Summary
Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.
Abstract
Leucemia mieloide aguda (LMA) é uma heterogênea e se não tratada, a doença fatal. É a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia em adultos. Inicialmente, LMA é uma doença das células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de células de leucemia blast e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Heterogeneidade que se estende para a presença de células-tronco leucemia (LSC), com esta dinâmica celular compartimento evoluindo para superar várias pressões de seleção imposta durante o tratamento e a progressão de leucemia. Para definir ainda mais a população do LSC, a adição de CD90 e CD45RA permite a discriminação dos linfócitos normais e progenitoras multipotentes dentro do compartimento de células CD34 + CD38. Aqui, nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de vários marcadores LSC putativos (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico. Além disso, mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts. Este método de deteção e quantificação da LSC putativa podem ser utilizados para o acompanhamento clínico da resposta de quimioterapia (i. e., doença residual mínima), como LSC residual pode causar recidiva da LMA.
Introduction
Leucemia mieloide aguda (LMA) é a causa mais comum de mortalidade associada a leucemia. Inicialmente, a AML é uma doença clonal de células-tronco hematopoiéticas (HSC) caracteriza-se pela detenção de diferenciação, subsequente acúmulo de blastos e reduziu a produção de elementos funcionais hematopoiéticas. Recentemente, clonal heterogeneidade da população celular explosão estabeleceu essencialmente usando estratégias de sequenciamento (NGS) na próxima geração e demonstrar a existência de evolução intra clonal de células de tumor1.
Heterogeneidade estende-se à presença de células leucêmicas (LSC). Supor que este compartimento celular dinâmico evolui para superar várias pressões de seleção impostas durante o tratamento e a progressão de leucemia. Portanto, LSC são suposto ser resistente aos regimes quimioterápicos atuais e mediar a recaída da doença, com profundas implicações clínicas2. Vários marcadores têm sido descritos para caracterizar LSC como CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-36. O CD34 + CD38-compartimento de blastos é considerado para ser enriquecido para LSC7 mas também inclui o HSC normal. CD90 e CD45RA expressão aplicada para o CD34 + CD38-compartimento (P6) (Figura 1) permite segregar os vários estágios de precursores hematopoiéticos normais e malignas8. Especificamente, normais CD34 + CD38-CD45RA + CD90-linfócitos, multipotentes progenitores (MPP) como as células CD34 + CD38-CD90dimCD45RA e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + células progenitoras multipotentes linfoides-carregado (LMPP) podem ser determinadas na maioria dos AML casos8 ,9. A intensidade de fluorescência média (IFM) do CD38 é particularmente importante a ser considerado dentro do compartimento de células CD34 +. Porque CD38 intensidade define três compartimentos celulares novo respectivas: CD38 negativo (P6), CD38 ofuscante (P7) e brilhante CD38 (P8) (Figura 1). O IFM de CD38 podem ser determinadas usando hematogones e/ou células de plasma como um controle interno positivo, como estas células expressam fortemente CD38.
O modelo do ratonula (NSG) NOD/SCID/IL2Rγc imunodeficientes é amplamente utilizado para enxertia de normal e hematopoiético maligno humanos células10,11. Ensaios de Xenoenxerto serial são usados para validar experimentalmente LSC ou HSC função. Estes estudos foram analisados extensivamente por abordagens de sequenciamento em larga escala. No entanto, menos é sabido sobre a LSC e HSC imunofenótipo de população de explosão AML incorporada em camundongos NSG comparados com sua LMA primária (Figura 2).
Os números da LSC são inerentemente baixos assim, identificação e quantificação da LSC são desafiadores e o método descrito aqui pode ser usado como um ensaio de cytometric do fluxo, no diagnóstico e no acompanhamento clínico para avaliar a resposta de quimioterapia (como LSC residual pode causa recidiva da LMA). A presença de LSC pode indicar doença residual mínima positiva (MRD). Até à data, MRD monitoramento principalmente na LMA dependem de métodos moleculares (i.e., RT-PCR, NGS)10,12. No entanto, neste protocolo detectarmos expressão de proteínas simultâneo de vários marcadores HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) em células de explosão primárias da LMA humana por citometria de fluxo Multiparamétrico2,8,9. Esta combinação de anticorpos pode ser aplicada em qualquer laboratório de citometria de fluxo padrão e este ensaio do MRD de fluxo é particularmente interessante quando MRD por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) não é possível, ou seja, se moleculares específicos de leucemia marcadores não são detectáveis na amostra de LMA de diagnóstico. Além disso, este protocolo, é complementar as técnicas mais sensíveis de MRD moleculares, vez que visa detectar e quantificar as células progenitoras hematopoiéticas anormal que representa uma característica funcional da célula (Figura 3).
Nós mostramos como quantificar a três populações de progenitoras hematopoiéticas e o compartimento de LSC putativo com diferentes graus de maturação por citometria de fluxo com anticorpos disponíveis na maioria dos laboratórios clínicos. Além disso, nós confirmou a presença desses compartimentos celulares no correspondentes paciente-derivada-xenografts (PDX) e no tratamento de acompanhamento.
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Protocol
Seguimos padrões europeus para a utilização de animais para fins científicos. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local (#3097-2015120414583482v3).
1. preparação da amostra
- Colete a medula óssea (2 mL) de novo de LMA em tubos contendo o ácido etilenodiaminotetracético anticoagulante (EDTA) em uma concentração de 1,8 mg / mL de medula óssea.
- Execute Ficoll, separação uma densidade gradiente para isolar células mononucleares de eritrócitos e granulócitos, como se segue. Diluir a medula óssea em 3 volumes de solução salina de tampão fosfato (PBS: NaCl 137 mM KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10mm, KH2PO4 1,8 mM). Cuidadosamente sobreposição de 1 volume de Ficoll com 1 volume de diluídos da medula óssea. Rotação de 30 minutos a 300 x g sem freio. Transferi a camada de jaleco branco buffy de células mononucleadas em um tubo estéril de novo.
- Lavar as células duas vezes em 10 mL de PBS) e centrifugar a 300 x g, durante 5 min, a fim de remover contaminantes componentes do soro.
2. lise dos glóbulos vermelhos (RBC)
- Adicionar 2 mL de tampão de lise (0,8% de cloreto de amônio) para a célula de Pelotas, vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente por 5 min. centrifugar a 300 x g durante 5 min.
Nota: se necessário, repita este passo. - Células de lavagem em PBS como descrito anteriormente (1.3.).
3. o paciente derivada xenografts.
- Obter a explosão células da medula óssea após a separação de Ficoll e após depleção de linfócitos usando Fima negativo seleção (CD3 para T- e CD20 de linfócitos B). Siga as instruções do fabricante.
- 5 x 106 AML blastos Injete na veia da cauda de ratos NSG incondicionadas. Use um dispositivo de restrição para facilitar a injeção de veia da cauda. Manter ratos em condições convencionais e especialmente sob condições específicas do patógeno-livre em todos os vezes, usando gaiolas individuais de ventilada e manipulação sob capa de fluxo laminar. Cada duas semanas, leva 60 µ l de sangue pelo método submandibular coleção usando um hematócrito capilar. Lugar do capilar em um 5 mL tubo de fundo redondo. Pare o sangramento aplicando pressão suave, usando uma pequena gaze estéril. Eliminar sangue com uma seringa limpa.
- Adicionar 1ml de tampão de Lise e incubar durante 5min. Em seguida centrifugar a 300 x g, durante 5 min. lavagem com PBS e centrifugre a 300 x g durante 5 minutos. Remover o sobrenadante, a adicionar 100 µ l PBS com 10% albumina de soro bovino (BSA) mancha com 3 µ l ser anti-humano CD45-FITC e anti-murino 1 µ l CD45-APC e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
- Centrifugado de lavar duas vezes em PBS (2 mL) com 10% de BSA e centrifugar 300 x g por 5 min.
- Alíquota até a 1 x 106 células por 100 µ l de PBS para tubos de citometria de fluxo.
- Enxertia de pesquisa a cada duas semanas por análise de quimerismo de expressão de CD45 (humano contra murino) usando citometria de fluxo (Figura 2A e B).
- Sacrifício (contagem periférica de explosão maior que 70% ou graves sinais clínicos de doença), coletar células mononucleares de explosão de baços esmagados e da medula óssea por rubor tíbias e fêmures com PBS como descrito anteriormente13. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical, seguindo diretrizes internacionais.
- Se centrifugado contém RBC, realize a Lise das células vermelhas do sangue com tampão de lise (passo 2.1).
- Pellet de células de lavar duas vezes em PBS (2 mL) com 10% de BSA e centrifugar 300 x g por 5 minutos.
- Colete células e alíquota acima de 1 x 106 células por 100 µ l de PBS em tubos de citometria de fluxo.
4. coloração
- Adicione o vórtice e anticorpos conjugados (ver passo 4.2). Incube as células durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente.
- Use o painel seguinte para humana primária ou amostras PDX, consistindo de 10 µ l de anti-CD36-FITC, 5 µ l de anti-CD19-ECD, 5 µ l de anti-CD33-PC5.5, 5 µ l de anti-CD90-APC, 5 µ l de anti-CD34-AA700, 5 µ l de anti-CD45RA-APC-H7, 5 µ l de anti-CD38-Pacific Blue, 5 µ l de anti-CD123-PC7 e 2,5 µ l de anti-CD45-KO.
- Remova anticorpos desacoplados lavando as células em 2 mL de PBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min.
- Ressuspender as células em 450 µ l de PBS para análise de final fluxo cytometric.
5. gating estratégia para análise de citometria de fluxo
- Realize a aquisição de dados (pelo menos 500.000 células) em um citômetro de fluxo equipado com lasers vermelhos, azuis e violetas. Verifique as configurações de citômetro diariamente para alinhamento 1) óptico, sistema 2) fluídico, sensibilidade 3) óptica e 4) padronização usando fluorospheres
- Siga a estratégia associada sequencial para definir a expressão de CD38 (Figura 1).
- Use células de amostras normais da medula óssea para definir hematogones ou células plasmáticas, que servirá como controle positivo para a expressão de CD38.
Nota: este portal é especialmente importante para avaliar como populações de LSC putativos subsequentes dependem de sua definição. - Defina células precursores fisiológica (normais blastos) pelos critérios de população de baixa CD45dim/SSC (dispersão lateral) (figura 1A). Dentro dessa população de explosão, definir hematogones, que exibem uma CD38 + + CD19 + fenótipo (figura 1B) e finalmente, usar expressão CD36 e CD33 definir mieloblastos e monoblastos eritroblastos (Figura 1). Determine a expressão de CD34 na hematogones como mostra a (Figura 1E). Avalie várias subpopulações de precursores dentro os blastos definidos como P6-P10 (Figura 1). Separe o compartimento de CD34 de blastos em P6, P7, P8 subpopulações de progenitor baseadas na predefinição gates CD38. Certifique-se de que o compartimento P8 contém as explosões que têm a mesma intensidade de CD38 como o hematogones, que P6 inclui células que são CD38-baseado na fluorescência CD38 menos um controle (FMO) e que as células de P7 são entre os dois extremos no que se refere a CD38 expressão (Figura 1).
- Use células de amostras normais da medula óssea para definir hematogones ou células plasmáticas, que servirá como controle positivo para a expressão de CD38.
- O CD34 + 38-(P6) células gated, separar HSC LSC putativa usando CD90 e CD45RA expressão (Figura 1F).
Nota: o fenótipo HSC é CD34 + CD38-CD45RA + CD90- e os progenitores multipotentes (MPP) são definidos como CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. O fenótipo LSC putativo é CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + e a população a jusante mais imatura são os progenitores linfoides-carregado (LMPP) definidos como CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD monitoramento por RT-PCR
- Monitorar níveis MRD por RT-PCR, conforme descrito anteriormente,14.
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Representative Results
Aqui nós apresentamos um método para determinar as populações do progenitor em amostras de medula óssea humana normal e maligno. Nós coletadas da medula óssea e baço de um bem sucedido PDX e realizada citometria de fluxo Multiparamétrico conforme descrito acima. Nós comparamos várias subpopulações de blastos entre amostra do diagnóstica do paciente e o correspondente PDX e particularmente, o compartimento de CD34 + CD38-progenitoras, notavelmente enriquecidos no LSC putativa. Achamos que a fração de CD34 + CD38-explosão foi maior em PDX em comparação com a amostra do paciente diagnóstica (3,48% vs 0,53%, Figura 2, D). Curiosamente, encontramos um percentual maior de putativo LSC (exibindo um CD34 + CD38-CD90-CD45RA + fenótipo) no PDX em comparação com a amostra de paciente primária (2,76% vs 0,48%, Figura 2E, F), o que sugere um possível enriquecimento do maligno células progenitoras hematológicas tecidos neste modelo do rato. A frequência de frações de células progenitoras normais não diferiu entre o PDX e amostra do paciente.
Além disso, estudamos as populações de explosão célula progenitora baseadas na expressão de CD34, CD38, CD90 e CD45A (conforme descrito neste protocolo) em duas amostras diferentes, no diagnóstico e no acompanhamento do tratamento para determinar o nível de MRD. No primeiro paciente, o CD34 + CD38-fração (P6) aumentou de 0,06%, para diagnóstico de 3,33% para o primeiro seguimento de tratamento (Figura 3A, B). Em contraste, o CD34 + CD38-fração (P6) diminuiu no segundo paciente de 7,8% no diagnóstico de 2,27% para o primeiro seguimento de tratamento (Figura 3 C, D). Nesse sentido, a fração LSC putativa aumentou no primeiro paciente de 0% no diagnóstico de 0,65% (Figura 3A', B') e diminuiu no segundo paciente de 6.57% no diagnóstico de 1,44% no seguimento de tratamento (Figura 3 ', D'). Da mesma forma, MRD monitoramento por marcadores moleculares (ou seja, mutação do NPM1 [primeiro paciente] e translocação CBFB-MYH11 [segundo paciente]) mostraram que MRD molecular diminuir menos no primeiro paciente (0,8%) em comparação com o segundo paciente (0.05%) para o primeiro tratamento Follow-up ponto (Figura 3E, G). Finalmente, para validar que o putativo P6 LSC são malignos, expressão de leucemia associada antígenos CD123 e CD33 foram estimados, mostrando a expressão anormal de CD33 para ambos os pacientes (Figura 3F, G).
Figura 1 : Gating estratégia usada para precursores fisiológicas e AML blastos. Densidade de trama com retenção de precursores fisiológicas mostradas por uma medula óssea normal. (A) Gating de blastos com base no fenótipo CD45dimSSClow em todas as células mononucleadas. (B) Gating de hematogones (CD38 + CD19 +) para verificação de CD38 positividade. (C). Gating estratégia de mieloblastos normais, monoblastos e eritroblastos baseado no CD33 e CD36. (D) blastos pode ser separado em subpopulações de progenitoras CD34 + e usando a expressão de CD38 em P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) compartimentos de células. (E) Gating de hematogones com base na expressão de CD34 e CD38, verificar CD38 positividade. (G) determinação de HSC, MPP, LMPP e subpopulações de LSC putativos usando a expressão do CD90 e CD45RA como anteriormente descreveram9. De nota, sem detecção de LSC como isto é uma amostra de medula normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Populações de progenitor cell explosão em um paciente e no correspondente paciente-derivada-enxerto heterólogo (PDX) por citometria de fluxo Multiparamétrico. (A-B) Análise de quimerismo de PDX. (A) murino e humanos explosões primeiro são definidos pelo tamanho e estrutura (FSC, SSC). (B) posteriormente, a percentagem de humano contra murino CD45 coloração é indicativa de carga xenoengraftment e leucemia. Comparação de CD34 + CD38-explosão células percentagem entre diagnóstico principal (C) e (D) PDX AML exemplo. Comparação da LSC putativa (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) entre LMA primária (E) e (F) PDX. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Populações de explosão célula progenitora em dois pacientes no diagnóstico e após a terapia de indução de remissão para a deteção de doença residual mínima (MRD). Fluxo cytometric análise de subpopulações de células CD34 + CD38-explosão em dois pacientes representante (A, C) em diagnóstico e (B, D) após a terapia de indução de remissão. Figuras (A'-D') ilustram as respectivas portas de P6 contendo LSC putativa para os dois pacientes no momento do diagnóstico e após o tratamento inicial. Mostrado em (E, G) é a análise de doença residual mínima (MRD) por marcadores moleculares utilizados para estes dois pacientes durante um período de cinco meses (NPM1 mutação e fusão de gene CBFß-MYH11, respectivamente). (F, G) Expressão de leucemia associada antígenos CD123 e CD33 na LSC de P6 putativo, mostrando a expressão anormal de CD33 para ambos os pacientes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma avaliação precisa e reprodutível de membrana ou marcadores citoplasmáticos por citometria de fluxo requer que os ajustes do instrumento são verificados todos os dias para alinhamento óptico, adequado funcionamento do sistema fluídico, sensibilidade óptica e padronização usando contas de calibração.
Detecção de populações de células de explosão na LMA CD90 e CD45RA usando análise de citometria de fluxo multi paramétrico é um método relativamente simples e confiável. Um passo crítico nesta análise é uma avaliação correcta da expressão de CD38 em blastos, para realizar a correta retenção de CD34 + CD38-população. Intensidade de CD38 é definida usando células normais da medula óssea especificamente em hematogones e/ou células plasmáticas (CD38 +). Intensidade de outros marcadores é determinada usando controles isotype.
A adição de CD45RA e CD90 é usada para distinguir HSC putativa LSC. O último e talvez HSC não a causa de recidiva da doença, assim, o presente protocolo é de interesse para doença residual mínima monitoramento usando painéis de citometria de fluxo. Monitoração da LMA durante o tratamento é essencial para melhorar a estratificação de risco e para orientar a terapia de LMA. Infelizmente, marcadores moleculares adequados não estão disponíveis para todos os pacientes. Portanto, MRD monitoramento por citometria de fluxo pode ser viável para todos os casos de LMA. Mesmo que esse método não pode ser exaustivo como ele focalizes na maioria dos casos de LMA, que têm um progenitor CD34 + CD38- e uma população de LSC putativa. Digno de nota, é possível que o compartimento de LSC putativo pode incluir progenitores normais, ou seja, LMPP). Além disso, não podemos descartar que existem casos raros na LSC funcional não seguir este padrão de expressão anormal. Digno de nota, mesmo na LMA NPM1-mutação que são considerados CD34 negativos, somos capazes de detectar putativa LSC. Portanto, apesar da heterogeneidade e complexidade do compartimento AML LSC, nosso método pode ser usado como um biomarcador de resposta de quimioterapia durante o acompanhamento da LMA.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo francês Associação Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centro Norte), Fondation de France (Comité de leucemia), Oncolille SIRIC e francês National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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