figura 1B).
- Depois disso, use cimento acrílico dental para fazer uma tampa para manter os terminais do eletrodo no lugar, qualquer cimento odontológico que toca a pele deve ser apagadoimediatamente. Uma vez que o cimento dentário é completamente curado transferir o animal a partir do quadro estereotáxico para uma gaiola limpa roedor. Use uma lâmpada de aquecimento ou uma almofada para manter a temperatura do núcleo.
- Monitorar o animal a cada hora até que ele recupere a consciência. Uma injecção de flunixina pode ser administrado como um analgésico.
2. LTP Indução
- Permitir que o animal de 5-7 dias para se recuperar da cirurgia. Colocar o animal no meio de gravação que consiste de uma gaiola de Faraday (122 centímetros x 43 cm x 43 cm) equipadas com material de isolamento acústico e de um comutador rotativo 5-canal que liga o eléctrodo leva à configuração estimulante / gravação.
- Permitir que o animal se adapte para 1-2 horas no ambiente de gravação antes de conectar os eletrodos para os instrumentos de estímulo e de gravação (consulte a etapa 1.17).
- Defina os controles de estimulador para a saída de 400 uA e registrar a amplitude de uma média de 10 respostas evocadas certificando-them pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos. Usar o método mostrado na Figura 1C para quantificar a resposta evocada. Repita este procedimento para 600, 800, 1.000, 1.200, e 1.400 uA.
- Construir uma curva de entrada / saída traçando a amplitude média da resposta evocada versus intensidade de estímulo. A partir deste gráfico determinar a intensidade de estímulo que corresponde a 50% da amplitude máxima de medida. Utilizar a intensidade de 50% para o restante da experiência.
- Em seguida, utilizando a intensidade do estímulo de 50%, se obter uma linha de base através da gravação da amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto durante 15 min. Mais uma vez certifique-se de que pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos.
- Posteriormente entregar a estimulação tetânica composto por 10 rajadas de 10 pulsos entregues a 400 Hz com uma taxa de disparo de 5 Hz para a via perfurante medial. Monitorar o animal de perto para sinais de apreensão, incluindo shakes cachorro molhado. Se o animal tem uma convulsão a experiment deve ser encerrado e todos os dados de que animal deve ser excluída dos resultados do estudo.
- Em seguida, continuar a gravar a amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto por 30 min posttetanization. Depois disso, comparar esta amplitude à amplitude da linha de base obtido no passo 2.5 calculando a percentagem de alteração a partir da linha de base (Fig. 2).
- Após a conclusão de experimentos, o animal é sacrificado por meio de inalação de isoflurano, um método que é consistente com as orientações sobre eutanásia da American Veterinary Medical Association.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Tabela 1 mostra as coordenadas para DG e MPP, usado neste protocolo Figura 1A apresenta as marcações para as estruturas alvo no crânio;.. Também são indicados a localização da terra e eletrodos de referência Figura 1B ilustra representante resposta evocada traça tanto pre- e posttetanization no mesmo animal. Note-se que a resposta evocada posttetanization é maior do que a resposta pretetanization que é indicativa de indução de LTP 2. Figura 1C ilustra o método utilizado para quantificar a amplitude de resposta. De fato, a Figura 2 mostra variação percentual na amplitude da resposta ao longo de um curso de tempo que abrange ambos os períodos pré e tempo posttetanization. É de notar que os valores de pico LTP excedeu 100%. Estes resultados de amplitude de resposta reforçada seguinte tetanization indicam que este protocolo é bem sucedida e, portanto, confiável para o estudo de LTPno modelo comportando livremente mouse.
Tabela 1. Coordenadas para estruturas alvo. Ântero-posterior (AP) coordenadas para giro denteado (DG) e REF são dadas em relação ao bregma, enquanto aqueles para medial caminho perforant (MPP) e GND são em relação ao Lambda. Todas as coordenadas DV são em relação à superfície cortical abaixo da dura.
Figura 1. Eléctrodo localização e vestígios representativos da resposta evocada. A) ilustração esquemática da localização relativa de eléctrodos no rato SKUll. B) traços típicos de resposta evocada, tanto pré-e posttetanization. C) O algoritmo utilizado para quantificar a amplitude da resposta evocada.
Figura 2. LTP no medial perforant caminho-giro denteado sinapse. Resultado Representante da indução da LTP em MPP-DG sinapse de um rato comportando livremente. Nota aprimoramento estimulação posttetanic da amplitude da resposta evocada indicativo de indução da LTP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste protocolo, demonstramos um método simples e confiável para o estudo de LTP em DG em ratos comportando livremente. Enquanto muitos estudos de LTP em ratos acordados foram realizados 3,4, muito poucos têm sido realizados em ratos acordados, principalmente devido à complexidade técnica colocado pela imobiliária craniana limitada em ratos eo peso do headstages eletrodo em relação ao peso médio de camundongos 5. Os poucos estudos que demonstraram LTP na DG em comportar livremente camundongos utilizados tanto sistemas de eléctrodos Microdrive ou efeito de campo de junção (JFET) transistor pré-amplificadores integrados no headstage que necessariamente aumenta o fardo eletrodo de carga útil para o animal 6-10. A importância do presente protocolo é que ele representa uma melhoria em relação aos métodos existentes para induzir LTP na DG em comportar livremente ratos, uma vez que evita o uso de sistemas de eléctrodos de Microdrive ou um JFET de headstage.
É importante para destacar as etapas críticas do presente protocolo. Estes incluem: 1) a montagem da cabeça do rato no quadro estereotáxico tal que é bilateralmente rígido (este passo pode ser a mais difícil, pois requer prática e familiaridade com a técnica), 2) o posicionamento ideal dos eletrodos para maximizar a magnitude da resposta pode ser reforçado, assegurando que bregma e lambda estão no mesmo plano, o qual geralmente pode ser conseguido ajustando a barra de dentes estereotáxica de tal modo que a diferença no posicionamento dorsoventral de bregma e lambda não é maior do que 0,1 mm e 3) durante a fase de gravação de da experiência, recomenda-se que os animais ser permitido tempo para se habituar ao ambiente de gravação, porque a novidade do meio de gravação podem insinuar flutuações nos dados de resposta evocada recolhidos, 4) selecção apropriada dos eléctrodos irá melhorar a qualidade do sinal e fidelidade: eléctrodos bipolares ( aço inoxidável tubulação hipodérmica com aço inoxidável 0,2 milímetrosinserção do fio com uma separação de ponta de 0,5 mm) são os preferidos para estimular enquanto eletrodos monopolar (único fio fio de tungstênio com isolamento epoxylite) são usados para gravação em tecido nervoso e 5) ratos podem ser anestesiados com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / mL) e acepromazina (0,5 mg / ml). Esta mistura de anestésico deve ser administrado a uma dosagem de 1ml/Kg que é geralmente eficaz em cerca de 20 min suplementados por 0,2 ml / kg a cada 45 min para manter uma profundidade estável de anestesia.
Existem algumas limitações deste protocolo que suportar mencionar. Este protocolo não dá qualquer visão sobre mecanismos de canais iônicos ou a síntese de proteína receptor que podem subserve LTP. Portanto poucas informações disponíveis sobre o número real de neurônios na população que está sendo gravado. Outra limitação é que, desde respostas evocadas estão sendo coletadas em animais acordados é difícil ascertain e dissecar o efeito de fatores como estresse, manipulação ou contaminação do sinal gravado pela atividade sensório espúrio. Essas limitações podem ser superadas, garantindo que as respostas evocadas são registradas apenas quando o animal é o estado inativo, mas alerta, também conhecido como o estado de vigília quieta vigilância.
No entanto, as técnicas descritas neste protocolo fornecer a plataforma mais fisiologicamente relevante para investigar o comportamento subjacente atividade elétrica cerebral. Seguindo os passos descritos neste protocolo, qualquer estrutura cerebral pode ser alvo usando as coordenadas adequadas como dado por um atlas do cérebro do rato 1. É importante notar que o rato adulto estereotáxica pode ser utilizado desde que em ratinhos punhos de orelha de rato lactente adequado são usados em vez das barras de ouvido regulares. As algemas de orelha vai imobilizar a cabeça, sem danificar as orelhas do rato. Finalmente, as metodologias aqui apresentadas podem ser readily traduzido para investigações eletrofisiológicos em transgênicos e knockout modelos de mouse de uma série de distúrbios neurológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o seguinte: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, o Sr. Austin-RJ LaFrance, ea Sra. Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
