Summary
Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.
Abstract
Leucemia mieloide aguda (AML) es heterogénea y si no se trata, la enfermedad fatal. Es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia en adultos. Inicialmente, la LMA es una enfermedad de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga de la leucemia y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Heterogeneidad se extiende a la presencia de células de la leucemia (LSC), con esta dinámica celular compartimiento evolucionando para superar distintas presiones de selección impuestas durante el tratamiento y la progresión de la leucemia. Para definir la población de la LSC, la adición de CD90 y CD45RA permite la discriminación de HSCs normales y progenitores multipotentes dentro del compartimiento de células CD34 + CD38. Aquí, describimos un protocolo para detectar la expresión simultánea de varios marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) en las células primarias de la ráfaga de AML humana mediante citometría de flujo multiparamétrico. Además, mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos. Este método de detección y cuantificación de LSC putativo pueden usarse para el seguimiento clínico de la respuesta de la quimioterapia (ej., enfermedad residual mínima), como LSC residual puede causar recaída AML.
Introduction
Leucemia mieloide aguda (AML) es la causa más común de mortalidad asociada a la leucemia. Inicialmente, la LMA es una enfermedad clonal de las células madre hematopoyéticas (HSC) caracterizado por la detención de la diferenciación, la posterior acumulación de células de la ráfaga y la producción de elementos hematopoyéticos funcionales. Recientemente, heterogeneidad clonal de la población de células de la ráfaga se ha establecido básicamente utilizando estrategias de secuenciación (NGS) de próxima generación y que muestra la existencia de la evolución intra clonal del tumor las células1.
Heterogeneidad se extiende a la presencia de células leucémicas (LSC). Se presume que este compartimiento celular dinámica evoluciona para superar distintas presiones de selección impuestas durante el tratamiento y la progresión de la leucemia. LSC, por tanto, debían ser resistentes a los regímenes quimioterapéuticos actuales y mediar la recaída de la enfermedad, con profundas implicaciones clínicas2. Se han descrito diversos marcadores para caracterizar la LSC como CD1233, 1 CLL4, CD975 o TIM-36. El CD34 + CD38-compartimiento de células de la ráfaga se considera para ser enriquecidos para LSC7 pero también incluye HSC normal. CD90 y CD45RA expresión aplicada a CD34 + CD38-compartimiento (P6) (figura 1) permite para segregar varias etapas de precursores hematopoyéticos normales y malignas8. En concreto, normales CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotentes progenitores (MPP) como CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-células CD34 + CD38-CD90-CD45RA + células progenitoras multipotentes linfoide preparado (LMPP) pueden determinarse en la mayoría de AML casos8 ,9. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD38 es particularmente importante a considerar dentro del compartimiento de la célula de CD34 +. Debido a intensidad de CD38 define sus tres compartimentos celulares nuevos: CD38 negativo (P6), CD38 dim (P7) y CD38 brillante (P8) (figura 1). El MFI de CD38 puede determinarse utilizando hematogones o células plasmáticas como control positivo interno, estas células expresan fuertemente CD38.
El modelo de ratónnulo (NSG) inmunodeficiente NOD/SCID/IL2Rγc es ampliamente utilizado para el engraftment de normal y humanos malignos hematopoyéticos células10,11. Xenotrasplante serie ensayos se utilizan para validar experimentalmente la función LSC o HSC. Estos estudios han sido ampliamente analizados por métodos de secuenciación a gran escala. Sin embargo, poco se sabe sobre el immunophenotype LSC y HSC de la población de la ráfaga AML engrafted en ratones NSG en comparación con la LMA primaria (figura 2).
Los números de LSC son inherentemente bajos así, identificación y cuantificación de LSC son desafiantes y el método descrito aquí puede utilizarse como un análisis de citometría de flujo en el diagnóstico y seguimiento clínico hasta evaluar la respuesta de la quimioterapia (como LSC residual puede causar recaída AML). La presencia de LSC puede indicar positivo enfermedad residual mínima (Milirutherford). Hasta la fecha, MRD monitoreo en AML en su mayoría dependen de métodos moleculares (es decir, RT-PCR, NGS)10,12. Sin embargo, en este protocolo se detecta expresión de la proteína simultáneo de varios marcadores HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) en las células primarias de la ráfaga de AML humano por citometría de flujo multiparamétrico2,8,9. Esta combinación de anticuerpos que puede ser aplicada en cualquier laboratorio de citometría de flujo estándar y este análisis MRD de flujo es particularmente interesante cuando MRD por reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) no es posible, es decir, si la leucemia específica molecular los marcadores no son detectables en la muestra diagnóstico de AML. Además, este protocolo, es complementario a las técnicas moleculares más sensibles de MRD, como su objetivo es detectar y cuantificar las células progenitoras hematopoyéticas anormales que representa una característica funcional de la célula (figura 3).
Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones hematopoyéticas progenitoras y el compartimiento supuesto de LSC con diferente grado de maduración mediante citometría de flujo con anticuerpos disponibles en la mayoría de los laboratorios clínicos. Además, confirmó la presencia de estos compartimentos celulares en correspondientes paciente-derivado-xenoinjertos (PDX) y en el tratamiento de seguimiento.
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Protocol
Seguimos las normas europeas para el uso de animales para fines científicos. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética local (#3097-2015120414583482v3).
1. preparación de la muestra
- Recoger de la médula (2 mL) de novo de AML en tubos que contienen el ácido etilendiaminotetracético anticoagulante (EDTA) en una concentración de 1,8 mg / mL de médula ósea.
- Realizar separación de Ficoll, una separación del gradiente de densidad para aislar las células mononucleares de eritrocitos y granulocitos, como sigue. Diluir la médula ósea en 3 volúmenes de solución salina buffer fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Cuidadosamente el recubrimiento 1 volumen de Ficoll con 1 volumen de médula diluida. 30 minutos a 300 x g sin freno de la vuelta. Transferir la capa blanca de la capa anteada de células mononucleated en un tubo estéril nuevo.
- Lavar las células dos veces en 10 mL de PBS) y centrifugar a 300 x g durante 5 min, con el fin de eliminar contaminantes componentes del suero.
2. lisis de glóbulos rojos (RBC)
- Añadir 2 mL de tampón de lisis (cloruro de amonio 0,8%) a la celda de pellets, vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
Nota: si es necesario, repita este paso. - Células de lavado en PBS como describieron anteriormente (1.3.).
3. paciente derivados de xenoinjertos.
- Obtener blastocitos de la médula ósea después de la separación de Ficoll y después del agotamiento de los linfocitos mediante Inmunomagnética negativo selección (CD3 de T y CD20 de los linfocitos B). Siga las instrucciones del fabricante.
- Inyectar 5 x 106 células de la ráfaga AML en la vena de la cola de ratones NSG incondicionadas. Utilice un dispositivo de sujeción para facilitar la inyección de la vena de la cola. Mantenga ratones en condiciones convencionales y especialmente bajo condiciones libres de patógenos específicos en todo momento, mediante el uso de jaulas ventiladas individuales y por manipulación bajo campana de flujo laminar. Cada dos semanas, tome 60 μL de sangre por el método de colección submaxilar con un hematocrito capilar. Lugar del tubo capilar en 5 mL redondo tubo inferior. Detener el sangrado aplicando presión suave con una pequeña gasa estéril. Expulse la sangre con una jeringa limpia.
- Añadir 1ml de tampón de lisis e incubar durante 5 minutos. Luego centrifugar a 300 x g durante 5 min lavado con PBS y centrifugre a 300 x g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante, agregar 100 μl PBS con 10% de albúmina sérica bovina (BSA) Mancha con 3 μl anti-humanos CD45 FITC y anti-murino de 1 μl CD45-APC e incube a 4 ° C durante 30 minutos.
- Lavar el precipitado de células dos veces en PBS (2 mL) con 10% de BSA y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Alícuota hasta 1 x 106 células por 100 μl de PBS en tubos de citómetro de flujo.
- Engraftment encuesta cada dos semanas por el análisis del quimerismo de expresión de CD45 (humano y murino) mediante citometría de flujo (figura 2A y B).
- En sacrificio (cuenta de explosión periférica superior a 70% o severos signos clínicos de la enfermedad), recoger células mononucleares de la ráfaga de picado bazo y de médula ósea mediante lavado tibias y fémures con PBS como describieron anteriormente13. Eutanasia a ratones mediante dislocación cervical siguiendo las directrices internacionales.
- Si el sedimento celulares contiene RBC, realizar lisis de glóbulos rojos con tampón de lisis (paso 2.1).
- Pellet de células de lavado dos veces en PBS (2 mL) con 10% de BSA y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Recoger las células y alícuota a 1 x 106 células por 100 μl de PBS en tubos de citómetro de flujo.
4. coloración
- Añadir vortex y anticuerpos conjugados (ver paso 4.2). Incube las células durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Utilice el panel siguiente para primaria humana o PDX muestras de 10 μl de anti-CD36-FITC, 5 μl de anti-CD19-ECD, 5 μl de anti-CD33-PC5.5, 5 μl de anti-CD90-APC, 5 μl de anti-CD34-AA700, 5 μl de anti-CD45RA-APC-H7, 5 μl de anti-CD38-Pacífico azul, 5 μl de anti-CD123-PC7 y 2,5 μl de anti-CD45-KO.
- Retirar los anticuerpos no Unidos lavando las células en 2 mL de PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspenda las células en 450 μl de PBS para análisis cytometric del flujo final.
5. estrategia para el análisis de citometría de flujo que bloquean
- Realizar adquisición de datos (por lo menos 500.000 células) en un citómetro de flujo equipado con láser rojo, azul y violeta. Compruebe la configuración de citómetro cada día 1) óptico de la alineación, 2) fluídico, sensibilidad 3) óptico, y 4) normalización utilizando fluorospheres
- Seguir la estrategia bloquea alternativamente para definir la expresión de CD38 (figura 1).
- Utilizan células de médula ósea normal muestras para definir hematogones o células plasmáticas que servirá como control positivo para la expresión de CD38.
Nota: esta puerta es especialmente importante evaluar como poblaciones de LSC supuestas posteriores dependen de su definición. - Definir células precursores fisiológicos (blastocitos normales) por criterios de población CD45dim/SSC (dispersión lateral) (figura 1A). Dentro de esta población de la ráfaga, definir hematogones, que muestran un CD38 ++ fenotipo CD19 + (figura 1B) y por último, expresión de CD36 y CD33 para definir los monoblasts y mieloblastos y eritroblastos (figura 1). Determinar la expresión de CD34 en hematogones como se muestra en la (Figura 1E). Evaluar varias subpoblaciones de precursores dentro de las células de la ráfaga definidas como P6-P10 (figura 1). Separar el compartimiento de CD34 de células de la ráfaga en P6, P7, P8 subpoblaciones de progenitor basadas en puertas de CD38 preestablecidos. Asegúrese de que el compartimiento P8 contiene las ráfagas que tienen la misma intensidad de CD38 como los hematogones, que P6 incluye células CD38-basado en la fluorescencia de CD38 menos uno control (FMO) y que P7 células entre los dos extremos en relación con CD38 expresión (figura 1).
- Utilizan células de médula ósea normal muestras para definir hematogones o células plasmáticas que servirá como control positivo para la expresión de CD38.
- El CD34 + 38-(P6) células cerradas, separar HSC LSC putativo con expresión CD90 y CD45RA (Figura 1F).
Nota: el fenotipo HSC es CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- y los progenitores multipotentes (MPP) se definen como CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. El fenotipo LSC putativo es CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + y la población aguas abajo más inmadura son los progenitores linfoides preparado (LMPP) definidos como CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. monitoreo por RT-PCR de MRD
- Controlar los niveles de MRD por RT-PCR como se describió anteriormente14.
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Representative Results
Aquí presentamos un método para determinar las poblaciones progenitoras en muestras de médula ósea de humanos normales y malignas. Recogió la médula ósea y el bazo de un éxito PDX y realizar citometría de flujo multiparamétrico, como se describe anteriormente. Se compararon varias subpoblaciones de células de la ráfaga entre la muestra del paciente diagnóstico y PDX correspondiente y particularmente, el compartimiento del progenitor de CD34 + CD38, notablemente enriquecidas en LSC putativo. Hemos encontrado que la fracción CD34 + CD38-blast fue mayor en PDX en comparación con la muestra del paciente diagnóstico (3,48% vs 0,53%, figura 2, D). Curiosamente, encontramos un mayor porcentaje de LSC putativo (mostrando un CD34 + CD38-CD90-fenotipo CD45RA +) en el PDX en comparación con la muestra del paciente primaria (2,76% frente al 0,48%, Figura 2E, F), lo que sugiere un posible enriquecimiento de malo células progenitoras en los tejidos hematológicos en este modelo de ratón. La frecuencia de las fracciones de células progenitoras normales no difirió entre lo PDX y la muestra del paciente.
Además, estudiamos las poblaciones progenitoras de explosión celular basadas en la expresión de CD34, CD38, CD90 y CD45A (como se describe en este protocolo) en dos diferentes muestras de pacientes, al diagnóstico y al seguimiento del tratamiento para determinar el nivel de MRD. En el primer paciente, la CD34 + CD38-fracción (P6) aumentó de 0,06% en el diagnóstico a 3.33% en el primer seguimiento de tratamiento (Figura 3A, B). En contraste, la CD34 + CD38-fracción (P6) disminuyó en el segundo paciente de 7,8% en el diagnóstico a 2.27% en el primer seguimiento de tratamiento (figura 3 C, D). En consecuencia, la supuesta fracción LSC aumentaron en el primer paciente de 0% en el diagnóstico a 0.65% (Figura 3A', B') y disminuyó en el segundo paciente de 6,57% en el diagnóstico al 1,44% en el seguimiento del tratamiento (figura 3 ', D'). Asimismo, MRD seguimiento por marcadores moleculares (por ejemplo, mutación de la NPM1 [primer paciente] y CBFB-MYH11 desplazamiento [segundo paciente]) demostraron que MRD molecular disminuye menos en el primer paciente (0,8%) en comparación con el segundo paciente (0.05%) para el tratamiento primera punto de seguimiento (figura 3E, G). Por último, para validar que supuesta P6 LSC son malignos, expresión de la leucemia asociada antígenos CD123 y CD33 se estimaron que muestra anormal expresión de CD33 de ambos pacientes (figura 3F, G).
Figura 1 : Compuerta estrategia utiliza para precursores fisiológicos y AML ráfagas. Densidad trama con gating de precursores fisiológicas por una médula ósea normal. (A) Gating de blastocitos basada en fenotipo de CD45dimSSClow en todas las células mononucleated. (B) Gating de hematogones (CD38 + CD19 +) para la verificación de la positividad de CD38. (C). estrategia de monoblasts, normales mieloblastos y eritroblastos que bloquean basado en CD33 y CD36. (D) células de la ráfaga se puede dividir en subpoblaciones de progenitor de CD34 + y con la expresión de CD38 en P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) compartimentos de la célula. (E) Gating de hematogones basado en expresión de CD34 y CD38, verificar la positividad de CD38. (G) determinación de HSC, MPP, LMPP y supuestas subpoblaciones de LSC con expresión de CD90 y CD45RA anteriormente describen9. De la nota, no detección de la LSC ya que esto es una muestra de médula ósea normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Poblaciones de progenitoras de explosión de la célula en un paciente y en correspondiente paciente-derivado-xenoinjerto (PDX) mediante citometría de flujo multiparamétrico. (A-B) Análisis de quimerismo de PDX. (A) murino y humanas ráfagas se definen primero por su tamaño y estructura (FSC, SSC). (B) posteriormente, el porcentaje de humanos versus murino CD45 coloración es indicativo de carga xenoengraftment y leucemia. Comparación de CD34 + CD38-blast células porcentaje entre diagnóstico primario (C) y (D) PDX AML muestra. Comparación de supuestos LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) entre la LMA primaria (E) y (F) PDX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Poblaciones de explosión de la célula progenitora en dos pacientes en la diagnosis y después de la terapia de inducción de remisión para la detección de enfermedad residual mínima (Milirutherford). Flujo cytometric análisis de subpoblaciones de células CD34 + CD38-explosión en dos pacientes representativos (A, C) en el diagnóstico y (B, D) después de la terapia de inducción de remisión. Figuras (A'-D') ilustran las respectivas puertas de P6 que contiene supuesto LSC para los dos pacientes en la diagnosis y después del tratamiento inicial. Se muestra en (E, G) es el análisis de enfermedad residual mínima (Milirutherford) por marcadores moleculares utilizados para estos dos pacientes durante un período de cinco meses (NPM1 mutación y fusión del gene de CBFß-MYH11, respectivamente). (F, G) Expresión de leucemia había asociado antígenos CD123 y CD33 en supuesta LSC P6, mostrando anormal expresión de CD33 de ambos pacientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una evaluación precisa y reproducible de membrana o marcadores citoplasmáticos por citometría de flujo requiere que opciones se verifican cada día para la alineación óptica, buen funcionamiento del sistema neumático, sensibilidad óptica y normalización con perlas de calibración.
Detección de poblaciones celulares de la ráfaga en AML mediante análisis de citometría de flujo multi-paramétricos CD90 y CD45RA es un método relativamente simple y confiable. Un paso fundamental en este análisis es una evaluación precisa de la expresión de CD38 en las células de la ráfaga, con el fin de realizar el correcto control de la población CD34 + CD38. Intensidad de CD38 se define usando las células de la médula ósea normal en hematogones o células plasmáticas (CD38 +). Intensidad de otros marcadores se determina mediante los controles de isotipo.
La adición de CD45RA y CD90 se utiliza para distinguir HSC de LSC putativo. El último y no HSC tal vez la causa de la recaída de la enfermedad, por lo tanto este protocolo es de interés para enfermedad residual mínima monitorización mediante paneles de citometría de flujo. Control de esta afección durante el tratamiento es esencial para mejorar la estratificación del riesgo y para guiar la terapia AML. Por desgracia, marcadores moleculares adecuados no están disponibles para todos los pacientes. Por lo tanto, puede ser factible en todos los casos AML MRD monitoreo mediante citometría de flujo. Aunque este método no puede ser exhaustivo como focalizes en la mayoría de los casos AML que tienen un progenitor de CD34 + CD38 y una supuesta población de LSC. De nota, es posible que el compartimiento supuesto de LSC puede incluir progenitores normales, es decir, LMPP). Además, no podemos descartar que hay casos raros con LSC funcional no sigue este patrón de expresión anormal. De nota, incluso en AML NPM1 mutado que son CD34 negativas, que son capaces de detectar supuesto LSC. Por lo tanto, a pesar de la heterogeneidad y complejidad del compartimiento del LSC AML, nuestro método puede utilizarse como un biomarcador de la respuesta de la quimioterapia durante el seguimiento de esta afección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el francés Asociación Laurette Fugain, LigueContre le cáncer (centro norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e Instituto Nacional del cáncer francés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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