Summary
Здесь мы описываем простой, недорогой и быстрый метод очистки для решения 3D-структуры как мыши, так и человеческой белой жировой ткани, используя комбинацию маркеров для визуализации сосудов, ядер, иммунных клеток, нейронов и белков липидно-капельного слоя с помощью флуоресцентных изображений.
Abstract
Ожирение является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, что повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа 2 и заболеваний печени. Ожирение характеризуется увеличением жировой ткани (AT) массы из-за гиперплазии адипоцитов и/ или гипертрофии, что приводит к глубокой реконструкции его трехмерной структуры. Действительно, максимальная способность AT расширяться во время ожирения имеет решающее значение для развития связанных с ожирением патологий. Это расширение AT является важным гомеостативным механизмом, позволяющим адаптироваться к избытку потребления энергии и избежать пагубного распространения липидов на другие метаболические органы, такие как мышцы и печень. Таким образом, понимание структурной реконструкции, которая приводит к провалу расширения AT является фундаментальным вопросом с высокой клинической применимостью. В этой статье мы описываем простой и быстрый метод очистки, который обычно используется в нашей лаборатории для изучения морфологии мыши и человеческой белой жировой ткани с помощью флуоресцентных изображений. Этот оптимизированный метод очистки AT легко выполняется в любой стандартной лаборатории, оснащенной химическим капюшоном, контролируемым температурой орбитальным шейкером и флуоресцентным микроскопом. Кроме того, используемые химические соединения легко доступны. Важно отметить, что этот метод позволяет решить 3D AT структуры путем окрашивания различных маркеров специально визуализировать адипоцитов, нейронных и сосудистых сетей, а также врожденные и адаптивные распределения иммунных клеток.
Introduction
Ожирение характеризуется увеличением жировой массы тканей и стало одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, учитывая, что люди с ожирением имеют повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа-2, заболеваний печени и некоторых видов рака.
Фундаментальная физиологическая функция жировой ткани заключается в модулировать глюкозу всего тела и липидный гомеостаз1,,2. В период кормления адипоциты (т.е. основные клетки жировой ткани) хранят избыток глюкозы и липидов, предоставляемых при приеме пищи в триглицериды. Во время поста адипоциты распадают триглицериды на неестерифицированные жирные кислоты и глицерол для поддержания спроса на энергию в организме. Во время развития ожирения жировая ткань расширяется за счет увеличения размера (гипертрофии) и/или количества (гиперплазии) адипоцитов1,чтобы увеличить их емкость. Когда расширение жировой ткани достигает своего предела, постоянная высокая переменная среди пациентов, остальные липиды накапливается в других метаболическихорганов,включаямышцы и печень 3,4, что приводит к их функциональной недостаточности и инициирования связанных с ожирениемкардио-метаболических осложнений 1,5. Таким образом, определение механизмов, которые регулируют расширение жировой ткани является ключевой клинической проблемой.
Морфологические изменения, задокументированные в жировых тканях при ожирении, связаны с его патологической дисфункцией. Несколько процедур окрашивания были использованы для описания организации тканей жировой ткани, в том числеактин 6, сосудистыемаркеры 7, липидно-капельныемаркеры 8, и конкретные маркерыиммунных клеток 9,10. Однако, из-за огромного диаметра адипоцитов (от 50 до 200мкм) 11, важно проанализировать большую часть всей ткани в трех измерениях, с тем чтобы точно проанализировать драматические структурные изменения AT наблюдается во время ожирения. Однако, поскольку свет не проникает в непрозрачные ткани, визуализация в 3D в больших образцах тканей с использованием флуоресцентной микроскопии невозможна. Методы очистки тканей, чтобы сделать их прозрачными были зарегистрированы в литературе (для обзора,см. 12), что позволяет очистить ткани и выполнять углубленную, всю ткань флуоресценции микроскопии. Эти методы предлагают беспрецедентные возможности для оценки 3D клеточной организации в здоровых и больных тканях. Каждый из описанных методов имеет преимущества и недостатки, и поэтому должны быть тщательно отобраны в зависимости от изученной ткани (для обзора,см. 13). Действительно, некоторые подходы требуют длительного инкубационный период и / или использование материалов или соединений, которые являются либо дорогими, токсичнымиили трудно получить 14,,15,,16,,17,18,19. Воспользовавшись одним из первых соединений, используемых сто лет назад Вернер Spalteholzдля очистки тканей 20, мы создали удобный и недорогой протокол, который очень хорошо приспособлен для очистки всех мыши и человека жировой ткани складов в любой лаборатории с типичным оборудованием, включая химический капюшон, температура контролируемых орбитальный шейкер и конфокальный микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был протестирован и проверен для всех мышей и человека белые жировые ткани складов. Жировые ткани человека и мыши были собраны соответствующим образом европейским законам и одобрены французскими и шведскими комитетами по этике.
1. Фиксация мыши и человека белой жировой ткани
- Погрузите собранную мышь или белые жировые ткани человека по крайней мере в 10 мл PBS, содержащий 4% параформальдегида (PFA) в пластиковой трубке 15 мл.
- Встряхните пластиковую трубку при комнатной температуре на подвижной пластине в течение 1 ч.
- Оставьте пластиковую трубку при 4 градусов по Цельсию на подвижной пластине на ночь, чтобы завершить фиксацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован для больших образцов жировой ткани, таких как целые эпидидимальные жировые прокладки, полученные от мышей, питались нормальной диетой (≈250 мг - ≈0,6см 3). Для более крупных образцов, таких как эпидидимальные жировые прокладки, полученные от мышей, питались высокожирной диетой (≈1,5 г - ≈4см 3)или образцами жировой ткани человека, хотя протокол очистки должен отлично работать для всего образца (путем масштабирования PFA и антитела смеси), в целом, мы вырезали части ткани около 1 г (≈2,5 см 3 ), чтобызарезервироватьоставшиеся образцы либо для дополнительного окрашивания или применения. Для PFA (шаг 1.1.) мы рекомендуем использовать примерно в 10 раз больше объема ткани. Для антитела смеси (шаги 3.1. и 3.4.), увеличить объем, чтобы полностью погрузить ткани, и использовать 15 мл пластиковой трубки (см. Таблица материалов), если ткань слишком велика для 1,5 мл пластиковых микротрубок (см. Таблица материалов).
2. Пермеабилизация и насыщение мышей и белой жировой ткани человека
- Промыть фиксированной белой жировой ткани в 10 мл PBS в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить все следы PFA.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл PBS, дополненную 0,3% глицина (см. Таблицу материалов)и встряхните трубку при комнатной температуре в орбитальном шейкере в течение 1 ч при 100 оборотов в минуту (об/мин), чтобы утолить оставшиеся свободные группы альдегида.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл PBS, дополненную 0,2% Triton X-100 (см. Таблицу материалов)и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере на 2 ч при 100 об/мин.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл PBS, дополненную 0,2% Triton X-100 и 20% DMSO (см. Таблицу материалов)и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин за одну ночь.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл PBS, дополненную 0,1% Tween-20 (см. таблицу материалов),0,1% Triton X-100, 0,1% дезоксихолата (см. таблицу материалов)и 20% ДМСО и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин, по крайней мере, 24 ч.
- Промыть ткань в пластиковой трубке 15 мл, содержащей 10 мл PBS, дополнили 0,2% Triton X-100 и встряхните трубку при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин при 1 ч.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл PBS, дополненную 0,2% Triton X-100, 10% DMSO и 3% BSA (см. Таблицу Материалов)и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин в течение 12 ч, чтобы насытить любые участки, которые могут не связывать антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: В шаге 2.7, BSA можно заменить сывороткой крови видов вторичного антитела используемого.
3. Процедура окрашивания мыши и человеческой белой жировой ткани
- Передача ткани в 1,5 мл пластиковых микротрубок, содержащих 300 МКЛ PBS дополняется 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA и первичных антител (10x более концентрированным, чем для криозиции окрашивания, но оптимальная концентрация антител должны быть оценены для каждого антитела). Защитите трубку от света, покрыв алюминиевой фольгой и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин в течение по крайней мере двух дней (см. примечание в шаге 1.1 и шаг 3.7.1).
- Промыть ткань в пластиковой трубке 15 мл, содержащей 10 мл PBS, дополненной 0,2% Triton X-100, 10% DMSO и 3% BSA и встряхнуть трубку, защищенную от света при температуре 37 градусов по Цельсию в управляемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин в течение 5 ч. Выполните этот шаг дважды.
- Промыть ткани в 15 мл пластиковой трубки, содержащей 10 мл PBS дополняется 0,2% Тритон X-100, 10% DMSO и 3% BSA и встряхнуть трубку, защищенную от света, при температуре контролируемых орбитальных шейкер при температуре 100 об / мин в течение одной ночи до двух дней.
- Перенесите ткань на пластиковую микротрубку 1,5 мл, содержащую 300 МКЛ PBS, дополненную 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA и вторичными антителами (в 10 раз более концентрированными, чем при окрашивания криозетов). Защитите трубку от света, покрыв алюминиевой фольгой и встряхните трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в контролируемом температурой орбитальном шейкере при 100 об/мин в течение по крайней мере двух дней (см. примечание в шаге 1.1 и шаг 3.7.1).
- Промыть ткани в 15 мл пластиковой трубки, содержащей 10 мл PBS дополняется 0,2% Тритон X-100, 10% DMSO, и 3% BSA и встряхнуть трубку, защищенную от света, при температуре контролируемых орбитальных шейкер при 100 об/ мин за 5 ч. Выполните этот шаг дважды.
- Промыть ткани в 15 мл пластиковой трубки, содержащей 10 мл PBS дополняется 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, и 3% BSA и встряхнуть трубку, защищенную от света, при температуре контролируемых орбитальных шейкер при температуре 100 об / мин в течение одной ночи до двух дней.
- Промыть ткань в пластиковой трубке 15 мл, содержащей 10 мл PBS и встряхнуть трубку, защищенную от света, при температуре контролируемых температурой орбитальных шейкер при 100 об/мин в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для маркировки конкретных структур, таких как ядра или актин, добавить 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI или эквивалент) и / или флуоресцентно помечены фаллоидин должны быть добавлены на шаг 3.1. когда используются только флуоресцентно помеченные первичные антитела, или на шаге 3.4. при использовании вторичных антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры окрашивания можно использовать первичные антитела, уже спрягаемые с фторхромами (например, те, которые используются для цитометрии потока), и мы рекомендуем их для получения времени и специфичности. Действительно, даже если мышей первичные антитела могут быть использованы следуют вторичные антитела против мыши, как мы показали это здесь, мы часто наблюдали неспецифическое окрашивание кровеносных сосудов из-за циркулирующего иммуноглобулина. Поэтому, чтобы избежать этой проблемы, первичные антитела, которые уже помечены настоятельно рекомендуется, и здесь мы предоставляем доказательства того, что антитела, используемые в цитометрии потока совместимы с нашей процедурой. Однако, в конкретном случае антигена, который выражается на низких уровнях, шаг усиления сигнала через вторичные антитела является обязательным; когда единственное доступное первичное антитело сделано в мыши, сердечн-perfusion мышей с PBS на хотя бы 5 min на жертве может извлечь большую часть циркулируя иммуноглобулина и таким образом non-specific окрашивать.
4. Процедура очистки для мыши и человека белой жировой ткани
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл этанола 50% и встряхните трубку, защищенную от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин при 2 ч.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл 70% этанола, и встряхните трубку, защищенную от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин при 2 ч.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл этанола 95% и встряхните трубку, защищенную от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин при 2 ч.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл 100% этанола, и встряхните трубку, защищенную от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин при 2 ч.
- Погрузите ткань в пластиковую трубку 15 мл, содержащую 10 мл 100% этанола, и встряхните трубку, защищенную от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин за ночь.
- Погрузите ткань в стеклянную бутылку 20 мл с пластиковой крышкой (см. таблицу материалов), содержащую 5 мл метилсалицилата (см. таблицу материалов)под химическим капотом и встряхните стеклянный контейнер, защищенный от света, при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 100 об/мин не менее 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура очистки может быть значительно ускорена (при необходимости), избегая шагов 4.3. и 4.5., хотя окончательное качество клиринга будет несколько снижено.
5.3D-конфокальные изображения очищенной белой жировой ткани
- Перенесите ткань в металлическую камеру визуализации, оборудованную стеклянным дном (см. таблицу материалов)под химическим капотом и заполните камеру свежим метилсалицилатом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения ткани на месте, и, таким образом, чтобы предотвратить его от плавающей или движущихся боком в камере, применять несколько 18 мм круглые стеклянные крышки (см. Таблица материалов) на верхней части ткани при монтаже его в камеру. - Поместите камеру визуализации на перевернутый конфокальный микроскоп.
- Изображение ткани с помощью низкой цели увеличения (например, 4x цель) для создания несколькихсм 3 3D карты всей жировой ткани или образца человеческой ткани.
- Выберите несколько областей для отбора проб тканей при более высоком увеличении. Как правило, используйте 20x междугородной воздушной цели, которая обеспечивает хорошее соотношение между разрешением и глубиной. Мы приобретаем большие мозаичные изображения с z-штабелями глубиной от 600 до 2000 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте междугородную цель, чтобы изображение глубже в ткани.
6. Извлечение количественных результатов из 3D изображений жировой ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация различных структур и последующая извлечения количественной информации из стека 3D-изображения, генерируемого в точке 5, могут быть выполнены с использованием любого из многих существующих вариантов программного обеспечения для анализа изображений, коммерческих или бесплатных программ. В следующих моментах мы описываем стратегию, которая обычно используется в нашей лаборатории для извлечения количественной информации из 3D изображений жировой ткани с использованием коммерческого программного обеспечения (см. таблицу материалов).
- Преобразование 3D стеков в формат программного обеспечения для свободного пространства памяти.
- Сегмент ячейки.
- Откройте модуль Cell программного обеспечения.
- Измените настройку обнаружения клеток на плазменное окрашивание мембраны.
- Выберите флуоресцентный канал маркера, используемого для разграничения периферии клеток (фаллоидин, который маркирует корковые актин или плазменные мембранные маркеры, такие как F4/80 для макрофагов, TCR-β для Т-клеток, или кластер дифференциации cd-белков, специфичных для подтипов иммунных клеток).
- Настройка пороговых значений и предоставление диапазона ожидаемого размера ячейки (т.е. от 1 до 200 мкм для обнаружения клеток).
- Вы запустите сегментацию. Объем, соответствующий z-стеку, будет генерироваться с сегментированными ячейками, цветными с разным цветом для каждой из соседних ячеек.
- Примените статистические фильтры (размер, округлость, круговорот и т.д.) в статистической вкладке, чтобы исключить артефакты сегментации и/или усовершенствовать сегментированные клетки до ячейки, представляющие интерес, в зависимости от их размера (т.е. 20-200 мкм для адипоцитов; 5-25 мкм для макрофагов; 1-3 мкм для лимфоцитов).
- Извлекайте измерения и количественные данные (объем, число, размер, диаметр и т.д.) из вкладки статистики.
- Сегмент клеточных компонентов (ядер, пузырьков и т.д.) или сосудов в качестве структуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сегментация нити очень полезна для изучения подключения сосудов, мы используем сегментацию поверхностных модулей для извлечения данных о размере, объеме и диаметре сосудов. Действительно, количественная оценка размеров судов теряется при использовании модуля нитей.- Откройте модуль Surface программного обеспечения.
- Выберите флуоресцентный канал маркера, используемый специально для обозначения подклеточного компонента для его реконструкции в 3D.
- Настройка пороговых значений и предоставление диапазона ожидаемого размера диаметра конструкции (т.е. 0,5-5 мкм для ядер; 0-100 мкм для судов; и т.д.).
- Вы запустите сегментацию. Будет сгенерирован объем с сегментированной клеточной структурой. Измерения и количественные данные (объем, число, размер, диаметр и т.д.) могут быть извлечены из вкладки статистики.
- Сегмент сосудов как трубчатый континуум.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя сегментация нити очень полезна для изучения подключения сосудов, мы используем сегментацию поверхностных модулей для извлечения данных о размере, объеме и диаметре сосудов. Действительно, количественная оценка размеров судов теряется при использовании модуля нитей.- Откройте модуль Filaments программного обеспечения.
- Выберите флуоресцентный канал, соответствующий окрашиваниям сосудов.
- Настройка пороговых значений интенсивности флуоресценции и выбор соответствующего количества ожидаемых соединительных узлов.
- Вы запустите сегментацию. Нити, представляющие сеть судов, будут генерироваться в 3D. Измерения могут быть извлечены из вкладки статистики, что позволяет получить количественные данные, включая длину судна, количество ветвлений судна и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанную здесь процедуру и обобщенную на рисунке 1,мы смогли окрашивать и оптически очистить белую жировую ткань человека и мыши, представленную на рисунке 2A и рисунке 2Bсоответственно. Очищенная ткань была перенесена в металлическую камеру визуализации для выполнения конфокальных изображений(рисунок 3A). Очистка резко улучшила глубину изображений тканей, которые мы смогли приобрести(рисунок 3B и рисунок 3C). Вся жировая ткань может быть приобретена в 3D при низком увеличении с помощью 4x цели (см. Дополнительный фильм 1), для создания 3D-карты, что позволяет выбрать различные области, которые будут приобретены при высоком увеличении с помощью 20x цели(рисунок 3D). Изображения с высоким увеличением приобретаются в 3D с глубиной 2 мм(рисунок 3E).
Эта процедура позволяет маркировать многочисленнNp общие маркеры клетки, включая ядра путем использование DAPI и actin путем использование флуоресцентно-маркированных фаллоидин. Специфическое окрашивание липидных капель и адипоцитов может быть достигнуто с помощью перилипина антитела (см. таблицу материалов; Рисунок 4A) и анти-Glut4 антитела (см. таблицу материалов; Рисунок 4B) Соответственно. Кровеносные сосуды могут быть обнаружены с помощью антитела CD31 (см. таблицу материалов; Рисунок 4C) или путем внутривенной инъекции лектина-DyLight649 незадолго до жертвоприношения мыши (см. таблицу материалов; Рисунок 4D). Макрофаги и Т-клетки можно визуализировать с помощью антитела анти-CD301-PhycoErythrin (см. таблицу материалов; Рисунок 4D) и анти-TCR-β-Pacific Bleu (см. таблицу материалов; Рисунок 4E). Периферическая нервная сеть может быть обнаружена с помощью антител антитирозин гидроксилазы (TH) (см. таблицу материалов; Рисунок 4F-G). Кроме того, этот протокол позволяет очистить мышь эпидидимальной жировойткани (рисунок 4A-B,E), мыши подкожной жировойткани (рисунок 4D,G), мыши коричневый жировой ткани (Рисунок 4F), и жировой ткани человека (Рисунок 4C). Используя комбинацию этих меток и коммерческого программного обеспечения (см. таблицу материалов), чтобы сегментировать эти маркеры, мы можем определить в жировой ткани i) адипоциты среднего размера и распределения размера(рисунок 5A-B) и ii) плотность сети кровеносных сосудов(рисунок 5C).
Рисунок 1: Резюме процедуры очистки белой жировой ткани. Мышь или человека белые жировые ткани фиксируются, проницаемые, насыщенные, окрашенные и очищается. Изображения затем приобретаются в 3D и анализируются с помощью коммерческого программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Фотографии белой жировой ткани. (A) Фотография человека белый abdominop тазовых жировой ткани до и после процедуры очистки. (B)Фотография мыши эпидидимальной белой жировой ткани до и после процедуры очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Улучшенная глубина изображения с очисткой жировой ткани. (A)Монтаж металлической камеры визуализации, оборудованной стеклянным дном. (B) - серия изображений мыши эпидидимальной белой жировой ткани окрашенных фаллоидин-Alexa488 (зеленый) до и после очистки. (C)X- проекции, соответствующие белым пунктирным линиям по всей панели B z-stack. (D) - проекция 0,4 см z-стек мыши подкожной белой жировой ткани окрашенных для актина с использованием фаллоидин-Alexa488 и приобрел при низком увеличении с 4x цели. Небольшие изображения справа были получены в выбранном положении ткани с использованием 20x цели. (E) Боковой вид 3D объем рендеринга изображения z-стек из очищенной мыши белой жировой ткани окрашенных фаллоидин-Alexa488 приобрел аналогично 20x изображения из (D). Глубина 3D-изображения, достигнутая нашей высокой процедурой увеличения, демонстрируется здесь и подчеркивается z-глубинным цветовим кодированием (темно-синий для z'0 мм до темно-красного цвета для z'2 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Мышь и человека белые жировые ткани окрашены в течение нескольких маркеров. (A) Одно плоскости изображение мыши эпидидимальной белой жировой ткани окрашенных для липидных капель с использованием анти-перилипина1 антитела и анти-мышь-alexa647-конъюгированных антител. (B) Мозаика одно плоскости изображения мыши эпидидимальной белой жировой ткани окрашенных для ядер и адипоцитов с использованием DAPI, анти-Glut4 антитела и анти-мышь-alexa647-конъюгированных антител. (C) - проекция 600 мкм z-стек человека белый abdominop тазовых жировой ткани окрашенных для судов, использующих CD31-alexa647-спряженных антител. (D) - проекция 600 мкм z-стек мыши подкожной белой жировой ткани окрашенных для сосудов и макрофагов с использованием lectin-DyLight649 внутривенных инъекций и анти-CD301-alexa555 антитела. Нижняя правая вставка - увеличенное изображение белого пунктирной коробки. (E)Одно плоскости изображение мыши эпидидимальной белой жировой ткани окрашенных для актина и Т-клеток с использованием фаллоидин-Alexa488 и анти-TCR-Тихоокеанского сине-конъюгированных. Нижняя правая вставка - увеличенное изображение белого пунктирной коробки. (F) - проекция 50 мкм z-стек мыши коричневой жировой ткани окрашенных для ядер и нейрональной сети с использованием DAPI, анти-TH антитела и анти-кролик-alexa647-спряженных антител. (G) - проекция 600 мкм z-стек мыши подкожной белой жировой ткани окрашенных для ядер и нейрональной сети с использованием DAPI, анти-TH антитела и анти-кролик-alexa647-спряженных антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ 3D-изображений с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (см. таблицу материалов). (A) 3D-рендеринг человеческих адипоцитов, сегментированных в 3D коммерчески доступным программным обеспечением. Каждый адипоцит имеет различный цвет, чем контакты с соседними адипоцитами. Суда представлены красным цветом. (B) Количественная оценка размера и распределение адипоцитов из 3D-тома рендеринга панели А, которая содержит около 20 000 адипоцитов. CC) 3D-рендеринг кровеносных сосудов, сегментированных в 3D с использованием коммерчески доступного программного обеспечения и представленных красным или желтым цветом для больших и малых сосудов, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный фильм 1: 3D объем рендеринга всей подкожной белой жировой ткани показано на рисунке 3D. Белый ящик представляет собой 2 см3 куба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изменения, которые происходят в жировой ткани в течение патологического прогрессирования, таких как ожирение, имеет основополагающее значение для понимания механизмов, стоящих за патологией. Новаторские исследования, которые показали такие механизмы в жировой ткани были основаны на глобальных подходах, таких как протеомикацелых жировых тканей 21,поток цитометрии 22,23, и транскриптомики24,25. Кроме того, были предприняты усилия по изучению структурных изменений, происходящих в жировой ткани с использованиемгистологических анализов 26,,27,,28,,29. Тем не менее, анализ 5-10 мкм участки жировой ткани, из-за ограниченного размера раздела, ограничивает способность ценить важные структурные особенности. Во-первых, только несколько ядер адипоцитов обнаруживаются на один раздел, так как каждый раздел представляет собой лишь небольшую часть адипоцитов (1/10th). Во-вторых, размер адипоцитов, оцененных на участках жировой ткани, является неточным, поскольку большинство адипоцитов вырезаны ниже или позади экватора, что приводит к предвзятому (под) измерению их среднего размера. В-третьих, кровеносный сосуд и континуум нервного волокна теряются во время физического сечения. В-четвертых, распределение каждого подтипа иммунных клеток в тканях трудно установить, потому что трехмерные координаты теряются. В этом контексте методология, которую мы предлагаем здесь, позволяет любой стандартной лаборатории изображения человека и мыши белой жировой ткани в трех измерениях, в простой и недорогой способ.
Этот метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, время, необходимое для подготовки ткани (фиксация, проницаемание, окрашивание, очистка) является длинным (более недели). Это было бы трудно уменьшить, потому что большую часть этого времени требуется, чтобы испачкать ткани. Проникновение антител в такие большие образцы тканей требует длительного инкубации. Уменьшение инкубационого времени увеличит риск проникновения не однородного антитела, что приведет к окрашиванию артефактов. Таким образом, единственным возможным окном, чтобы выиграть время и сократить процедуру является время, посвященное очистить ткани, которая занимает около одного дня, когда необходимы оптимальные результаты, но это может быть уменьшена до половины дня без резкого падения качества. Вторым ограничением является вероятная усадка ткани. Действительно, в любом протоколе, который обезвоживает ткани с помощью растворителей, вполне вероятно, что ткани сокращаются из-за удаления воды. Оценка этой усадки всегда является сложной задачей, и это почти невозможно здесь, потому что край ткани становится прозрачным, когда липиды начинают извлекаться в процессе обезвоживания. Следовательно, оценки размера очищенных тканей должны быть интерпретированы с осторожностью. Тем не менее, сравнение изменений в размерах адипоцитов или длине сосуда между тканями, полученными от мыши с различными генотипами и/или представленными различным условиям окружающей среды,остается информативным 11. Последнее ограничение связано с большим объемом всей жировой ткани мыши или большого хирургического образца жировой ткани человека. Действительно, хотя протокол идеально приспособлен для очищения этих больших образцов, визуализация целого органа является сложной задачей с конфокального микроскопа. Стратегия преодоления этого вопроса и использования всего потенциала всей процедуры очистки органов заключается в приобретении 3D-карты низкого увеличения всего органа с помощью 4x цели, а также в выборе конкретных областей, случайно рассеянных в тканях, где можно приобрести более высокие 3D-изображения с помощью 20-х междугородной цели. Установка "высокого увеличения" позволяет изображения объема ткани около 45 мм3 (4,7 х 4,7 х 2 мм). Хотя этот объем ограничен по сравнению с объемом всего органа (0,5 до более чем 4см 3),повторение приобретений в нескольких положениях в тканях позволяет получить хорошую выборку ткани на клеточном к субклеточному разрешению. Обратите внимание, что визуализация больших тканей будет генерировать значительное количество данных изображений, которые необходимо будет хранить.
Процедура имеет значительные различия по сравнению с методами, которые ранее были описаны для очищения жировойткани 14,30. Прежде всего, в отличие от AdipoClear, который использует метанол, дихлорметан, и dibenzylether14, метод, представленный здесь использует этанол для обезвоживания и метил салицилата для очистки. Таким образом, процедура является более безопасной, поскольку она использует менее токсичные растворители очистки, которые часто используются пищевой / пищевой промышленности обработки (этанол и метилсалицилат), по сравнению с высокой токсичностью дихлорметана, метанола и дибензилетера. Более того, подготовка ткани по протоколу на два дня быстрее протокола AdipoClear14. Совсем недавно, другой метод был предложен Ли и коллегами, чтобы очистить кусочки жировой ткани, погружая их в глицерол30. Этот протокол очень прост даже по сравнению с этой процедурой, и качество изображения хорошо даже при высоком увеличении. Тем не менее, этот протокол очистки работает эффективно только при использовании 2 мм3 жировой ткани штук. Раздел ткани в эти крошечные образцы до процедуры очистки предотвращает один из изображений объемов ткани больше, чем 2мм 3 даже при низком увеличении. Процедура, представленная здесь позволяет отображение всей ткани в 3D при низком увеличении и приобретение 3D стеки изображений около 45 мм3 в нескольких известных позиций в целом очищенной жировой ткани при высоком увеличении.
Эта процедура может иметь несколько будущих приложений. Как и в любом другом методе, описанная здесь процедура может быть упрощена и/или дополнительно оптимизирована. Интересный шаг вперед для процедуры может исходить от сочетания процесса очистки, мы описали, с дополнительными подходами изображения. Например, конкретные установки изображений, такие как оптическая проекционная томография (ОПТ), микроскопия Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF), телескопия селективного плана освещения (SPIM) или микроскопия стимулируемого истощения выбросов (STED), в принципе совместимы с процедурой, хотя это ограничит ее применимость теми лабораториями, которые оснащены этими системами. Кроме того, используя цель с высоким числовым индексом диафрагмы и системой приобретения, которая способна приобретать сотни изображений в секунду, которая находится во многих лабораториях, можно было бы выполнить анализ супер-разрешения с помощью Super Resolution Radial Fluctuations (SRRF) после обработки анализа изображений freeware31. Интересно, что классические фторхромы адаптированы для анализа SRRF, который позволил бы 3D-анализ супер-разрешения всего человека и мыши белых жировых тканей.
Многие важные шаги в протоколе связаны с обработкой тканей до самой очистки. Прежде всего, а что касается классического гистологического анализа, то этап фиксации имеет основополагающее значение. В случае слабой фиксации структурные особенности не сохраняются, в то время как расширенная фиксация приводит к перекрестному и блокированию конкретных антигенных участков и последующему не однородному иммуноокрашиванию. Другим чувствительным шагом является окрашивание ткани, которая представляет собой несколько критических моментов, которые мы опишем ниже. Во-первых, антитела должны быть проверены путем тестирования их на криостат разделов, чтобы подтвердить, что они являются функциональными и определить их оптимальную концентрацию. Окончательная концентрация, используемая для процедуры очистки, в десять раз превышает оптимальную концентрацию криоста. Во-вторых, время инкубации также имеет решающее значение из-за размера ткани. Слишком короткое время инкубации приведет к слабому или не однородному иммуностению (например, правильное окрашивание на периферии ткани, но без внутреннего окрашивания). Аналогичным образом, стиральные шаги, которые являются слишком короткими, предотвратит неспецифически связанные антитела от удаления из ткани, что приводит к неспецифическому окрашиваниям. На наш опыт, расширенная инкубация ткани антителами не ухудшает окрашивание. Поэтому мы настоятельно рекомендуем длительные инкубационые и стиральные периоды. В-третьих, выбор фторхрома должен быть адаптирован к сигналу интереса. В образцах тканей в целом, и особенно белой жировой ткани, несуществельная автофлуоресценция обнаруживается на 488 нм и 555 нм. Для высоко выраженных белков это не проблема, и окрашивание будет хорошо работать в этих каналах. Однако для белков с низкой экспрессией мы настоятельно рекомендуем использовать крайне красные фторхромы. Для очистки, Есть нет критических шагов, поскольку методология очень проста. Имейте в виду, что метилсалицилат не совместим с пластиковыми материалами, поэтому мы рекомендуем стеклянные бутылки для очистки шаги и металлическая камера оснащена стеклянным дном для выполнения изображений. Альтернативы для этой монтажной процедуры существуют с использованием i) нормального стеклянного слайда, зубной смолы и стеклянной крышки (для создания небольшой стеклянной камеры), или ii) стеклянной чашки Петри (для вертикальных установок микроскопа).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана INSERM, Лазурным университетом, и гранты От Французского национального исследовательского агентства (ANR) через Инвестиции в будущее Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), программа UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) через Академию 2 "Комплексы Системеса" и Академия 4 "Комплекс и диверсификация дю Вивант", Фонд за Recherche M'dical (Кипе FRM DE-20180839587), и Программа молодых следователей j.G. (ANR18-CE14-0035-01-01-ГИЛЛЕРОН). Мы также благодарим Основной фонд визуализации C3M, финансируемый Департаментом По делам Альп-морей и РКА, который также поддерживается Микроскопией IBISA и Платформой изображений Лазурный берег (MICA). Мы благодарим Марион Дусзо за техническую помощь в подготовке тканей. Мы благодарим Эбби Каттрис, Международную научную видимость UCA, за доказательство прочтения рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
