Summary
Vi skitsere en protokol for at opdage samtidig udtryk for leukæmi stamceller markører på primære akut myeloid leukæmiceller ved flowcytometri. Vi viser hvordan man kan kvantificere tre stamfader befolkninger og en formodede LSC befolkningen med stigende grad af modning. Vi bekræftet tilstedeværelsen af disse befolkningsgrupper i tilsvarende patient-afledt-xenografts.
Abstract
Akut myeloid leukæmi (AML) er en heterogen, og hvis de ikke behandles, dødelig sygdom. Det er den mest almindelige årsag til leukæmi-associerede dødelighed hos voksne. I første omgang er AML en sygdom i hæmatopoietisk stamceller (HSC) karakteriseret ved anholdelsen af differentiering, efterfølgende ophobning af blast leukæmiceller og reduceret produktion af funktionelle hæmatopoietisk elementer. Heterogenitet strækker sig til tilstedeværelsen af leukæmi stamceller (LSC), med denne dynamiske celle rum udvikler sig for at overvinde forskellige udvalg pres, der er pålagt under leukæmi progression og behandling. For yderligere at definere LSC befolkningen, tillader tilsætning af CD90 og CD45RA forskelsbehandling af normale HSCs og Multipotente stamceller inden for CD34 + CD38-celle rum. Her, skitsere vi en protokol for at opdage samtidig udtryk for flere formodede LSC markører (CD34, CD38, CD45RA, CD90) på primære blast celler af human AML ved multiparametric flowcytometri. Derudover viser vi hvordan du kvantificere tre stamfader befolkninger og en formodede LSC befolkningen med stigende grad af modning. Vi bekræftet tilstedeværelsen af disse befolkningsgrupper i tilsvarende patient-afledt-xenografts. Denne metode til påvisning og kvantificering af formodede LSC kan anvendes til klinisk opfølgning af kemoterapi svar (dvs., minimal residual sygdom), som resterende LSC kan forårsage AML tilbagefald.
Introduction
Akut myeloid leukæmi (AML) er den mest almindelige årsag til leukæmi-associerede dødelighed. I første omgang er AML en klonal sygdom af hæmatopoietisk stamceller (HSC) karakteriseret ved anholdelsen af differentiering, efterfølgende ophobning af blast celler, og reduceret produktion af funktionelle hæmatopoietisk elementer. For nylig, klonede heterogenitet af blast celle befolkning er blevet etableret med det væsentlige ved hjælp af næste generation sequencing (NGS) strategier og viser eksistensen af intra klonal evolution af tumor celler1.
Heterogenitet strækker sig til tilstedeværelsen af leukemic stamceller (LSC). Det er en hypotese, denne dynamiske celle rum udvikler sig for at overvinde forskellige udvalg pres pålagt under leukæmi progression og behandling. Derfor LSC formodes at være modstandsdygtige over for aktuelle kemoterapeutiske regimer og mægle sygdom tilbagefald, med dybtgående kliniske konsekvenser2. Forskellige markører er blevet beskrevet til at karakterisere LSC som CD1233, CLL-14, CD975 eller TIM-36. CD34 + CD38-rum af blast celler anses for at være beriget til LSC7 men også omfatter normale HSC. CD90 og CD45RA udtryk anvendes til CD34 + CD38-(P6) rum (figur 1) tillader for at adskille flere stadier af normale, og ondartet hæmatopoietisk prækursorer8. Specifikt, normal CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, Multipotente stamceller (MPP) som CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-celler og CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymfoide-pulverlak Multipotente stamceller (LMPP) celler kan bestemmes i fleste af AML tilfælde8 ,9. Gennemsnitlige fluorescens-intensiteten (MFI) af CD38 er især vigtigt at tages i betragtning inden for den CD34 + celle rum. Fordi CD38 intensitet definerer tre nye celle segmenter heraf: CD38 negativ (P6), CD38 dim (P7) og CD38 lyse (P8) (figur 1). MFI CD38 kan bestemmes ved hjælp af enten hematogones og/eller plasma celler som en indre positiv kontrol, da disse celler kraftigt express CD38.
Immundefekte SCID-NOD-IL2Rγcnull (NSG) musemodel er almindeligt anvendt til engraftment af normal, og ondartet menneskelige hæmatopoietisk celler10,11. Seriel xenotransplantation assays bruges til at validere eksperimentelt LSC eller HSC funktion. Disse undersøgelser er blevet grundigt analyseret af stor skala sekventering metoder. Ikke desto mindre er mindre kendt om LSC og HSC immunophenotype af AML blast befolkning aflægger i NSG mus i forhold til dens primære AML (figur 2).
Antallet af LSC er i sagens natur lav således, identifikation og kvantificering af LSC er udfordrende og metoden beskrevet her kan bruges som en flow cytometric assay på diagnose og kliniske følge at evaluere kemoterapi svar (som resterende LSC kan forårsage AML tilbagefald). Tilstedeværelsen af LSC kan indikere positiv minimal residual sygdom (MRD). Til dato, MRD overvågning i AML hovedsageligt er afhængige af molekylære metoder (dvs., RT-PCR, NGS)10,12. Men i denne protokol vi registrerer samtidige protein udtryk for flere HSC/LSC markører (CD34, CD38, CD45RA, CD90) på primære blast celler af human AML af multiparametric flow flowcytometri2,8,9. Denne kombination af antistoffer kan anvendes i enhver standard flow flowcytometri laboratorium og dette flow MRD assay er særlig interessant, når MRD af real-time Polymerasekædereaktionen (RT-PCR) ikke er muligt, dvs., hvis leukæmi specifikke molekylære markører er ikke kan påvises i den diagnostiske AML prøve. Denne protokol er desuden supplerer de mere følsomme molekylære MRD teknikker, som det har til formål at påvise og bestemme de unormale hæmatopoietisk stamceller som repræsenterer en funktionel celle karakteristik (figur 3).
Vi viser hvordan man kan kvantificere tre hæmatopoietisk stamfader befolkninger og den formodede LSC rum med forskellig grad af modning ved flowcytometri med antistoffer findes i fleste af kliniske laboratorier. Desuden vi bekræftet tilstedeværelsen af disse celle rum i tilsvarende patient-afledt-xenografts (PDX) og på behandling opfølgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi følger europæiske normer for anvendelse af dyr til videnskabelige formål. Denne undersøgelse blev godkendt af det lokale etiske udvalg (#3097-2015120414583482v3).
1. Prøvetilberedning
- Indsamle knoglemarv (2 mL) fra de novo AML i rør indeholdende antikoagulerende ethylendiamintetra syre (EDTA) ved en koncentration på 1,8 mg pr. mL af knoglemarven.
- Udføre Ficoll separation, en befolkningstæthed gradient adskillelse at isolere mononukleære celler fra røde celler og granulocytter, som fulgte. Fortynd knoglemarv i 3 bind af fosfat buffer saltvand (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Omhyggeligt overlay 1 volumen af Ficoll med 1 volumen af fortyndet knoglemarv. Spin 30 minutter ved 300 x g uden bremse. Overføre det hvide buffy coat lag af mononukleære celler ind i en ny steril rør.
- Vaske cellerne to gange i 10 mL PBS) og centrifugeres ved 300 x g i 5 min, for at fjerne forurenende serum komponenter.
2. lysering af røde blodlegemer (RBC)
- Der tilsættes 2 mL af lysisbuffer (ammoniumchlorid 0,8%) til cellen pellet, vortex forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, gentage dette trin. - Vask celler i PBS som tidligere beskrevet (1.3.).
3. patienten afledt xenografts.
- Få blast celler fra knoglemarven efter Ficoll adskillelse og efter lymfocytter nedbrydningen ved hjælp af immunomagnetic negative valg (CD3 for T- og CD20 for B-lymfocytter). Følg producentens anvisninger.
- Indsprøjtes 5 x 106 AML blast celler i halen vene af ubetingede NSG mus. Brug en fastholdende enhed til at lette hale vene injektion. Holde mus konventionelle betingelser og især under specifikt patogenfri betingelser på alle tidspunkter, ved hjælp af individuelle ventileret bure og manipulation under laminar flow hætte. Hver to uger, tage 60 µL af blod af submandibulære indsamlingsmetoden ved hjælp af en hæmatokrit kapillær. Sted kapillær ind i et 5 mL runde nederste rør. Stop bløder ved at anvende blide tryk ved hjælp af en lille steril gaze pad. Expulse blod med en ren sprøjte.
- Der tilsættes 1ml af lysisbuffer og Inkuber i 5min. Derefter centrifugeres ved 300 x g i 5min. Skyl med PBS og centrifugre på 300 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten, Tilføj 100 µL PBS med 10% bovint serumalbumin (BSA) plet med 3 µL anti-menneskelige CD45-FITC og 1 µL anti-murine CD45-APC og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask celle pellet to gange i PBS (2 mL) med 10% BSA og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Alikvot op til 1 x 106 celler pr. 100 µL af PBS i flow flowcytometri rør.
- Oversigt engraftment hver to uger af kimærisme analyse CD45 udtryk (menneskelige versus murine) ved hjælp af flowcytometri (figur 2A og B).
- På offer (perifere blast tæller mere end 70% eller alvorlige kliniske tegn på sygdom), indsamle mononukleære blast celler fra knuste milt og knoglemarv ved rødmen forbenede og lårben med PBS som tidligere beskrevet13. Aflive mus af cervikal dislokation efter internationale retningslinjer.
- Hvis celle pellet indeholder RBC, udføre lysering af røde blodlegemer med lysisbuffer (trin 2.1).
- Vask celler pellet to gange i PBS (2 mL) med 10% BSA og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
- Indsamle celler og alikvot op til 1 x 106 celler pr. 100 µL af PBS i flow flowcytometri rør.
4. farvning
- Tilføje konjugerede antistoffer (Se trin 4.2) og vortex. Inkuber celler i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Brug panelet følgende for menneskelig primær eller PDX prøver bestående af 10 µL af anti-CD36-FITC, 5 µL af anti-CD19-ECD, 5 µL af anti-CD33-PC5.5, 5 µL af anti-CD90-APC, 5 µL anti-CD34-AA700, 5 µL af anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL af anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL af anti-CD123-PC7 og 2,5 µL af anti-CD45-KO.
- Fjerne ubundne antistoffer ved at vaske cellerne i 2 mL PBS ved centrifugering ved 300 x g i 5 min.
- Genopslæmmes celler i 450 µL af PBS for endelige flow cytometric analyse.
5. gating strategi for flow flowcytometri analyse
- Udføre dataopsamling (mindst 500.000 celler) på en flow forskellige udstyret med rød, blå og violet lasere. Kontroller indstillingerne for forskellige hver dag for 1) optisk tilpasningen, 2) fluidic system, 3) optisk følsomhed og 4) standardisering ved hjælp af fluorospheres
- Følg den sekventielle gating strategi for at definere CD38 udtryk (figur 1).
- Bruge celler fra normal knoglemarv prøver for at definere hematogones eller plasmaceller, der vil tjene som positiv kontrol for CD38 udtryk.
Bemærk: denne port er især vigtigt at vurdere som efterfølgende formodede LSC populationer afhænger af sin definition. - Definere fysiologisk prækursorer celler (normal blast celler) ved CD45dim/SSC (side scatter) lav befolkningskriterier (figur 1A). Inden for denne blast befolkning, definere hematogones, som viser en CD38 ++ CD19 + fænotype (figur 1B) og endelig bruge CD36 og CD33 udtryk til at definere leukæmi, monoblasts og erythroblasts (figur 1 c). Bestemme CD34 udtryk på hematogones som vist i (figur 1E). Vurdere flere delpopulationer af prækursorer i blast cellerne defineret som P6-P10 (fig. 1 d). Adskille CD34 rum af blast celler i P6, P7, P8 stamfader delpopulationer baseret på foruddefinerede CD38 gates. Sikre at P8 rum indeholder eksplosionerne, der har den samme CD38 intensitet som hematogones, at P6 indeholder celler, der er CD38-baseret på CD38 fluorescens minus én (FMO) kontrol og at P7 celler er i mellem de to yderpunkter for CD38 udtrykket (fig. 1 d).
- Bruge celler fra normal knoglemarv prøver for at definere hematogones eller plasmaceller, der vil tjene som positiv kontrol for CD38 udtryk.
- Fra CD34 + 38-(P6) separat gated celler, HSC fra formodede LSC bruger CD90 og CD45RA udtryk (figur 1F).
Bemærk: HSC fænotype er CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- og de Multipotente stamceller (MPP) er defineret som CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Den formodede LSC fænotype er CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + og den mere umodne downstream befolkning er lymfoide-pulverlak stamfaderen (LMPP) defineres som CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD overvågning af RT-PCR
- Overvåge MRD niveauer af RT-PCR som beskrevet tidligere14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her vil vi præsentere en metode til at bestemme stamfader populationer i normal, og ondartet menneskelige knoglemarv prøver. Vi har indsamlet knoglemarven og milt fra en vellykket PDX og udført multiparametric flowcytometri, som beskrevet ovenfor. Vi sammenlignede flere delpopulationer af blast celler mellem diagnostiske patient prøven og den tilsvarende PDX og især CD34 + CD38-stamfader rum, især beriget i formodede LSC. Vi har fundet, at CD34 + CD38-blast brøkdel var højere i PDX i forhold til den diagnostiske patienterne prøve (3,48% vs. 0,53%, figur 2 c, D). Interessant, vi fandt en højere procentdel af formodede LSC (viser en CD34 + CD38-CD90-CD45RA + fænotype) i PDX i forhold til den primære patienterne prøve (2,76% vs. 0,48%, figur 2E, F), hvilket tyder på en mulig berigelse af maligne stamceller i hæmatologiske væv i denne musemodel. Hyppigheden af normale stamfader celle fraktioner afviger ikke mellem PDX og patient prøven.
Derudover undersøgte vi blast celle stamfader populationer baseret på udtryk for CD34, CD38, CD90 og CD45A (som beskrevet i denne protokol) i to forskellige patientprøver, diagnose og behandling opfølgning til at fastslå omfanget af MRD. I den første patient, CD34 + CD38-(P6) brøkdel steg fra 0,06% på diagnosetidspunktet til 3,33% efter den første behandling opfølgning (figur 3A, B). I kontrast, CD34 + CD38-(P6) brøkdel faldt i den anden patient fra 7,8% ved diagnose til 2,27% efter den første behandling opfølgning (figur 3 C, D). I overensstemmelse hermed, den formodede LSC brøkdel steg i de første patient fra 0% ved diagnose til 0,65% (figur 3A', B') og faldt i den anden patient fra 6,57% på diagnosetidspunktet til 1,44% ved behandling opfølgning (figur 3 c ', D'). Ligeledes MRD overvågning af molekylære markører (dvs. NPM1 mutation [første patient] og CBFB-MYH11 translokation [anden patient]) viste, at molekylære MRD falde mindre i den første patient (0,8%) i forhold til den anden patient (0,05%) for den første behandling opfølgende punkt (figur 3E, G). Endelig, til at validere, at formodede P6 LSC er ondartede, udtryk for leukæmi forbundet antigener CD123 og CD33 blev anslået, viser unormal udtryk for CD33 for både patienter (figur 3F, G).
Figur 1 : Gating strategi anvendes til fysiologisk prækursorer og AML eksplosionerne. Tæthed plot med gating af fysiologisk prækursorer vist for en normal knoglemarv. (A) Gating blast celler baseret på CD45dimSSClow fænotype på alle mononukleære celler. (B) Gating af hematogones (CD38 + CD19 +) for kontrol af CD38 positivitet. (C). Gating normale leukæmi, monoblasts og erythroblasts strategi baseret på CD33 og CD36. (D) Blast celler kan opdeles i CD34 + stamfader delpopulationer og bruge CD38 udtryk i P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) celle rum. (E) Gating af hematogones baseret på CD34 og CD38 udtryk, skal du kontrollere CD38 positivitet. (G) bestemmelse af HSC, MPP, LMPP og formodede LSC delpopulationer bruger udtryk for CD90 og CD45RA som tidligere beskrevet9. Bemærk, ingen påvisning af LSC som dette er en normal knoglemarv prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Blast stamfader cellepopulationer i en patient og i tilsvarende patient-afledt-xenograft (PDX) ved multiparametric flowcytometri. (A-B) Kimærisme analyse af PDX. (A) Murine og menneskelige Blaster er først defineret af størrelse og struktur (FSC, SSC). (B) senere, procentdelen af menneskelige versus murine CD45 farvning er vejledende xenoengraftment og leukæmi byrde. Sammenligning af CD34 + CD38-blast celler procent mellem (C) primære diagnose og (D) PDX AML prøve. Sammenligning af formodede LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) mellem (E) primære AML og (F) PDX. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Blast stamfader cellepopulationer i to patienter på diagnose og efter remission induktion terapi til registrering af minimal residual sygdom (MRD). Flow cytometric analyse af CD34 + CD38-blast celle delpopulationer i to repræsentative patienter (A, C) på diagnose og (B, D) efter eftergivelsen induktion terapi. Tal (A'-D') illustrerer respektive P6 gates indeholdende formodede LSC for de to patienter på diagnose og efter første behandling. Vist (E, G) er minimal residual sygdom (MRD) analyse af molekylære markører, der anvendes til disse to patienter over en periode på fem måneder (NPM1 mutation og CBFß-MYH11-gen fusion, henholdsvis). (F, G) Udtryk for leukæmi forbundet antigener CD123 og CD33 på formodede P6 LSC, viser unormal udtryk for CD33 for både patienter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøjagtige og reproducerbare vurdering af membran eller cytoplasmatisk markører ved flowcytometri kræver at Apparatindstillingen er efterprøvet hver dag for optisk tilpasningen, korrekt funktion af det fluidic system, optisk følsomhed og standardisering ved hjælp af kalibrering perler.
Påvisning af blast cellepopulationer i AML med CD90 og CD45RA ved multi parametrisk flow flowcytometri analyse er en relativt enkel og pålidelig metode. Et afgørende skridt i denne analyse er en nøjagtig vurdering af CD38 udtryk på blast celler, for at kunne udføre korrekt gating af CD34 + CD38-befolkning. CD38 intensitet er defineret ved hjælp af normale knoglemarv celler specifikt på hematogones og/eller plasma celler (CD38 +). Intensiteten af andre markører er fedtfrie isotype kontrol.
Tilsætning af CD45RA og CD90 bruges til at skelne HSC fra formodede LSC. Den sidstnævnte og ikke HSC måske årsagen til sygdom tilbagefald, således denne protokol er af interesse for minimal residual sygdom overvågning ved hjælp af flow flowcytometri paneler. Overvågning af AML under behandling er afgørende at forbedre risiko stratificering og guide AML terapi. Desværre, passende molekylære markører er ikke tilgængelige for alle patienter. Derfor kan MRD overvågning ved flowcytometri være muligt for alle AML-tilfælde. Selv om denne metode ikke kan være udtømmende, som det focalizes på fleste AML tilfælde, som har en CD34 + CD38-Stamform og formodede LSC indbyggere. Bemærk er det muligt at den formodede LSC rum kan omfatte normal progenitorceller, dvs. LMPP). Desuden, vi kan ikke udelukke, at der er sjældne tilfælde med funktionelle LSC ikke efter denne unormale udtryk mønster. Note, selv i NPM1-muteret AML, hvilket betragtes CD34 som negative, er vi i stand til at påvise formodede LSC. Derfor, trods den heterogenitet og kompleksiteten af AML LSC rum, vores metode kan anvendes som en biomarkør for kemoterapi svar under opfølgning af AML.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvis støttet af franske Association Laurette Fugain, LigueContre le kræft (North Center), Fondation de France (leukæmi Udvalget), SIRIC Oncolille og fransk National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
