Summary
Здесь мы приводим протокол для выполнения полупроницаемую с высокой пропускной способностью анализа миграции клеток на 96-луночный культуральный планшет. Этот протокол является быстрый, простой и экономичный способ создать логичную скретч раны на клетку монослоя.
Abstract
Миграции клеток / ранив анализа является широко используемым методом для изучения миграции клеток и другие биологические процессы, такие как ангиогенез и метастазирование опухоли. В этом анализе клетки выращивают с образованием сливающийся монослой и механический рана создается царапанием с устройством. Тогда скорость миграции клеток по отношению к обнаженную область можно контролировать с помощью визуализации. Наш 8-канальный механический wounder предназначен для решения большинства проблем, связанных с миграцией клеток анализа. Во-первых, наша wounder можно легко стерилизовать автоклавированием или с общими дезинфицирующими средствами. Во-вторых, отдельные регулируемые штифты позволяют даже контактировать с клеточной культуральной пластины таким образом, что могут быть созданы острые и воспроизводимые раны. В-третьих, направляющие стержни с обеих сторон wounder обеспечить последовательную позицию ранив в каждую лунку. Использование одноразовых наконечников пластиковой пипетки для ранении может дополнительно обеспечивать лучшее обработку wounder, а также свести к минимуму перекрестные contaminatиона. В заключение, наша ячейка wounder может предоставить исследователям с удобным и воспроизводимым устройством для проведения анализа миграции клеток с использованием стандартного 96-луночного культурального пластину.
Introduction
Миграция клеток играет важную роль в клеточных процессах, таких как эмбриогенез, нейрогенез, ангиогенез, заживление ран, слизистых оболочек, эпителиальные ремонт-мезенхимальных-переходов при нормальном развитии и ситуации заболевания 1. Это сложный процесс , который включает в себя координацию многочисленных меж- и внутриклеточных событий , в том числе сигнальных взаимодействий молекул, поляризация клеток, цитоскелета реорганизации, матрицы ремоделирования, мембранного выпячивания и динамическая межклеточной адгезии модуляции 2. Путем изучения миграции клеток, обнаружение и проверка химических веществ или биологических молекул, приводящих к движению клеток и связанных с ней биохимических путей может быть определена. Этот фундаментальный процесс может быть использован с выгодой в качестве прокси-сервера для различных приложений, таких как лечение заболеваний и наркомании таргетинга.
Ранив анализ является одним из клеточной миграции анализов 3. Здесь Anиндивидуальный образец клеток будут частично удалены с помощью механических средств, чтобы произвести обнаженную область, где клетки будут мигрировать, чтобы покрыть область. Процент восстановления в определенный момент времени будет контролироваться. При обработке большого количества образцов, такие вопросы, как экспериментальной стоимости и перекрестного загрязнения в образцах может быть проблематичным. Хотя многие коммерческие инструменты и анализы доступны для изучения миграции клеток 4, 5, 6, многие из них требовали дорогих и сложное оборудование , и все еще необходимы улучшения. По этим причинам, 8-канальный механический ячейки wounder (рисунок 1) разрабатывается.
Наш 8-канальный механический ячейка wounder включила несколько уникальных особенностей в решении вышеуказанных проблем. Это обеспечивает гибкость для выполнения миграции клеток / ранив анализов в формате культуры 96-луночного планшета. Регулируемое гуiding дизайн бар гарантирует, что площадь повреждения находится в центральном положении каждой лунки. Кроме того, высота направляющих стержней может быть отрегулирована таким образом, чтобы wounder применима для различных марок культуральных планшетов. И, наконец, регулируемая конструкция позволяет ранении контактный ровный контакт кончиках пипеток с поверхностью пластины культуры для достижения одновременного и воспроизводимую ранению 7, 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Введение в Части Wounder (Рисунок 1)
- Подготовьте держатель штифта путем фиксации ранении штифты на равных расстояниях. Держите кончики пипеток и отрегулируйте высоту наконечника путем перемещения регулируемых ранив штифты вверх и вниз.
- Установить регулируемый ориентируемся планку на различных марок 96-луночные культуральные планшеты и убедитесь, что площадь ранении находится в фиксированном положении.
- Закрепите регулируемое ранив штифт, затянув болт с шестигранной головкой. Закрепите направляющую-бар в положении, затянув колпачки с шестигранной головкой гнездо на обоих концах.
2. Установка ширины держателя Pin (Рисунок 2)
- Ослабьте крышки головки шестигранником с шестигранным ключом M5.
- Вставьте подходящее количество регулировочных колец с обеих сторон держателя штыря таким образом, чтобы направляющие стержни идеально подходят с шириной культуры 96-луночного планшета.
Примечание: Corning и Иваки пластины требуется 1 пара больших колец и 1 пару маленьких колец. Сокол и Nunc плАтес нужно 1 пара больших колец. - Затянуть головку шестигранной крышки, чтобы зафиксировать направляющую планку.
3. Регулировка Руководящие Бары (Рисунок 3)
- Установить контакты с ранив стерильные 10 мкл пластиковыми наконечниками пипетки.
- Ослабьте крышки головки шестигранником с шестигранным ключом M5.
- Держите wounder и окунуть ранении булавки в одну колонку культуры пластины 96-луночного.
- Отрегулируйте высоту направляющих стержней, пока все советы едва касаться дна лунок.
- Затянуть крышки головки шестигранником. Убедитесь в том, что в настоящее время wounder идеально подходит на культуральном планшете и что контакты хорошо расположены в центре лунки.
4. Калибровка Pins
- Держите wounder перпендикулярно к плоской поверхности стерильной (т.е. чашки Петри) и ослабить все шестигранные винты с шестигранным ключом M3.
- Нажмите wounder пока все советы равномерно касаться плоской стерильной поверхности. </ Li>
- Затянуть шестигранные винты снова, чтобы зафиксировать штифты в нужном положении.
- Проверьте ровность каждого наконечника, нажав на wounder аккуратно на плоской поверхности стерильной.
5. Царапины монослой клеток (рисунок 4)
- Семенной пупочные эндотелиальные клетки сосудов человека на 0,1% желатин покрытием 96-луночный культуральный планшет. Культура клеток в среде 199 с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина и 0,09 г / л гепарина. Поддерживать клетки в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа при 37 ° С в течение ночи перед использованием. Клетки должны достигнуть 100% слитности, прежде чем ранив.
- Поместите кончики Wounding на крайнего левого (или крайней правой) стороне каждой лунки в той же самой колонке культурального планшета. Вставьте wounder на другую сторону скважины; убедитесь, что ранении советы касаются дна колодца.
- Повторите царапать (шаг 5.2) для всех столбцов.
- После того, как ранении, отбрасывать тон среда в каждую лунку, и заменяют свежей средой, содержащей соединения тестирования.
6. Сбор данных и анализ изображений
- Изображение в целом хорошо с механической раной на монослой клеток с использованием малой мощности микроскоп с цифровой камерой (например , объективной 10X) сразу после того, как ранении (Т = 0 ч).
- Добавить тестируемые соединения, если это необходимо, и инкубировать в течение желаемого промежутка времени. Изображение в целом хорошо с области раны снова после требуемого времени инкубации (т =) & delta; н.
- С помощью анализа изображений программное обеспечение как ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), измерьте раненую область на изображении с помощью инструмента Freehand.
- Вычислить процент закрытия раны:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот 8-канальный механический wounder построен поцарапать монослой клеток для выполнения анализа миграции клеток. Это удобно устройство, которое может выполнять клеточные царапать анализы в 96-луночные планшеты в менее чем за минуту без специальной подготовки. Это wounder можно ввести области , намотанных на клеточных монослоев с равномерной шириной около 600 мкм и с острыми краями (5 и 6). Ширина раны зависит от марки пипеток и производительности пользователя. Этот диапазон раневого ширины подходит для общего захвата изображения под малым увеличением (рис 7). После захвата изображения, процент закрытия раны может быть вычислена. Эта ячейка wounder включила различные стратегии в решении проблем, с которыми сталкиваются с миграцией клеток анализа. Кроме того, она обеспечивает гибкость при выполнении анализов миграции клеток в различных 96-луночного культурального плпоел форматы.
Рисунок 1: Восьмиканальный механическая ячейка wounder. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Отрегулируйте ширину держателя штыря. Вставьте регулировочные кольца, чтобы соответствовать пластины 96 скважин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Отрегулируйте направляющие стержни , чтобы соответствовать различные форматы пластины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Царапины направление наконечника. Поцарапать клетки, сдвинув wounder с одной стороны от забоя скважины к другой стороне нижней части скважины.
Рисунок 5: Обзор 96-луночного планшета после ранения. Клеточный монослой раненный wounder производящего острых кромок с равномерным шириной около 600 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. < / Р>
Рисунок 6: Типичные изображения строки и столбца скважин сразу после расчесывания. Количественный анализ ширины каждой раны. Изображения захватываются под объективом 10Х. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: отснятые снимки раны (цель 10X) при Т = 0 ч и т =. & Delta ; H Пунктирная линия указывает на область раны и сплошная линия показывает область миграции клеток. A) пупочной вены человека эндотелиальные клетки. Б) Человеческий кожная фибробластов.получить = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша ячейка wounder имеет несколько уникальных особенностей в решении проблем традиционной миграции клеток анализов. 8-канальный механический ячейки wounder изготовлен из высококачественной нержавеющей стали (сталь 304) с длительным сроком службы, который можно стерилизовать автоклавированием. Почти все коммерческие марки 96-луночные планшеты для культуры, доступных на рынке могут быть использованы с этой механической клетки wounder из-за регулируемым направляющим брусом. Конструкция регулируемого направляющим брусом также гарантирует, что площадь царапанью в центре каждой лунки. Рану в центральном положении скважины может способствовать захвата изображения с помощью микроскопа. Изображения имеют некоторые вариации в то время как взятые в разные моменты времени, но они не влияют на анализ данных , так как почти 90% площади также можно рассматривать с помощью микроскопа с объективом с низким увеличением (т.е. 10X). Таким образом, анализ полу-высокой пропускной способностью, может быть выполнена на 96-луночные культуральные планшеты 7, <вир класс = "Xref"> 8. Тем не менее, этот способ все еще требует большого количества изображений, которые требуют продолжительного анализа данных. Это может быть решена, если автоматическая система получения изображения доступен.
Конструкция отдельных регулируемых штифтов wounder позволяет даже связаться с 96-луночного поверхности пластины для достижения одинаковых, гладкие и острые раны на клеточный монослой. Скрип булавки коммерческие советы пластиковые пипетки, которые могут быть стерилизованы и после того, как расположены каждого расчесывания, и может обеспечить большую эластичность, чтобы связаться с поверхности скважины без механических повреждений. Эти преимущества могут дополнительно минимизировать перекрестное загрязнение образцов в течение эксперимента, а также влияние на движение клеток через обнаженную область. В будущем, мы будем развивать пружинный управляемый штифт, который может устранить шаг штифт регулировки высоты. Самый важный шаг, чтобы использовать это устройство является сила, приложенная на клеточный монослой во время расчесывания. Wounder долженпроходить перпендикулярно по отношению к культуре пластины, так что восемь советов пипеток касаясь дна колодца. В самом деле, wounder предоставляет способ для выполнения анализа миграции клеток без использования дорогостоящего и сложного оборудования. Протокол данного wounder прост и понятен.
В заключение, наш 8-канальный механический wounder является удобным устройством для миграции клеток анализов, которые не требует никаких специальных навыков. Пользователи могут выполнять анализ миграции клеток в 96-луночные планшеты с относительно большим числом выборок в быстрой и простой форме 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить г Tam Po Leung, г-н Вонг Чи Кин и технический состав факультета Workshop науки, Гонконг Baptist University, за свои технические навыки и консультации в создании прототип этого wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
