穿通通路 - 齿状回突触在自由活动的小鼠长时程增强

Summary

神经系统疾病的转基因和基因敲除小鼠模型可用于研究基因在正常和异常的神经生理学中的作用是有用的。本文介绍的方法可用于研究长时程增强，它可依据学习和记忆，在转基因和基因敲除自由活动的神经病理学的小鼠模型细胞机制。

Abstract

的突触效能的长时程增强的研究，其特性使其作为一个潜在的细胞机制基本学习和信息存储吸引力的活动依赖的突触现象，早已被用来阐明各种神经回路中的海马，杏仁核的生理和其他边缘和皮质结构。考虑到这一点，神经系统疾病的转基因小鼠模型代表有用的平台上进行长时程增强（LTP）的研究开发基因在正常和异常的突触通信中参与学习，情感和信息的神经元网络中的作用更深入的了解处理。本文介绍的方法进行可靠地诱导LTP在自由活动的小鼠。这些方法可以在转基因的研究中使用和敲除自由活动的神经退行性疾病的小鼠模型。

Introduction

技术的发展来操纵基因产生了几乎每一个神经变性疾病和神经系统疾病的转基因和基因敲除小鼠模型。因此有必要在以前在较大的啮齿动物到小鼠动物模型中使用的电生理研究技术翻译。一个这样的神经电生理研究技术是利用长时程增强（LTP）来测试参与各种神经病理疾病的神经元网络中的突触连接的有效性。本协议描述技术LTP的自由活动的小鼠可靠的电生理研究。此协议的比其他的优点在于，它是简单和容易实现的，它也是相当少昂贵，因为它不需要也不使用昂贵的计算机控制的微驱动系统也不场效应晶体管的探头的，并且，据我们所知，是慢性电生理记录吨第一视频协议Ø研究LTP在自由活动的小鼠。为此，我们在本文中描述的简单方法用于研究长时程增强中自由活动的小鼠。这些方法可以很容易地转换成神经病理性疾病的转基因和基因敲除小鼠模型。

Protocol

这个协议是适当的为3至18个月的年龄和近似体重30-50克）的小鼠。老鼠可以从杰克逊实验室（缅因州巴港）获得。所有手术及实验方案已获本圣三一学院动物护理和使用委员会是根据美国国立卫生研究院指南实验动物的护理和使用。

1。动物的制备及外科手术

1. 制备含有氯胺酮（25毫克/毫升），甲苯噻嗪（2.5毫克/毫升）和乙酰丙嗪（0.5毫克/毫升）麻醉鸡尾酒。注射1毫升/公斤体重0.2毫升/公斤注射补充，每45分钟之后维持麻醉的使用踏板撤回反射稳定的深度腹部右下象限。
2. 通过使用电动剃须刀剃须皮草在其头盖骨准备麻醉的小鼠进行手术。剃光面积应包括眼睛的中间，耳朵中间。确保不刮胡子的whiske因为它们是鼠标桶的感官系统的一部分的RS。
3. 用棉签异丙醇其次是聚维酮碘适用于剃区域的头部。接着，也用棉签，适用于眼睛少量矿物油以防止眼球从干燥。
4. 使用婴儿鼠耳袖口，而不是常规耳棒装载动物的头部立体框架设备上。要做到这一点，首先安装在左耳上袖口左耳。然后轻轻地支持动物的头，用一只手，推进耳袖口用另一只手轻轻地右耳到右袖口。下一步，放置一个加热垫动物的身下，并将其设置到86°F，以保持体温。
5. 然后，尝试移动头部一侧到另一侧检查双侧刚性。动物被正确地安装在立体定位框架上时，头部是刚性的，不能移动一边到另一边，但可以很容易地转动上下运动。
6. 轻轻休息鼠的鼻/齿列上的口鼻部装配在确保门牙轻轻地但稳固地搁在鼻子/齿杆的齿孔径内。
7. 用无菌解剖刀，使中线切口从眼睛的中间开始向耳朵的中间。确保手术刀是在一个45°角举行，并施加足够的压力通过底层筋膜，但不切透颅骨因为这会导致过量出血。
8. 用棉签分离筋膜和暴露颅骨。地标颅骨前囟和lambda应清晰可见（ 图1A）。确保该动物的头骨平面位置通过调整鼻/齿栏，使得前囟和lambda的地标都在同一个背腹（DV）位置（+0.1毫米）。
9. 取少量无菌生理盐水到暴露的部位，用棉签轻轻擦拭头骨。然后等待2-3分钟的头骨完全风干然后再继续。
10. 安装在左手臂立体定位针测量前囟和lambda的DV位置。这两个标志性建筑的DV定位应在0.1 mm对方。如果不是，则立体框架的鼻部栏可以上下调节，以实现这一目标。
11. 定位于前囟针来记录它的前 - 后（AP），横向（LAT）和背腹（DV）的测量。可以肯定的针头刚触及颅骨和不穿透它。
12. 使用鼠标脑图谱，如“老鼠大脑中的立体坐标^”1，确定目标结构的坐标：海马内侧穿通通路（MPP）的束角和齿状回（DG），相对于拉姆达和前囟，分别为（也见表1）。然后，使用一个细点钢笔或铅笔上的骷髅标记这些点。
13. 此外，标上骷髅头的对侧两点。这些点WHICH将作为接地（GND）和基准（REF）应该是从中线约3毫米和纵向定位彼此相对（ 图1A，也见表1）。
14. 从左侧立体定位臂取下针头标记并将它与一个电动牙钻搭载了立体定位安装更换。定位钻头在每个标记点，使大约0.5毫米的直径小毛刺的孔。钻孔时，使用重复向上和向下运动，并经常检查钻头是否已经渗透颅骨暴露脑表面。
15. 轻轻地但坚定地螺丝钉电极（＃0-80不锈钢机螺钉1/8，开槽圆头）在每个对侧孔（GND和REF），使它们刚刚接触皮质表面无穿透它（ 图1A ）。这两个螺旋电极作为地面和参考。
16. 在电摩刺激和记录电极德持有人的左和右立体定位臂，分别。
17. 连接的刺激电极端子的电刺激器具有电流隔离和记录电极端子电生理学差分放大器（增益= 1,000，带通滤波器= 1赫兹-3千赫），然后到一个数字示波器诱发反应的目视检查。此外，连接GND和REF电极端子连接到差分放大器。
18. 轻轻地，慢慢地降低双方的刺激和记录电极以0.5 mm递增，同时在视觉上监测到600-800微安的刺激震撼的诱发反应。继续降低每个电极，直到他们达到各自目标的DV位置和刻板信号示波器（ 图1B）是观察。
19. 随后，用牙科丙烯酸水泥作盖固定到位的电极端子;任何牙科水泥，触及皮肤，应抹去马上。一旦牙科水泥完全固化的立体框架转移动物到一个干净的啮齿动物的笼子。用加热灯或垫以保持核心温度。
20. 监测动物每隔一小时，直到它恢复意识。一个注射氟尼辛可以施用作为镇痛药。

2。 LTP的诱导

1. 让动物5-7天，从手术中恢复。将动物组成的法拉第笼（122厘米x 43厘米x 43厘米）配备隔音材料和5通道换向器旋转连接电极导致刺激/记录设置的录音环境。
2. 让动物的电极连接到刺激和记录工具（参见步骤1.17），在之前的录音环境适应1-2小时。
3. 设置刺激器控制来输出400微安，并记录平均10的振幅诱发反应，确保第在刺激之间至少10秒的经过。使用图1C所示的方法进行量化的诱发反应。重复此过程，600，800，1,000，1,200，1,400和微安。
4. 通过绘制诱发反应与刺激强度的平均振幅构造的输入/输出曲线。从该曲线确定它对应于测得的最大振幅的50％的刺激强度。使用50％强度的试验的其余部分。
5. 然后，使用50％的刺激强度，通过记录5的平均振幅诱发反应每分钟15分钟得到基线。再次确保刺激之间至少有10秒的流逝。
6. 随后交付强直刺激组成的10连发10个脉冲传递在400赫兹，5 Hz到内侧穿通通路的爆率。密切监测动物扣押的迹象，包括湿狗甩头。如果动物有癫痫发作的experim耳鼻喉科应终止并从该动物的所有数据应该被排除在研究成果。
7. 然后，继续录得5的平均振幅诱发反应每分钟30分钟posttetanization。在此之后，这个幅度比较通过计算从基线的百分比变化（ 图2）在步骤2.5中得到的基准振幅。
8. 下列实验结束时，动物被吸入异氟醚的方法是与美国兽医医学协会安乐死的指导方针相一致的方式实施安乐死。

Representative Results

表1示出了如在此协议中使用的坐标为DG和MPP 图1A示出的标记为在头骨的目标结构;。还示出的是接地电极和参考电极的位置， 图1B示出了代表性的诱发反应的痕迹都预和posttetanization在相同的动物。注意，posttetanization诱发反应比pretetanization响应其表示LTP诱导^2。 图1C示出了用于量化的振幅响应的方法大。实际上， 图2示出了响应振幅百分比变化的时间过程跨越前和posttetanization时间段。但应当注意的是，峰LTP值超过100％。增强的响应幅值强直电刺激之后，这些结果表明，该协议是成功的，可靠的，因此为研究LTP在自由活动的小鼠模型。

表1的坐标。为目标的结构。前后（AP）的坐标齿状回（DG）和REF给出相对于前囟门，而那些内侧穿通通路（MPP）和GND是相对于LAMBDA。所有的DV坐标是相对于硬膜下皮质表面。

图1中，电极位置和诱发反应的代表性的痕迹。鼠标SKU 的 ）图解电极的相对位置图LL B）的诱发反应的典型迹线前和posttetanization C）的算法用于量化的诱发响应的幅值。

图2。LTP在内侧穿通路径齿状回突触。LTP诱导中自由表现的鼠标MPP-DG突触代表结果。注意诱发反应振幅指示诱导LTP的强直刺激强化。

Discussion

在这个协议中，我们已经证明了在自由活动的小鼠研究LTP在DG可靠，简便的方法。而LTP的清醒大鼠许多研究已经进行^3,4，很少有清醒小鼠主要是由于在小鼠颅有限，房地产和相对平均重量电极的探头的重量所带来的技术复杂性进行小鼠^5。的几项研究已证明LTP的DG在自由活动利用任一微驱动电极系统或结型场效应晶体管集成在这必然增加了电极的有效载荷负担的动物^6-10的探头（JFET）的前置放大器的小鼠。本议定书的意义在于，它是一个进步在现有的方法中自由活动的小鼠，因为它避免了使用微硬盘电极系统或探头JFET的诱导LTP的危险品。

它是important要突出这一协议的关键步骤。这些包括：将鼠标的头部1）安装在立体定位框架，使得其两侧的刚性（因为它需要实践和熟悉的技术中这一步可能是最困难的），2）的电极的最佳定位，以最大化响应幅度可以3）中的记录相;通过确保前囟和lambda是其中通常可以通过调整立体框架齿杆，使得在囟和lambda的背腹定位不同的是不大于0.1毫米可以实现在同一平面上得到加强该实验中，我们建议动物被允许的时间来习惯于给记录环境，因为该记录环境的新颖性可能​​暗示在收集的诱发响应数据的波动; 4）适当地选择电极将提高信号质量和保真度：双极电极（不锈钢管皮下0.2毫米不锈钢用0.5mm的尖端分离）线的插入是优选的，而单极电极（epoxylite绝缘单股钨丝）被用于记录在神经组织​​刺激;和5）小鼠可以用腹膜内注射氯胺酮的混合物被麻醉（25毫克/毫升），甲苯噻嗪（2.5毫克/毫升）和乙酰丙嗪（0.5毫克/毫升）。这种麻醉剂混合物应然后在1ml/kg通常是有效的在约20分钟0.2毫升/公斤，每45分钟补充，以维持麻醉的深度稳定的剂量给药。

有此协议，承担提到的一些限制。此协议不提供有关离子通道机制或受体蛋白的合成，可能subserve LTP的任何见解。因此，缺乏信息，请有关神经元的被记录的人口的实际数字。另一个限制是，由于诱发反应被收集在清醒动物也难以ascertAIN和剖析出的因素，如压力，处理或记录的信号通过寄生感觉活动的污染的效果。这些限制可以通过确保诱发反应记录只有当动物是无效的，但警戒状态，否则被称为安静清醒警觉的状态来克服。

然而，在本协议中所述的技术提供了调查的大脑电活动的基础行为的最生理学相关的平台。以下在本协议中所述的步骤，任何脑结构可以通过使用适当的坐标由下式给出的小鼠脑¹的图谱被瞄准。要注意，在成年大鼠脑立体定位框架可在提供的小鼠用于该合适的婴儿大鼠耳袖口被用来代替常规耳棒是重要的。耳袖口将固定头部不破坏老鼠的耳朵。最后，这里介绍的方法可以是readilŸ转换到主机神经系统疾病的转基因和基因敲除小鼠模型的电生理研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	10177
Xylazine (20 mg/ml)	Henry Schein	33197
Acepromazine (10 mg/ml)	Henry Schein	2177
Dental acrylic powder	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
Dental acrylic liquid	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm)	World Precision Instruments	TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm)	World Precision Instruments	832400
Flunixin (50 mg/ml)	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm)	World Precision Instruments	792900
Stereotaxic frame apparatus	Kopf Instruments	Model 902
Ear cuffs (ear cups)	Kopf Instruments	Model 921
Electrophysiological stimulator	Astro-Med, Inc.	S88
Digital oscilloscope	B K Precision Corp.	2542
Current isolation unit	Astro-Med, Inc.	PSIU-6
Differential amplifier	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
Commutator	Plastics One	SLC6
Dental drill	Stoelting	58650