Summary
Мы наметим протокол для обнаружения одновременной выражение маркеров стволовых клеток лейкемии на первичной острой миелоидной лейкемии клеток проточной цитометрии. Мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов.
Abstract
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является неоднородной и если не лечить, смертельной болезни. Это является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности взрослых. Первоначально бод-болезнь гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление лейкозных клеток взрыва и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Гетерогенность распространяется на наличие стволовых клеток лейкемии (LSC), с этой ячейкой динамический отсека развивается преодолевать различные отбора давления навязана при лейкемии прогрессии и лечения. Для дальнейшего определения LSC населения, помимо CD90 и CD45RA позволяет дискриминации нормальной СКК и Multipotent с прародителями в отсеке CD34 + CD38-клеток. Здесь мы приводим протокол обнаружения одновременной выражение несколько предполагаемых LSC маркеров (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ, многопараметрических проточной цитометрии. Кроме того мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов. Этот метод обнаружения и количественного определения предполагаемого LSC может использоваться для клинических решений ответ химиотерапии (т.е., минимальной остаточной болезни), как остаточная LSC может привести к бод рецидива.
Introduction
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности. Первоначально бод является клоновых болезни гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление взрыва клеток и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Недавно клоновые гетерогенность популяции клеток взрыв был создан по существу с помощью следующего поколения стратегии виртуализации (НГС) и показаны существование внутри клональная эволюция опухолевые клетки1.
Гетерогенность распространяется на наличие лейкозных стволовых клеток (LSC). Можно предположить, что этот отсек динамических клеток развивается преодолевать различные отбора давления, навязанной при лейкемии прогрессии и лечения. Поэтому LSC должны быть устойчивы к ТЭК химиотерапевтического и посредником рецидива заболевания, с глубоким клинические последствия2. Были описаны различные маркеры для характеристики LSC как CD1233,4ХЛЛ-1, CD975 или Тим-36. CD34 + CD38-купе взрыва клеток считается обогащаться LSC7 , но также включает в себя обычный HSC. CD90 и CD45RA выражение применяется к CD34 + CD38-(P6) отсека (рис. 1) позволяет отделить несколько этапов нормальных и злокачественных кроветворных прекурсоров8. В частности, нормальный CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-СКК, Multipotent с прародителями (MPP) как CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-клеток и CD34 + CD38-CD90-CD45RA + клетки-предшественники Multipotent с лимфоидных загрунтовать (LMPP) может быть определена в большинстве ОМЛ случаях8 ,9. Интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) CD38 особенно важно рассматривать в отсеке CD34 + клеток. Потому что CD38 интенсивности определяет три новых клеточных компартментов их: CD38 отрицательной (P6), CD38 Дим (P7) и CD38 яркий (P8) (рис. 1). МФО CD38 может определяться с помощью hematogones и/или плазматические клетки как позитивный внутренний контроль как эти клетки решительно выразить CD38.
Иммунодефицитных NOD/SCID/IL2Rγcзначение null (ГЯП) мыши модель широко используется для приживления нормальных и злокачественных человека гемопоэтических клеток10,11. Серийный ксенотрансплантации анализы используются для экспериментально проверить функцию LSC или HSC. Эти исследования были подробно проанализированы больших масштабах последовательности подходов. Тем не менее меньше известно о СОП и HSC иммунофенотип ПФТ взрыва населения прижившимися в ГЯП мышей, по сравнению с его основной AML (рис. 2).
Количество LSC низких таким образом, идентификация и количественная оценка LSC сложной и метод, описанный здесь могут использоваться как assay гранулярных потока на диагностике и клинической следовать для оценки реакции химиотерапии (как остаточная LSC может вызвать рецидив бод). Присутствие LSC может указывать положительное минимальной остаточной болезни (моб). На сегодняшний день, моб мониторинг в AML главным образом полагаться на молекулярные методы (т.е., RT-PCR, NGS)10,12. Однако в этом протоколе мы обнаружить одновременных белков несколько маркеров HSC/LSC (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ многопараметрических потока цитометрии2,8,9. Эта комбинация антител может применяться в любой лаборатории цитометрии стандартного потока и этот assay MRD потока особенно интересно, когда моб в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) не представляется возможным, то есть, если лейкемии конкретные молекулярные маркеры не обнаруживаются в образце диагностических бод. Кроме того этот протокол, в дополнение к более чувствительным молекулярных методов моб, как он стремится выявлять и количественно клеток-аномальные гемопоэтических предшественников представляет характеристика функционального клеток (рис. 3).
Мы покажем, как определить три популяции гемопоэтических предшественников и предполагаемым LSC отсек с разной степенью созревания подачей cytometry с антителами, доступных в большинстве клинических лабораторий. Кроме того мы подтвердили наличие этих клеточных компартментов в соответствующий пациент производные ксенотрасплантатов (PDX) и на лечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мы следуем Европейским стандартам для использования животных для научных целей. Это исследование был одобрен Комитетом по этике местных (№ 3097-2015120414583482v3).
1. Пробоподготовка
- Соберите костного мозга (2 мл) от de novo ПФТ в пробирки, содержащие антикоагулянт Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в концентрации 1,8 мг / мл костного мозга.
- Выполните Ficoll разделения, плотность градиента разделения изолировать мононуклеарных клеток от красных клеток и гранулоцитов, как следует. Разбавить костного мозга в 3 томах фосфатный буфер (PBS: NaCl 137 мм, KCl 2.7 мм, 10 мм Na2HPO4 , KH2PO4 1,8 мм). Тщательно наложение 1 объем Ficoll с 1 объем разреженных костного мозга. Спина 30 минут на 300 x g без тормозов. Перевести белый Баффи слой mononucleated клеток в новую стерильную пробирку.
- Вымыть клетки дважды в 10 мл PBS) и центрифуги на 300 g x 5 минут, чтобы удалить загрязняющие компоненты сыворотки.
2. Лизис эритроцитов (РБК)
- Добавить 2 мл буфера lysis (аммония хлорид 0,8%) в ячейку Пелле, вихревой мягко и инкубации при комнатной температуре на 5 мин центрифуги на 300 g x 5 мин.
Примечание: Если необходимо, повторите этот шаг. - Вымыть клетки в PBS как описано выше (1.3.).
3. пациент производные ксенотрасплантатов.
- Получить взрыв клеток из костного мозга после разделения Ficoll и после истощения лимфоцитов с помощью иммуномагнитная негативный отбор (CD3 T-и CD20 для B-лимфоциты). Следуйте инструкциям производителя.
- Inject 5 х 106 ПФТ взрыва клетки в Вену хвост безусловный ГЯП мышей. Используйте удерживающего устройства для облегчения инъекции Вену хвост. Держите мышей в обычных условиях и особенно в условиях свободной от конкретного патогена на все времена, с помощью индивидуальных вентилируемых клетки и манипуляции под Ламинарный шкаф. Каждые две недели, принимать 60 мкл крови методом подчелюстной коллекции с использованием гематокрит капилляров. Место капилляров в 5 мл круглая труба внизу. Остановите кровотечение, применяя мягкое давление, используя небольшой стерильной марлевой. Исключать крови с чистой шприца.
- Добавьте 1ml буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем, центрифуги на 300 g x 5 мин мыть с PBS и centrifugre на 300 x g за 5 минут. Удалить супернатант, добавить 100 мкл PBS с 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА) пятно с 3 мкл античеловеческие CD45 FITC и 1 мкл против мышиных CD45-APC и Инкубируйте на 4 ° C на 30 минут.
- Пелле клеток в мыть два раза в PBS (2 мл) с 10% BSA и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
- Аликвота вплоть до 1 x 106 клеток на 100 мкл PBS в цитометрии расходомерных трубок.
- Обследования приживления каждые две недели химеризма анализ экспрессии CD45 (человека против мышиных) с помощью проточной цитометрии (рисунок 2A и B).
- В жертву (периферийных взрыва всего более 70% или серьезных клинических признаков болезни), собирать мононуклеаров взрыва из измельченных селезенки и костного промывкой tibias и бедра с PBS как описано13. Усыпить мышей от шейки матки дислокации международных руководящих принципов.
- Если ячейка Пелле содержит РБК, выполните Лизис эритроцитов с буфера lysis (шаг 2.1).
- Пелле клетки мыть два раза в PBS (2 мл) с 10% BSA и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Соберите клетки и аликвота 1 х 106 клеток / 100 мкл PBS в цитометрии расходомерных трубок.
4. Окрашивание
- Добавление конъюгированных антител (см. шаг 4.2) и вихря. Инкубируйте клетки на 15 минут в темноте при комнатной температуре.
- Используйте следующее полотнище для человека первичной или PDX образцов, состоящий из 10 мкл анти CD36-FITC, 5 мкл анти CD19-ECD, 5 мкл анти CD33-PC5.5, 5 мкл анти CD90-APC, 5 мкл анти CD34-AA700, 5 мкл анти CD45RA-APC-H7, 5 мкл анти CD38-Тихоокеанского синего, 5 мкл анти CD123-PC7 и 2,5 мкл анти CD45-KO.
- Удалите несвязанные антитела, мытья клетки в 2 мл PBS центрифугированием при 300 g x 5 мин.
- Вновь приостановите клетки в 450 мкл PBS для анализа гранулярных окончательного потока.
5. стробирования стратегия для анализа потока цитометрии
- Выполняйте сбор данных (по крайней мере 500 000 клеток) на проточный цитометр оснащены лазерами красный, синий и фиолетовый. Проверка параметров цитометр каждый день для 1) оптическое выравнивание, 2) аэрогидродинамических системы, 3) оптическая чувствительность и 4) стандартизации с помощью флуоросфер
- Следуйте последовательный стробирования стратегии для определения CD38 выражения (рис. 1).
- Для определения hematogones или плазматические клетки, которые будут служить в качестве позитивного управления для выражения CD38 используйте клетки от нормального костного образцов.
Примечание: этот ворот особенно важна для оценки как последующего предполагаемого LSC населения зависят от его определения. - Определите физиологического прекурсоров (клетки нормального взрыв), CD45dim/SSC (сторона разброс) низкая демографических критериев (рис. 1A). В рамках этого взрыва населения, определить hematogones, который отображает CD38 ++ CD19 + фенотип (рис. 1B) и, наконец, использовать CD36 и CD33 выражение для определения миелобластов, monoblasts и erythroblasts (рис. 1 c). Определите выражение CD34 на hematogones, как показано на (рис. 1E). Оцените несколько субпопуляций прекурсоров внутри клетки взрыва, определяется как P6-P10 (рис. 1 d). Отдельный отсек CD34 взрыва клеток в P6, P7, P8 прародитель субпопуляций, основанные на заданных CD38 ворота. Убедитесь, что отсеке P8 содержит взрывов, которые имеют такой же интенсивностью CD38 как hematogones, что P6 включает в себя клетки, которые являются CD38-на базе CD38 флуоресценции минус один (FMO) управления и что P7 клетки между двумя крайностями: что касается CD38 выражение (рис. 1 d).
- Для определения hematogones или плазматические клетки, которые будут служить в качестве позитивного управления для выражения CD38 используйте клетки от нормального костного образцов.
- CD34 + 38-(P6) условным клетки, отдельные HSC от предполагаемого LSC, с помощью выражения CD90 и CD45RA (Рисунок 1F).
Примечание: HSC фенотипа является CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- и Multipotent с прародителями (MPP) определяются как CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Предполагаемый LSC фенотипа является CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + и более незрелых течению населения являются лимфоидных загрунтовать прародителями (LMPP) определяется как CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. моб, мониторинг, RT-PCR
- Контролируйте уровни моб, RT-PCR как описано ранее,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем метод для определения прародитель населения в нормальных и злокачественных костного мозга человека образцов. Мы собрали костного мозга и селезенки с успешным PDX и выполняются многопараметрических проточной цитометрии, как описано выше. Мы сравнили несколько субпопуляции клеток взрыва между диагностики пациента образца и соответствующие PDX и особенно, отсеке CD34 + CD38-прародитель, особенно обогащенный предполагаемого LSC. Мы нашли, что фракция CD34 + CD38-взрыв был выше в PDX, по сравнению с диагностики пациента образца (3,48% против 0,53%, рис. 2 c, D). Интересно, что мы нашли более высокий процент предполагаемый LSC (отображение CD34 + CD38-CD90-CD45RA + фенотип) в PDX, по сравнению с первичной пробы пациента (2.76% против 0,48%, рис-2E, F), предлагая возможности обогащения злокачественных клетки-предшественники в гематологических ткани в этой модели мыши. Частота нормальной прогениторных клеток фракций не отличается между PDX и образце пациента.
Кроме того мы изучили взрыва клеточных популяций прародителю, основанный на выражение CD34, CD38, CD90 и CD45A (как описано в настоящем протоколе) в двух различных выборок пациента, диагноз и лечение последующие меры для определения уровня моб. В первый пациент, CD34 + CD38-фракция (P6) увеличилась с 0,06% диагноз до 3,33% по итогам первого лечения (рис. 3а, B). В отличие от CD34 + CD38-фракция (P6) снизился в второго пациента от 7,8% диагноз 2,27% по итогам первого лечения (рис. 3 C, D). Таким образом предполагаемый фракции КПУ увеличился в первого пациента от 0% на диагностику до 0,65% (рис. 3A', B') и уменьшилась в второго пациента с 6,57% диагноз до 1,44% на последующие обращения (рис. 3 c ', D'). Аналогично, моб, мониторинг молекулярных маркеров (т.е. NPM1 мутаций [первый пациент] и CBFB-MYH11 транслокации [второй пациент]) показал, что молекулярные MRD уменьшение меньше первого пациента (0,8%), по сравнению с Вторым пациентом (0,05%) для первого лечения последующие точки (Рисунок 3E, G). Наконец чтобы проверить, что предполагаемый P6 LSC злокачественные, выражение лейкемии связанные антигены, которые CD123 и CD33 оценивались, показаны ненормальной выражение CD33 для обоих пациентов (Рисунок 3F, G).
Рисунок 1 : Стробирования стратегия используется для физиологического прекурсоров и ПФТ взрывов. Плотность участок с стробирования физиологического прекурсоров для нормального костного мозга. (A) Gating взрыва клеток, основанные на CD45dimSSClow фенотип на всех mononucleated клетки. (B) Gating hematogones (CD38 + CD19 +) для проверки CD38 позитивность. (C). стробирования стратегии, нормальных миелобластов, monoblasts и erythroblasts на основе CD33 и CD36. (D) взрыва клетки могут быть разделены на CD34 + прародитель субпопуляций и с помощью выражения CD38 в P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) клетки отсеков. (E) Gating hematogones на основе CD34 и CD38 выражения, проверить CD38 позитивность. (G) определение HSC, MPP, LMPP и предполагаемым LSC субпопуляций, как ранее с помощью выражения CD90 и CD45RA описал9. Следует отметить не обнаружения LSC как это является образцом нормального костного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Взрыв клеточных популяций прародитель в пациента и соответствующий пациент производные Ксенотрансплантат (PDX) подачей cytometry многопараметрических. (A-B) Анализ химеризма PDX. (A) мышиных и человека взрывов сначала определяется размер и структура (FSC, SSC). (B) впоследствии доля человека против мышиных CD45 окрашивания свидетельствует о xenoengraftment и лейкемии бремени. Сравнение CD34 + CD38-Доменная клетки процент между первичной диагностики (C) и (D) PDX AML образца. Сравнение предполагаемого LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) между первичной AML (E) и (F) PDX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Взрыв клеточных популяций прародитель у двух пациентов диагноз и после ремиссии индукционной терапии для обнаружения минимальной остаточной болезни (моб). Поток анализ гранулярных клеток субпопуляций CD34 + CD38-взрыв в два представителя пациентов (A, C) диагностики и (B, D) после индукционной терапии ремиссии. Цифры (A'-D') иллюстрируют соответствующие ворота P6, содержащего предполагаемый LSC для двух пациентов диагноз и после первоначального лечения. Показано на (E, G) является минимальной остаточной болезни (моб) анализ молекулярных маркеров, используемых для этих двух пациентов в течение пяти месяцев (NPM1 мутации и CBFß-MYH11 гена фьюжн, соответственно). (F, G) Выражение лейкемии связанные антигены CD123 и CD33 на предполагаемый LSC P6, показаны ненормальной выражение CD33 для обоих пациентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Точные и воспроизводимые оценку мембраны или цитоплазматических маркеров подачей cytometry требует, что инструмент настройки проверяются каждый день для оптических выравнивания, надлежащее функционирование аэрогидродинамических система, оптическая чувствительность и стандартизации с помощью калибровки бусины.
Обнаружение взрыв клеточных популяций в бод с помощью CD90 и CD45RA, мульти Параметрический анализ цитометрии является относительно простой и надежный метод. Важнейшим шагом в этом анализе является точной оценки экспрессии CD38 на взрыв клетки, чтобы выполнить правильное стробирования CD34 + CD38-населения. CD38 интенсивности определяется с помощью клеток нормального костного конкретно на hematogones и/или клетки плазмы (CD38 +). Интенсивность других маркеров определяется с использованием изотипа элементов управления.
Добавление CD45RA и CD90 используется для различения HSC от предполагаемого LSC. Последний и не HSC может быть причиной рецидивов заболевания, таким образом этот протокол представляет интерес для минимальной остаточной болезни, наблюдение с помощью потока цитометрии панелей. Мониторинг ОМЛ во время лечения необходимо улучшить стратификации риска и направлять ПФТ терапии. К сожалению соответствующие молекулярные маркеры доступны не для всех пациентов. Таким образом моб контроль за подачей cytometry возможно для всех случаев бод. Хотя этот метод не может быть исчерпывающим, как он focalizes на большинство случаев ПФТ, которые CD34 + CD38-прародитель и предполагаемого населения LSC. Следует отметить вполне возможно что предполагаемый LSC отсека может включать в себя нормальной прародителями, т.е., LMPP). Кроме того не исключено, что существуют редкие случаи с функциональной LSC не после этого аномальные выражения. Следует отметить, что даже в мутировал NPM1 AML, которые считаются CD34 отрицательные мы способны обнаруживать предполагаемого LSC. Таким образом несмотря на разнородность и сложности AML LSC отсека, наш метод может использоваться как биомаркеров химиотерапии ответа во время последующих бод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали французской ассоциации Лоретт Фюгеном, LigueContre le рака (Северный центр), Фонд-де-Франс (лейкоз Комитет), SIRIC Oncolille и французского национального института рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
