Summary
フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。
Abstract
急性骨髄性白血病 (AML) は異質と致命的な病気を治療されていない場合。成人の白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) の病気差別化、爆発性白血病細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血の機能要素の生産量が減少します。不均一性白血病幹細胞 (LSC) の存在まで、この動的セル白血病の進行と治療中に課せコンパートメントは様々 な選択圧力を克服するために進化しています。LSC 人口をさらに定義するには、CD90 と CD45RA は cd 34 + CD38-細胞コンパートメント内正常造血多能性前駆細胞の差別をことができます。ここでは、多重フローサイトメトリーを用いたヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞にいくつかの推定 LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現を検出するためのプロトコルをまとめました。さらに、3 つの前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC 人口を定量化する方法を示します。対応する患者-派生-異種移植片におけるこれらの個体群の存在を確認しました。検出のこのメソッドおよび推定 LSC の定量化が化学療法応答の臨床フォロー アップに使用する (すなわち。、微少残存病変)、残留 LSC は急性骨髄性白血病再発を引き起こす可能性があります。
Introduction
急性骨髄性白血病 (AML) は、白血病による死亡の最も一般的な原因です。当初、急性骨髄性白血病は造血幹細胞 (HSC) のクローン病分化、ブラスト細胞のそれに続く蓄積の逮捕によって特徴付けられる、造血機能の要素の生産量が減少します。最近では、ブラスト セル人口のクローンの不均一性の設置する本質的にシーケンス (NGS) の次世代戦略を使用して、腫瘍細胞1のクローン内の進化の存在を示します。
白血病幹細胞 (LSC) の存在する不均一性を拡張します。それは、この動的なセル区画は、白血病の進行と治療中に課せられた様々 な選択圧力を克服するために進化する仮定されます。したがって LSC は現在の化学療法レジメンに耐性があるし、深い臨床的意義2病気の再発を仲介になっています。様々 なマーカーは、ティム 36CD975や CLL 14CD1233LSC の特徴に記載されています。ブラスト細胞の cd 34 + CD38-コンパートメント LSC7豊かに言えますが、また通常 HSC が含まれています。Cd 34 + CD38 に適用される CD90 と CD45RA 式-(P6) コンパートメント (図 1) 正常および悪性造血前駆細胞8のいくつかの段階を分離することができます。具体的には、通常 cd 34 + CD38 CD90 + CD45RA HSCs、多能性前駆細胞 (MPP) cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA-細胞など cd 34 + CD38-CD90-CD45RA + リンパ プライミング多能性前駆細胞 (LMPP) 細胞を急性骨髄性白血病の大半として定めることができる場合8 ,9。CD38 の平均蛍光強度 (MFI) は、CD34 陽性細胞コンパートメントの内で考慮することが大切です。CD38 強度その 3 つの新しい細胞のコンパートメントを定義するため: CD38 負 (P6)、CD38 dim (P7) と CD38 明るい (P8) (図 1)。CD38 の MFI は、これらの細胞は強く CD38 を特急として内部の肯定的な制御として hematogones およびプラズマ細胞のいずれかを使用して決定されるかもしれない。
免疫不全の合図/SCID/IL2Rγcnull (NSG) マウス モデルは通常の生着のため広く使用され悪性ひと造血細胞10,11。シリアル異種アッセイは、LSC または HSC 関数の実験的検証に使用されます。これらの研究は、大規模なシーケンスのアプローチによって広範囲に分析されています。それにもかかわらず、以下はその主な急性骨髄性白血病 (図 2) と比較して NSG マウスにしみ込んで AML ブラスト人口の LSC と HSC イムノフェノ タイプについて知られています。
LSC の番号を本質的に低、LSC の同定及び定量化が困難なここで説明する方法は、(残留 LSC として化学療法応答を評価するフローサイトメトリーアッセイ診断、臨床フォローとして使用する場合があります。急性骨髄性白血病再発を引き起こす)。LSC の存在は肯定的な微小残存病変 (MRD) 可能性があります。までに、MRD 分子法 (すなわちRT-PCR、NGS) に依存して急性骨髄性白血病で大抵監視10,12。しかし、このプロトコルでは我々 検出いくつかの HSC/LSC マーカー (CD34、CD38、CD45RA、CD90) の同時発現ヒト急性骨髄性白血病の一次爆発細胞に多重流れ cytometry2,8,9。この抗体の組み合わせ可能性があります任意の標準的な流れ cytometry 研究室で適用してこの流れ MRD の試金は、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) による MRD は不可能、特に興味深いすなわち場合、白血病特有の分子マーカーは、診断のアジア ・ マイル リミテッド サンプルで検出されません。さらに、このプロトコルはより敏感な分子 MRD 技術を補完するものそれは検出し、異常な造血前駆細胞を定量化することを目的として表します機能細胞特性 (図 3)。
臨床検査の大半で使用可能な抗体とフローサイトメトリーによる造血前駆細胞の 3 つの集団と成熟度が異なると推定される LSC コンパートメントを定量化する方法を示します。さらに、対応する患者-派生-異種移植片 (PDX) でこれらの細胞コンパートメントの存在を確認し、治療のフォロー アップ。
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Protocol
我々 は科学的な目的のための動物の使用のためのヨーロッパ規格に従ってください。本研究は、ローカル倫理委員会 (#3097-2015120414583482v3) によって承認されました。
1. サンプル準備
- De novo AML 抗凝固エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む管内から骨髄の mL あたり 1.8 mg の濃度で骨髄 (2 mL) を収集します。
- 続いて、赤血球および顆粒球、単核球を分離する密度勾配分離 Ficoll 分離を実行します。生理食塩水リン酸バッファーの 3 つの容積の骨髄を希釈 (PBS: KH2PO4 Na2HPO4 10 mM, KCl 2.7 mM NaCl 137 mM 1.8 mM)。慎重に希釈した骨髄の 1 ボリュームと Ficoll の 1 ボリュームをオーバーレイします。ブレーキなし 300 x g で 30 分間をスピンします。新しい生殖不能の管に mononucleated 細胞の白いバフィー コート層を転送します。
- 10 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄)、汚染の血清成分を除去するために、5 分間 300 × g で遠心力場します。
2. 赤い血球 (RBC) の換散
- セル換散バッファー (塩化アンモニウム 0.8%) 2 mL を追加ペレット、渦ゆっくりと 5 分間 300 x g で 5 分遠心室温で孵化させなさい。
注: 必要に応じて、この手順を繰り返します。 - 洗浄のセル PBS で前述 (1.3)。
3. 患者は、異種移植片を派生しました。
- Ficoll 分離後骨髄から細胞を入手し、負の選択を使用して免疫リンパ球枯渇後 (T および B リンパ球の CD20 用 CD3)。製造元の指示に従ってください。
- 5 x 106急性骨髄性白血病細胞を無条件の NSG マウスの尾静脈に注入します。拘束デバイスを使用して、容易に尾静脈注射。回、個別換気ケージを使用して、層流フードの下で操作まったく従来条件の下で、特に特定病原体フリーの条件の下でマウスを維持します。2 週間ごとに、キャピラリー ヘマトクリット値を用いた顎下コレクションによる血液の 60 μ L を取る。5 mL にキャピラリー丸い底部チューブ。小さな滅菌ガーゼのパッドを使用して穏やかな圧力を適用することで、出血を停止します。きれいな注射器で血を Expulse。
- 1 ml の溶解バッファーを追加し、5 分間インキュベートします。300 x g で 5 分間 PBS と 300 x g で centrifugre で洗うで 5 分間遠心します。上清、3 μ L 抗ひと CD45 FITC と 1 μ L 抗マウス 10% ウシ血清アルブミン (BSA) 染色で追加 100 μ L の PBS を除去 CD45 APC と 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
- 10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) の 2 回細胞ペレットを洗ってください。
- 流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の6セルの分注までは。
- 調査生着させるキメリズム解析による 2 週間ごと (人間対マウス) CD45 表現は、フローサイトメトリー (図 2 a および B) を使用しています。
- 犠牲 (周辺爆発数 70% または病気の重篤な臨床症状を超える) で収集単核細胞砕いた脾臓や骨髄から脛骨をフラッシュすることによってし、PBS で大腿骨前述した13。国際ガイドラインに従う頚部転位によってマウスを安楽死させます。
- 細胞ペレットには、赤血球が含まれている場合、は、換散バッファー (ステップ 2.1) と赤の血液細胞の換散を実行します。
- 2 回 10 %bsa と 300 × g で 5 分間遠心する PBS (2 mL) で洗浄細胞ペレット。
- 流れ cytometry チューブに 100 μ L の PBS あたり 1 x 10 の6セルにセルと分注までを収集します。
4. 染色
- (ステップ 4.2 を参照) に活用された抗体と渦を追加します。室温で暗闇の中で 15 分間インキュベート細胞。
- 人間プライマリまたは PDX サンプルから成る抗 CD36 FITC の 10 μ L, 抗 CD19 ECD の 5 μ L、5 μ L 抗 CD33 PC5.5 のアンチ CD90 APC の 5 μ L、5 μ L 抗 CD34 AA700、アンチ CD45RA-APC h7 5 μ L、5 μ L 抗 CD38 パシフィック ブルー、5 μ L の次のパネルを使用します。アンチ CD123 PC7 と 2.5 μ L 抗 CD45 KO の。
- 5 分間 300 × g で遠心分離で 2 mL の PBS のセルを洗浄することにより非連結抗体を削除します。
- 再最終フローサイトメトリーによる解析の 450 μ L の PBS のセルを中断します。
5. ゲート フローサイトメトリー解析のための戦略
- 赤、青、バイオレット レーザーを搭載したフローサイトでデータ集録 (少なくとも 500,000 細胞) を実行します。1) 光学アライメント、2) 流体システム、3) 光感度で、4) fluorospheres を使用して標準化に毎日の cytometer 設定を確認します。
- CD38 式 (図 1) を定義するシーケンシャル ゲート戦略に従います。
- 通常骨髄由来細胞を使用して、hematogones または CD38 表現のための肯定的な制御となるプラズマ細胞を定義します。
注: この門は、その定義に依存する後続の推定 LSC 集団として評価するために特に重要です。 - CD45dim/SSC (側方散乱) 低人口基準 (図 1 a) 生理学的前駆体細胞 (通常ブラスト細胞) を定義します。このブラスト集団内で、CD38 を表示する hematogones を定義 + + cd19 表現型 (図 1 b) CD36 および CD33 の式を使用して最後に、生し、monoblasts、および赤芽球 (図 1) を定義します。(図 1E) に示すように、hematogones の CD34 式を決定します。P6 P10 (図 1) として定義されているブラスト細胞内で前駆体のいくつかの集団を評価します。P6、P7, P8 前駆細胞集団に基づいてプリセット CD38 ゲートにブラスト細胞 CD34 コンパートメントを分けます。P8 のコンパートメントに P6 が 1 つ (FMO) コントロール マイナス CD38 蛍光に基づいて CD38 細胞には含まれている、hematogones として同じ CD38 強さを持って爆発が含まれていること、および P7 細胞 CD38 に関して 2 つの両極端の間を保証します。式 (図 1)。
- 通常骨髄由来細胞を使用して、hematogones または CD38 表現のための肯定的な制御となるプラズマ細胞を定義します。
- CD34 + 38 - (P6) からゲートの細胞は CD90 と CD45RA 式 (図 1 f) を使用して推定 LSC から HSC を区切ります。
注: HSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90 CD45RA +- と多能性前駆細胞 (MPP)、cd 34 + CD38-CD90 - CD45RA-。推定 LSC 表現型は cd 34 + CD38-CD90dimCD45RA + と未熟なダウン ストリーム人口が cd 34 + CD38 として定義されているプライミング リンパ前駆 (LMPP)-CD90-CD45RA +。
6. MRD RT-PCR による監視
- RT-PCR14を前述のように MRD レベルを監視します。
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Representative Results
正常および悪性ひと骨髄サンプルで前駆細胞集団を決定する方法をご紹介します。成功 PDX から骨髄および脾臓を収集し、上記のように多重フローサイトメトリーを実行.ブラスト細胞診断患者検体と対応する PDX cd 34 + CD38-前駆コンパートメントでは特に、特に推定 LSC の濃縮のいくつかの集団を比較しました。PDX 診断患者サンプル (0.53%、図 2、 D対 3.48%) と比較しての cd 34 + CD38-ブラストの割合が高かったことがわかりました。興味深いことに、我々 は推定 LSC の割合が高いを発見した (表示 cd 34 + CD38-CD90-CD45RA + 表現型) PDX (0.48%、図 2 e、 F対 2.76%)、プライマリ患者例と比べると、悪性の可能な濃縮を示唆しています。このマウス モデルにおける血液組織の前駆細胞。通常前駆細胞画分の周波数は、PDX と患者のサンプルとの間に差はなかった。
さらに、診断、治療のフォロー アップは、MRD のレベルを決定する 2 つの異なる患者サンプルで CD34、CD38、CD90、CD45A (このプロトコルで記述されている) としての表現に基づく爆発細胞前駆細胞集団を検討しました。最初の患者、cd 34 + CD38-(P6) 分数診断で 0.06% から最初治療フォロー アップ (図 3 a, B) で 3.33% に増加しました。対照的に、cd 34 + CD38-2.27% (図 3 C、 D) 最初治療フォロー アップ診断で 7.8% から 2 番目の患者の (P6) の割合が減少しました。したがって、推定の LSC 率が 0.65% (図 3 a'、 B') を診断では 0% から最初の患者の増加し、治療フォロー アップ (図 3で 1.44% 6.57% 診断から 2 番目の患者の減少'、 D')。分子マーカーによる監視 MRD 同様に、(すなわち、NPM1 変異 [症例] と転流 CBFB MYH11 [症例 2]) 分子 MRD が最初の治療のため 2 番目の患者 (0.05%) と比較して最初の患者 (0.8%) 以下を減少を示したフォロー アップの点 (図 3E, G)。最後に、推定 P6 LSC が悪性であることを検証するため、白血病の発現は CD123、CD33 を求めた (図 3 f, G) 両方の患者の CD33 の異常発現を示す抗原を関連付けられています。
図 1: 爆発生理的な前駆体と急性骨髄性白血病に使用戦略をゲーティングします。通常骨髄に生理学的前駆体のゲーティング密度プロット。(A) mononucleated のすべてのセルに CD45dimSSClow 表現型に基づく細胞のゲーティング。Hematogones の (B) ゲーティング (CD38 + CD19 +) CD38 陽性の確認のため。(C). CD33 および CD36 に基づいて通常生し、monoblasts、赤芽球の戦略をゲートします。(D) ブラスト細胞 CD34 陽性前駆細胞集団に分けることができます P6 に CD38 表現を使用して、(cd 34 + CD38-)、P7 (CD34 + CD38dim) P8 (cd 34 + CD38 +) 細胞のコンパートメント。Hematogones の (E) ゲーティング CD34 と CD38 の発現、CD38 陽性を確認します。(G) HSC 定量、MPP、LMPP、および前述の CD90 と CD45RA 式を使用して推定の LSC subpopulations9を説明します。注記のうち、この LSC の検出には通常骨髄サンプルはありません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ブラスト細胞前駆細胞集団患者と対応する患者-派生-異種移植 (PDX) 多重フローサイトメトリー 。(A B)PDX のキメリズム解析。(A) マウスと人間爆発最初サイズと構造 (FSC、SSC) によって定義されます。(B) その後、CD45 染色マウスと人間の割合が xenoengraftment と白血病の負担を表しています。Cd 34 + CD38-ブラストの比較細胞 (C) 主診断と (D) PDX AML サンプルの割合です。推定 LSC の比較 (cd 34 + CD38-CD90-CD45RA +) (E) 主要なアジア ・ マイル リミテッドと (F) PDX の間。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 2 人の患者の診断で微小残存病変 (MRD) の検出のための寛解導入療法後にブラスト細胞前駆。寛解導入療法後診断と (B, D) で 2 つの代表的な患者 (A、C) の cd 34 + CD38-ブラスト リンパ球サブポピュレーションのフローサイトメトリーによる解析を流れ。数字 (A'-D') 2 人の患者の診断と初期治療後の推定 LSC を含むそれぞれの P6 ゲートを説明。5 ヶ月の期間にわたってこれらの 2 人の患者に使用される分子マーカーによる微小残存病変 (MRD) 解析は、(E, G) で表示 (NPM1 突然変異と遺伝子の融合を CBFß MYH11、それぞれ)。(F, G)白血病の発現には、CD123、CD33 の両方の患者のための発現異常を示す推定の P6 LSC の CD33 抗原が関連付けられています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
膜やフローサイトメトリーによる細胞質マーカーの正確かつ再現性のある評価は、機器の設定、毎日光配向、流体システム、光感度、標準化の適切な機能を確認が必要です。キャリブレーション ビーズを使用しています。
パラメトリック最適化を用いたフローサイトメトリー法による CD90 と CD45RA を使用して急性骨髄性白血病でブラスト セル人口の検出は、比較的単純で信頼性の高い方法です。この分析の重要なステップは、cd 34 + CD38-人口の正しいゲートを実行するためにブラスト細胞 CD38 表現の正確な評価です。CD38 強度は、具体的には、hematogones および/またはプラズマ細胞 (CD38 +) 正常骨髄細胞を使用して定義されます。他のマーカーの強度は、アイソタイプ コントロールを使用して定められます。
CD45RA と CD90 の追加は、推定 LSC から HSC を区別するために使用されます。後者とない HSC 多分病気再発の原因、従ってこのプロトコルは流れ cytometry パネルを用いた微小残存病変のための興味の。治療中に急性骨髄性白血病の監視リスク層別化を改善するために、急性骨髄性白血病の治療には不可欠です。残念ながら、適切な分子マーカーはすべての患者のためご利用いただけません。したがって、MRD のフローサイトメトリーによる監視が急性骨髄性白血病の場合は可能であります。にもかかわらず、それは cd 34 + CD38-前駆と推定 LSC 人口を持つ急性骨髄性白血病症例の大半で focalizes として、このメソッドを網羅できない場合があります。注記のうち、不可能だと推定される LSC コンパートメントが通常前駆細胞、すなわち、LMPP を含めることができます)。 さらに、我々 はこの異常な表現パターンに従っていない機能 LSC のまれなケースがあることを排除できません。負、cd34 陽性である NPM1 変異 AML でもメモの推定 LSC を検出することがおります。したがって、不均一性、アジア ・ マイル リミテッド LSC 区画の複雑さにもかかわらず本手法を使用急性骨髄性白血病の化学療法応答によるバイオ マーカーのフォロー アップとして可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品の一部、フランス語協会ローレット Fugain、LigueContre ルがん (北センター)、財団・ ド ・ フランス (白血病委員会)、SIRIC Oncolille、フランス国立がん研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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