Summary
מודלים עכבר מהונדסים ונוקאאוט של מחלות נוירולוגיות שימושיים לחקר התפקיד של גנים בנוירופיזיולוגיה נורמלית ולא נורמלית. מאמר זה מתאר שיטות שיכולים לשמש כדי לחקור הגברה לטווח ארוך, מנגנון תאי שעשוי בבסיס למידה וזיכרון, במהונדס ומפסיד יוצא, באופן חופשי מתנהג מודלים עכבר של neuropathology.
Abstract
מחקרים של הגברה לטווח הארוך של יעילות הסינפטית, תופעה הסינפטי פעילות תלויה שיש תכונות שהופכות אותו לאטרקטיבי לאחסון למידה ומידע פוטנציאלי מנגנון תאי בסיסי, כבר מזמן משמשים על מנת להבהיר את הפיסיולוגיה של מעגלים עצביים השונים בהיפוקמפוס, אמיגדלה , ומבנים הלימבית וקליפת מוח אחרים. עם זאת בחשבון, מודלים עכבר מהונדסים של מחלות נוירולוגיות מייצגים פלטפורמות שימושיות לנהל הגברה לטווח ארוך מחקרים (LTP) כדי לפתח הבנה טובה יותר של התפקיד של גנים בתקשורת הסינפטית נורמלית ולא נורמלית ברשתות עצביות מעורבות בלמידה, רגש ומידע עיבוד. מאמר זה מתאר שיטות לאמינות גרימת LTP בעכבר מתנהג בחופשיות. מתודולוגיות אלה יכולים לשמש במחקרים של מהונדס ונוקאאוט מתנהגים מודלים עכבר של מחלות ניווניות באופן חופשי.
Introduction
הפיתוח של טכנולוגיה כדי לתפעל את הגנים ייצר מודלים עכבר מהונדסים ונוקאאוט של כמעט כל מחלות ניווניות ונוירולוגיות. זו חייבה תרגום של טכניקות מחקר אלקטרו השתמשו בעבר במינים מכרסמים גדולים יותר למודל החיה בעכבר. טכניקת חקירה נוירופיזיולוגיות אחת כזו היא השימוש בהגברה לטווח ארוך (LTP) על מנת לבחון את יעילותם של קשרים סינפטיים בתוך הרשתות עצביות מעורבות בהפרעות נוירו שונות. פרוטוקול זה מתאר טכניקות לחקירת אלקטרו אמינה של LTP במתנהגים עכברים באופן חופשי. היתרון של פרוטוקול זה על פני אחרים הוא שהוא פשוט וקל ליישום, אלא הוא גם לא פחות יקר כפי שהוא אינו דורש לא את השימוש במערכות יקרות מבוקר מחשב דיסק קשיח זעירות ולא headstages טרנזיסטור אפקט שדה וכן, למיטב ידיעתנו, הוא וידאו הפרוטוקול הראשון של t קלטות אלקטרו הכרוניo ללמוד LTP במתנהג עכברים באופן חופשי. לשם כך, אנו מתארים במאמר זה מתודולוגיות פשוטות ללימוד הגברה לטווח ארוך בעכברים מתנהגים בחופשיות. בקלות ניתן לתרגם מתודולוגיות אלה למודלי עכבר מהונדסים ונוקאאוט של הפרעות נוירו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה הוא מתאים לעכברים של 3 וגיל 18 חודשים ומשקל גוף משוער של 30-50 גר '). ניתן להשיג עכברים מהמעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME). כל הפרוטוקולים כירורגית וניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בטריניטי קולג' והיו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה.
1. הכנת בעלי החיים ופרוצדורות כירורגיות
- הכן קוקטייל הרדמה המכיל קטמין (25 מ"ג / מיליליטר), xylazine (2.5 מ"ג / מיליליטר) וacepromazine (0.5 מ"ג / מיליליטר). הזרק 1 מיליליטר / קילוגרם משקל גוף ברבע הימני התחתון של הבטן בתוספת 0.2 זריקות מיליליטר / קילוגרם מדי דקות 45 לאחר מכן כדי לשמור על עומק יציב של הרדמה באמצעות רפלקס נסיגת דוושה.
- הכן עכבר הרדים לניתוח על ידי גילוח הפרווה על הגולגולת שלה באמצעות מכונת גילוח חשמלית. האזור המגולח צריך לכלול אמצע העיניים עד אמצע האוזניים. ודא שלא לגלח את whiskers כפי שהם חלק מהמערכת החושית חבית עכבר.
- השתמש בצמר גפן כדי להחיל איזופרופיל אלכוהול ואחריו פולידין לאזור המגולח על הראש. ואז, גם בעזרת צמר גפן, למרוח כמות קטנה של שמן מינרלים על העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
- השתמש באזיקי אוזן החולדה תינוק במקום ברים אוזן רגילים לעלות בראשו של בעל החיים על מנגנון מסגרת stereotaxic. כדי לעשות זאת, הר ראשון אוזן השמאל בשרוול אוזן השמאל. ואז בעדינות להקל על אוזן ימין על השרוול הימני בעדינות על ידי תמיכה בראשו של בעל החיים ביד אחת ולקדם את שרוול האוזן ביד השנייה. בשלב הבא, הנח כרית חימום מתחת לגופו של בעל החיים ולהגדיר אותו 86 ° F כדי לשמור על טמפרטורת גוף.
- לאחר מכן, בדוק לנוקשות דו צדדיות על ידי ניסיון להזיז את צד הראש לצד. בעלי החיים הוא רכוב כראוי במסגרת stereotaxic כאשר הראש הוא נוקשה ולא ניתן להעביר מצד לצד, אבל בקלות יכול לסובב למעלה ולמטה.
- בעדינות לנוחחוטמו של העכבר על סרגל האף / שיני הרכבה כדי לוודא שהשיניים החותכות נחים בעדינות אך בצורה מאובטחת בתוך צמצם השן של הבר האף / שיניים.
- באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך קו האמצע החל מאמצע העיניים עד אמצע האוזניים. ודא האזמל הוא יתקיים בזווית של ° 45 ולהחיל לחץ מספיק כדי לחתוך את fascia הבסיסי, אך לא דרך הגולגולת כמו שיגרמו לדימום יתר.
- השתמש בצמר גפן כדי להפריד את fascia ולחשוף את הגולגולת. גולגולת ציוני דרך גבחת ומבדה צריכה להיות לעין (איור 1 א). להבטיח כי בעלי החיים נמצאים במצב הגולגולת שטוחה ידי התאמת סרגל האף / שן כך שציוני דרך גבחת ומבדה נמצאים באותה עמדת dorsoventral (DV) (+ 0.1 מ"מ).
- למרוח כמות קטנה של תמיסת מלח סטרילית לאזור החשוף ולהשתמש בצמר גפן כדי לנקות את הגולגולת בעדינות. אז חכה 2-3 דקות לגולגולת לאוויר יבש לחלוטיןלפני שתמשיך.
- הר מחט על זרוע stereotaxic עזבה כדי למדוד את עמדת DV של גבחת ולמבדה. מיצוב DV של שני ציוני הדרך האלה צריך להיות בתוך 0.1 מ"מ זה מזה. אם לא, בר האף של מסגרת stereotaxic יכול להיות מותאם למעלה ולמטה כדי להשיג זאת.
- מקם את המחט על גבחת להקליט קדמי, האחורי שלו (AP), רוחב (LAT) ומדידות dorsoventral (DV). הקפד המחט רק נוגעת בגולגולת ולא לחדור אותו.
- השתמש באטלס מוח עכבר, כגון "מוח העכבר בStereotaxic קואורדינטות" 1, כדי לקבוע את הקואורדינטות של מבני היעד: מסלול המדיאלי perforant (MPP) בצרור זוויתי וgyrus משוננת (DG) של ההיפוקמפוס, יחסית למבדה וגבחת, בהתאמה (ראה גם טבלה 1). לאחר מכן, השתמש בעט עדין נקודה או עיפרון כדי לסמן את הנקודות הללו בגולגולת.
- כמו כן, תציין שתי נקודות יותר בצד הנגדי של הגולגולת. נקודות אלה wיהיה hich לשמש כקרקע (GND) והפניה (REF) צריך להיות כ 3 מ"מ מקו האמצע ואת מיקומו אורכים יחסית זה לזה (איור 1 א, גם טבלת 1).
- הסר את סמן המחט מזרוע stereotaxic עזבה ולהחליף אותו עם מקדח שיניים חשמלי מצויד בהר stereotaxic. מקם את התרגיל על כל נקודה משמעותית ולעשות חורים בר קטנים של כ 0.5 מ"מ קוטר. כאשר קידוח, ישתמש בתנועה למעלה ולמטה חוזר על עצמו ולבדוק בתדירות גבוהה אם התרגיל חדר את הגולגולת כדי לחשוף את משטח המוח.
- בעדינות אך בתקיפות לנהוג באלקטרודה בורג (# 0-80 1/8 בברגים במכונת נירוסטה, מחוררת fillister הראש) בכל אחד מהחורים נגדי (GND וREF) כך שהם רק נוגעים במשטח קליפת המוח מבלי לחדור אותו (איור 1 א ). שתי אלקטרודות בורג אלו משמשות כקרקע והתייחסות.
- אלקטרודות מגרה והקלטת הר באלקטרומחזיקי דה על זרועות stereotaxic ימין ועל שמאל, בהתאמה.
- חברו את מסופי אלקטרודה מגרה לממריץ אלקטרו עם בידוד הנוכחי ומסוף האלקטרודה הקלטה למגבר אלקטרו ההפרש (רווח = 1,000, מסנן bandpass = 1 הרץ-3 קילוהרץ) ולאחר מכן לאוסצילוסקופ דיגיטלי לבדיקה ויזואלית של עוררו תגובות. כמו כן, חיבור הארקה ומסופי האלקטרודה REF למגבר ההפרש.
- בעדינות ולאט לאט נמוך גם מגרה ואלקטרודות הקלטה ב0.5 מרווחי מ"מ תוך ניטור התגובה העוררת לזעזוע גירוי של 600-800 UA מבחינה ויזואלית. להמשיך ולהפחית כל אלקטרודה עד שהם מגיעים עמדתם DV בהתאמה היעד ואות סטריאוטיפית הוא ציין על אוסצילוסקופ (איור 1).
- לאחר מכן, השתמש במלט אקריליק שיניים כדי להפוך את כובע כדי להחזיק את מסופי האלקטרודה במקום; כל מלט שיניים שנוגע בעור צריך להימחק מבאופן מיידי. ברגע שמלט השיניים הוא נרפא לגמרי להעביר את בעלי החיים מהמסגרת stereotaxic לכלוב מכרסם נקי. השתמש במנורת חימום או כרית כדי לשמור על טמפרטורת ליבה.
- לפקח על בעלי החיים בכל שעה עד שהוא חוזר להכרה. הזרקה של flunixin יכולה להינתן כמשכך כאבים.
2. LTP אינדוקציה
- לאפשר לבעלי החיים 5-7 הימים כדי להתאושש מניתוח. מניחים את החיה בסביבת ההקלטה בהיקף של כלוב פאראדיי (122 סנטימטר x 43 סנטימטר x 43 סנטימטר) לבוש עם חומרי בידוד מרעש ומחלף מסתובב 5 ערוצים המחברים את האלקטרודה מובילה להתקנת מגרה / הקלטה.
- לאפשר לבעלי החיים להסתגל ל1-2 שעות בסביבת ההקלטה לפני החיבור אלקטרודות למכשירים המגרים והקלטה (ראה צעד 1.17).
- הגדר את בקרות ממריץ לפלט 400 UA ולהקליט את המשרעת של ממוצע של 10 עורר תגובות הופכות ה בטוחבלפחות 10 חלוף שניות בין גירויים. השתמש בשיטה שמוצגת באיור 1C לכמת את התגובה עורר. חזור על תהליך עבור 600, 800, 1,000, 1,200, 1,400 וUA.
- לבנות עקומת קלט / פלט על ידי התוויית המשרעת הממוצעת של התגובה עוררה לעומת עוצמת גירוי. ממגרש זה לקבוע את עוצמת הגירוי אשר תואמת 50% ממשרעת המרבית שנמדדה. השתמש בעוצמת 50% לשארית של הניסוי.
- לאחר מכן, באמצעות עוצמת גירוי 50%, להשיג נקודת התחלה על ידי הקלטה את המשרעת הממוצעת של 5 עוררה תגובות מכל רגע במשך 15 דקות. שוב לוודא כי לפחות 10 חלוף שניות בין גירויים.
- בהמשך לכך להעביר את גירוי tetanic בהיקף של 10 פרצי 10 פולסים מועברים ב400 הרץ עם שיעור פרץ של 5 הרץ למסלול perforant המדיאלי. לפקח על בעלי החיים מקרוב אחר סימנים של התקף, כוללים שייקים של כלב רטובים. אם בעל החיים יש תפיסת experiment יש לסיים ואת כל הנתונים מבעלי החיים שצריכים להיות שליליים מתוצאות המחקר.
- לאחר מכן, ימשיך להקליט את המשרעת הממוצעת של 5 עוררה תגובות מכל רגע ל30 posttetanization דקות. אחרי זה, להשוות משרעת זה למשרעת הבסיסית שהושגה בשלב 2.5 על ידי חישוב אחוז השינוי מנקודת ההתחלה (איור 2).
- לאחר סיום הניסויים, בעלי החיים הוא מורדמים באמצעות שאיפה של isoflurane-שיטה שבה עולה בקנה אחד עם ההנחיות על המתת חסד של האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טבלת 1 מציגה את הקואורדינטות לDG וMPP כמו בשימוש בפרוטוקול זה איור 1 א מציג את הסימונים למבני היעד בגולגולת;.. הראה גם הם את מיקומו של אלקטרודות קרקע והתייחסות איור 1 מדגים נציג עורר תגובת עקבות שניהם מראש וposttetanization באותה החיה. שים לב שposttetanization עורר תגובה היא גדולה יותר מאשר תגובת pretetanization אשר מעידה על LTP אינדוקציה 2. תרשים 1C ממחיש את השיטה המשמשת לכמת את משרעת התגובה. ואכן, איור 2 מראה אחוז שינוי במשרעת תגובה על מהלך זמן פורש שני תקופות לפני וזמן posttetanization. זה יש לציין, כי ערכי LTP שיא חרגו 100%. תוצאות אלו של tetanization הבא משרעת תגובה המשופרת מצביעות על כך שפרוטוקול זה הוא מוצלח ולכן אמין ללימוד LTPבמודל העכבר מתנהג בחופשיות.
טבלת 1. קואורדינטות עבור מבני יעד. קדמי, אחורי (AP) קואורדינטות עבור gyrus משוננת (DG) וREF ניתנות ביחס לגבחת ואילו אלה למסלול המדיאלי perforant (MPP) ו GND ביחס למבדה. כל קואורדינטות DV ביחס למשטח קליפת המוח מתחת דורה.
איור 1. מיקום אלקטרודה ועקבות נציג התגובה עוררה. א) איור תרשים של המיקום היחסי של אלקטרודות על SKU העכברll. ב ') עקבות אופייניות של התגובה עוררה גם לפני וposttetanization. C) אלגוריתם המשמשים לכמת את המשרעת של התגובה העוררת.
איור 2. LTP בסינפסה gyrus המדיאלי perforant הנתיב משוננת. תוצאת נציג של האינדוקציה LTP בסינפסה MPP-DG של עכבר מתנהג בחופשיות. הערה שיפור גירוי posttetanic של משרעת התגובה עוררה מעידה על האינדוקציה LTP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, יש לנו הפגין שיטה אמינה ופשוטה ללימוד LTP בDG בעכברים מתנהגים בחופשיות. בעוד שמחקרים רבים של LTP בחולדות ערה בוצעו 3,4, מעט מאוד שנערכו בעכברים ער בעיקר בשל המורכבות הטכנית שמציבה הנדל"ן המוגבל גולגולת בעכברים ובמשקל של headstages האלקטרודה ביחס למשקל הממוצע של עכברים 5. כמה מחקרים שהוכיחו LTP בDG במתנהגים עכברים מנוצלים גם מערכות אלקטרודה דיסק קשיחות זעירות או טרנזיסטור אפקט שדה צומת preamplifiers (JFET) משולב בheadstage אשר בהכרח מוסיפה לניטל מטען האלקטרודה לבעלי החיים 6-10 באופן חופשי. המשמעות של הפרוטוקול הנוכחי היא שהוא מייצג שיפור על פני שיטות קיימות לגרימת LTP בDG במתנהג בחופשיות עכברים כפי שהוא ימנע את השימוש במערכות אלקטרודה דיסק קשיחות זעירות או headstage JFET של.
זה important כדי להדגיש את השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה. אלה כוללים: 1) הרכבה של ראשו של העכבר במסגרת stereotaxic כזה שזה בילטרלי נוקשה (צעד זה עשוי להיות הקשה ביותר כפי שהוא דורש תרגול והיכרות עם הטכניקה); 2) מיצוב אופטימלי של אלקטרודות למקסם את עוצמת תגובה יכול להיות מוגבר על ידי ביטוח שגבחת ומבדה נמצאות באותו המישור שבו בדרך כלל יכולים להיות מושגת על ידי התאמת סרגל stereotaxic מסגרת השן כך שההבדל במיצוב dorsoventral של גבחת ומבדה אינו עולה 0.1 מ"מ; 3) בשלב ההקלטה של הניסוי, מומלץ שיורשו בעלי חיים זמן להרגיל לסביבת ההקלטה משום החידוש של סביבת ההקלטה עשוי לרמוז תנודות בנתונים התגובה העוררות נאספו; 4) הבחירה מתאימה של אלקטרודות תשפר את איכות אות ונאמנות: אלקטרודות דו קוטבית ( צינורות תת עורי נירוסטה עם נירוסטה 0.2 מ"מהוספת חוט עם הפרדת קצה 0.5 מ"מ) הם העדיפו לגירוי תוך אלקטרודות monopolar (תיל טונגסטן הגדיל בודד בידוד epoxylite) משמשות להקלטה ברקמת עצבים; ו5) עכברים יכולים להיות מורדמים באמצעות זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין (25 מ"ג / מיליליטר), xylazine (2.5 מ"ג / מיליליטר) וacepromazine (0.5 מ"ג / מיליליטר). תערובת הרדמה זה אמורה להיות במינון של 1ml/kg שהיא בדרך כלל יעילה בכ -20 דקות בתוספת 0.2 מיליליטר / קילוגרם מדי דקות 45 כדי לשמור על עומק יציב של הרדמה.
ישנן כמה מגבלות של פרוטוקול זה אשר נושא להזכיר. פרוטוקול זה לא נותן תובנה כלשהי על מנגנוני ערוץ יון או סינתזת חלבון קולטן שעשויה subserve LTP. לכן מידע מועט זמין בנוגע למספרים האמיתיים של נוירונים באוכלוסייה המוקלטת. מגבלה נוספת היא שמאז שעוררו תגובות הנאספות בחיות ערה קשה ascertעין ולנתח את ההשפעה של גורמים כמו לחץ נפשי, טיפול, או זיהום של האות נרשמה על ידי פעילות הסנסורית מזויפת. ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי הבטחה שעורר תגובות נרשמות רק כאשר בעלי החיים הוא המצב לא פעיל, אבל ערני, הידוע גם במצב ערנות עירות השקט.
עם זאת, הטכניקות מתוארות בפרוטוקול זה מספקות את הפלטפורמה הכי רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקירת התנהגות בסיסית פעילות חשמלית במוח. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, כל מבנה מוח יכול להיות ממוקד על ידי שימוש בנקודתי הציון הראוי, כפי שניתן על ידי אטלס של מוח העכבר 1. חשוב לציין כי מסגרת stereotaxic העכברוש המבוגר ניתן להשתמש בעכברים בלבד שאזיקי אוזן החולדה תינוק מתאים משמשים במקום הברים אוזן הרגילים. אזיקי האוזן יהיה לשתק את הראש מבלי לפגוע אוזניו של העכבר. לבסוף, מתודולוגיות שהוצגו כאן יכולות להיות readily תורגם לחקירות אלקטרו במהונדס ומודלי עכבר בנוקאאוט של שורה של הפרעות נוירולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות הבא: ד"ר יוסף ברונזינו, ד"ר חמיס אבו Hassaballah, מר RJ אוסטין-LaFrance, והגב 'ג'סיקה Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
