Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Отслеживание индуцированного биспецифическими антителами трафика Т-клеток с использованием Т-клеток человека, трансдуцированных люциферазой

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Здесь мы описываем метод трансдукции Т-клеток человека люциферазой для облегчения отслеживания in vivo индуцированного биспецифическими антителами транспорта Т-клеток к опухолям в исследованиях для оценки противоопухолевой эффективности и механизма биспецифических антител, вовлекающих Т-клетки.

Abstract

Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), находятся на различных стадиях доклинической разработки и клинических испытаний на солидные опухоли. Такие факторы, как валентность, пространственное расположение, междоменное расстояние и мутации Fc, влияют на противоопухолевую эффективность этих методов лечения, обычно влияя на самонахождение Т-клеток в опухолях, что остается серьезной проблемой. Здесь мы описываем метод трансдукции активированных Т-клеток человека люциферазой, позволяющий in vivo отслеживать Т-клетки во время исследований терапии T-BsAb. Способность T-BsAb перенаправлять Т-клетки на опухоли может быть количественно оценена в несколько моментов времени во время лечения, что позволяет исследователям коррелировать противоопухолевую эффективность T-BsAbs и других вмешательств с персистенцией Т-клеток в опухолях. Этот метод избавляет от необходимости приносить в жертву животных во время лечения для гистологической оценки инфильтрации Т-клеток и может повторяться в несколько моментов времени для определения кинетики торговли Т-клетками во время и после лечения.

Introduction

Биспецифические антитела, вовлекающие Т-клетки (T-BsAbs), представляют собой сконструированные антитела, используемые для обеспечения искусственной специфичности к поликлональным Т-клеткам путем вовлечения Т-клеток через одно связывающее плечо и опухолевого антигена через другое связывающее звено. Эта технология была успешно применена к гематологическим раковым заболеваниям (блинатумомаб1, нацеленный на CD19), и многочисленные T-BsAb находятся в доклинической и клинической разработке для различных солидных опухолей2. T-BsAb вовлекают поликлональные Т-клетки независимым от основного комплекса гистосовместимости (MHC) образом, и поэтому даже опухоли, которые подавляют лейкоцитарные антигены человека (HLA), восприимчивы к этому типу терапии 3,4. T-BsAb были разработаны в десятках различных форматов, с различиями в валентности и пространственном расположении плеч связывания Т-клеток и опухоли, междоменных расстояниях и включении Fc-домена, который влияет на период полувыведения и может индуцировать эффекторные функции, если они присутствуют5. Предыдущая работа в нашей лаборатории показала, что эти факторы значительно влияют на противоопухолевую эффективность T-BsAbs, с 1000-кратными различиями в потенции6. В ходе этой работы мы определили формат IgG-[L]-scFv как идеальную платформу для T-BsAb (см. Раздел «Репрезентативные результаты» для получения более подробной информации о форматах T-BsAb) и применили эту платформу к мишеням, включая GD2 (нейробластома), HER2 (рак молочной железы и остеосаркома), GPA33 (колоректальный рак), STEAP1 (саркома Юинга), CD19 (злокачественные новообразования В-клеток) и CD33 (злокачественные новообразования В-клеток)7, 8,9,10,11,12,13.

Одной из основных проблем для успешного внедрения терапии T-BsAb в солидных опухолях является преодоление иммуносупрессивного микроокружения опухоли (TME) для стимулирования транспортировки Т-клеток к опухолям14. Факторы, влияющие на эффективность T-BsAb, описанные выше, оказывают значительное влияние на способность T-BsAb эффективно индуцировать самонаведение Т-клеток к опухолям, но этот эффект трудно оценить в системе in vivo в режиме реального времени. Эта рукопись содержит подробное описание использования трансдуцированных люциферазой Т-клеток в доклинических исследованиях T-BsAb для оценки трафика Т-клеток в различные ткани на экспериментальных моделях мышей с ослабленным иммунитетом во время лечения. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить средства для оценки инфильтрации Т-клеток в опухолях и других тканях, а также понимание кинетики и персистенции Т-клеток в режиме реального времени без необходимости приносить в жертву животных во время лечения. Для растущего числа исследователей, специализирующихся на клеточной иммунотерапии, способность отслеживать Т-клетки in vivo на доклинических моделях животных имеет решающее значение. Мы стремимся предоставить тщательное, подробное описание метода, который мы использовали для отслеживания Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, чтобы другие исследователи могли легко воспроизвести этот метод.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующие процедуры были оценены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Memorial Sloan Kettering.

1. Трансфекция 293Т-клеток люциферазой и сбор вирусной надосадочной жидкости

  1. Культура клеток 293Т
    1. Приготовьте среду, добавив в литр DMEM по 110 мл инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 11 мл пенициллина-стрептомицина.
    2. Разморозьте 5 x 106 ячеек 293T и перенесите их в колбу T175 с подготовленным носителем, как описано выше.
    3. Разделите клетки 293T 1:10 каждые 3 дня в течение 6 дней. Не допускайте, чтобы клетки сливались более чем на 90%.
  2. Трансфекция 293Т-клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие количества реагентов рассчитаны для трансфекции одной колбы T175 из 293Т-клеток. Отрегулируйте соответствующим образом, если необходимо преобразовать больше колб.
    1. Перенесите 1,5 мл среды в каждую из двух пробирок по 50 мл с помощью пипетки. В одну пробирку добавьте 10 мкг плазмиды VSV-G, 20 мкг Gag/pol и 20 мкг плазмиды люциферазы красного томата-щелкуна TD (CBR-TDR) и перемешайте. В другую пробирку добавьте 100 мкл реагента для трансфекции ДНК in vitro и перемешайте. Инкубируйте обе пробирки при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все плазмиды, описанные в этой рукописи, были предоставлены доктором Владимиром Пономаревым.
    2. Перенесите среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro , по каплям в пробирку, содержащую плазмиды ДНК (в течение примерно 30 с), и аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать при РТ в течение 20 мин.
    3. Во время этой 20-минутной инкубации отделяют клетки 293T, добавляя 5-10 мл 0,05% трипсина. После того, как клетки отсоединились, добавьте 10 мл среды и центрифугу при 800 x g в течение 5 мин. Ресуспендируют клетки в 1,5 мл среды.
    4. Добавьте среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro и плазмиды ДНК, в клетки 293T и инкубируйте при 37 ° C в течение 30 мин.
    5. Переложите в колбу T175 и добавьте 18 мл среды. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи.
    6. На следующий день тщательно аспирируйте среду стеклянной пипеткой, не отрывая клетки. Замените 18 мл свежего носителя. Инкубировать при 37 °C в течение ночи в инкубаторе.
  3. Заготовка вирусной надосадочной жидкости
    1. Удалите вирусную надосадочную жидкость с помощью пипетки, поставленной на лед. Центрифугу при 800 x g в течение 5 мин для гранулирования клеток и мусора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная гранула большая, клетки, вероятно, были разрушены из колбы при удалении надосадочной жидкости. Эти ячейки могут быть снова помещены в новую колбу со свежим носителем.
    2. Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,22 мкм.
    3. Немедленно используйте вирусную надосадочную жидкость. Храните его на льду или при температуре 4 ° C до 24 часов или заморозьте при температуре -80 ° C для длительного хранения.

2. Экспансия и трансдукция активированных Т-клеток человека люциферазой

  1. Активация Т-клеток человека in vitro
    1. Промойте шарики, добавив 10 мл фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), в стерильную пробирку объемом 15 мл, добавив шарики (один шарик на две Т-клетки), поместив в магнитную стойку на 2 минуты и отсосав PBS.
    2. Приготовьте среду, как описано на шаге 1.1.1, затем добавьте IL-2 до конечной концентрации 30 МЕ/мл и добавьте промытые шарики. Сделайте 2,5 мл среды на каждые два миллиона Т-клеток, которые будут активированы.
    3. Подсчитайте Т-клетки (свежеочищенные или ранее очищенные, замороженные, размороженные и промытые) с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим. Добавьте Т-клетки в среду, приготовленную на шаге 2.1.2, и осторожно переверните пробирку для перемешивания. Т-клетки будут расширяться как минимум в 20 раз в зависимости от источника и общего состояния клеток. Определите количество Т-клеток для активации, вычислив количество, необходимое для лечения мышей, и разделив на 20. Здесь на основе предварительных экспериментов было использовано 20 х 106 Т-клеток на мышь.
    4. Планшет 2,5 мл среды, содержащей два миллиона Т-клеток, шариков и IL-2 в каждой лунке 24-луночной пластины для культивирования тканей. Культивируют при 37 °С в увлажненном 5% инкубатореСО2 .
    5. Исследуйте Т-клетки под 20-кратным микроскопом каждый день в течение следующих 3 дней, чтобы определить, когда проводить трансдукцию люциферазой. Клетки готовы, когда они слипаются и истощают среду, превращая ее из красно-розовой в светло-оранжевую.
  2. Приготовление ретронектиновых пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ретронектин используется для покрытия пластин, используемых в трансдукции, поскольку он усиливает трансдукциюгенов 15.
    1. Добавьте 2 мл 20 мкг/мл ретронектина в PBS в лунку необработанной 6-луночной пластины. Инкубировать в течение 2 ч при RT или 1 ч при 37 °C. На каждые два миллиона Т-клеток требуется одна лунка, покрытая ретронектином.
    2. Аспирируйте ретронектин, не царапая дно тарелки.
    3. Добавьте 3 мл 2% BSA в PBS (стерильный фильтрованный) на лунку в 6-луночную пластину. Инкубировать в течение 30 мин при РТ.
  3. Спинокуляция
    1. Аспирируйте BSA, не царапая дно пластины.
    2. Промойте лунки один раз 3 мл PBS на лунку. Продолжайте или замените свежим PBS и оставьте тарелку закрытой при температуре 4 ° C на ночь.
    3. Добавьте 2 мл вирусной надосадочной жидкости CBR-TDR люциферазы (собранной на этапе 1.3) в лунку.
    4. Центрифуга при 1,240 x g в течение 90 мин при 32 °C.
  4. Трансдукция
    1. Подсчитайте Т-клетки.
    2. Аспирируйте вирусную надосадочную жидкость, не царапая дно пластины.
    3. Планшет два миллиона Т-клеток на лунку в 6 мл модифицированной среды Дульбекко Игла (DMEM), содержащей 30 МЕ / мл человеческого IL-2.
    4. Ежедневно исследуйте Т-клетки. Т-клетки готовы к расширению, когда они почти сливаются, обычно через 2 дня.
    5. Когда ячейки почти сливаются, аккуратно смойте их со дна тарелки с помощью пипетки и переложите каждую лунку в отдельную колбу T75. Добавьте 9 мл среды, чтобы получить в общей сложности 15 мл среды на колбу.
    6. На следующий день добавьте дополнительно 15 мл среды. Клетки должны быть готовы к введению мышам на следующий день после добавления среды. Подтвердите успешную трансдукцию, выполнив проточную цитометрию (конструкция люциферазы содержит флуорофор томата TD, который виден в канале PE)16.

3. Приживление Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, у мышей с ослабленным иммунитетом

  1. Подготовьте и подсчитайте Т-клетки для инъекции.
    1. Удалите Т-клетки из колб и посчитайте. Клетки готовы к инъекции, когда они расширяются в 20-30 раз, обычно к 7-му дню после активации.
    2. Центрифугируйте Т-клетки при 800 x g в течение 5 мин. Ресуспендировать в 2 мл среды и удалить шарики с помощью магнитной стойки.
    3. Для экспериментов, в которых Т-клетки будут вводиться отдельно от биспецифических антител, подсчитайте Т-клетки и ресуспендируйте так, чтобы окончательная концентрация составила 20 миллионов Т-клеток на 100 мкл среды. Перейдите к шагу 3.2. Для экспериментов с использованием Т-клеток ex vivo (EAT) перейдите к шагу 3.1.4.
    4. Для экспериментов с использованием Т-клеток, вооруженных ex vivo , подсчитайте Т-клетки и разделите их на отдельные пробирки по 1,5 мл для каждой группы, с 20 миллионами клеток на мышь. Например, если есть три группы по пять мышей в каждой, подготовьте три пробирки объемом 1,5 мл со 100 миллионами Т-клеток в каждой.
    5. Центрифугируйте пробирки по 1,5 мл в дозе 800 x g в течение 5 мин. Осторожно удалите носитель, не повреждая гранулы Т-клеток. Ресуспендировать не более чем в 50 мкл среды, содержащей биспецифические антитела. Инкубировать при РТ в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей экспериментов, проведенных в этом исследовании, использовались запатентованные биспецифические антитела IgG-[L]-scFv T-клеток, полученные в лаборатории. Для постановки Т-клеток используйте 5 мкг антител на 20 х 106 Т-клеток. Также могут быть использованы коммерчески доступные биспецифические антитела.
    6. Смойте излишки антител, добавив 1,450 мкл среды в каждую пробирку. Центрифугу при 800 x g в течение 5 мин, тщательно аспирируют среду и ресуспендируют в концентрации 20 миллионов вооруженных Т-клеток на 100 мкл среды.
  2. Инъекция и приживление мышей
    1. Анестезируют мышей в камере, поставляющей 3,5% (об./об.) вдыхаемого изофлурана в 1 л/мин кислорода. Мышей полностью обезболивают, когда исчезает рефлекс отвода педали задних конечностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
    2. Используя иглу 26 G, введите 20 миллионов Т-клеток в 100 мкл среды ретроорбитально на мышь.
    3. Вводят 1,000 U рекомбинантного IL-2 подкожно для поддержки выживания Т-клеток in vivo.
    4. Вводят биспецифические антитела ретроорбитально (в глаз, не используемый для инъекции Т-клеток) или внутрибрюшинно. Дайте мышам оправиться от анестезии и вернуться в свои клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, здесь использовались запатентованные антитела, которые были сгенерированы в лаборатории, но вместо них можно было использовать коммерчески доступные антитела. В экспериментах здесь вводили 0,3-10 мкг антител на мышь на дозу. Антитела вводили два раза в неделю в течение 3-4 недель.

4. Визуализация in vivo мышей, привитых Т-клетками, трансдуцированными люциферазой

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в день визуализации, который не обязательно совпадает с днем введения Т-клеток и/или антител мышам. Как правило, мы выполняем визуализацию через 24 часа после введения Т-клеток, трансдуцированных люциферазой.

  1. Приготовление D-люциферина
    1. Растворите 1 г D-люциферина в 33,3 мл стерильного PBS (конечная концентрация: 30 мг / мл).
    2. Аликвотируйте растворенный D-люциферин в микроцентрифужные пробирки объемом 33 x 1,5 мл и держите пробирки при -20 ° C.
    3. В день визуализации разморозьте достаточное количество аликвот 30 мг / мл D-люциферина для количества животных, подлежащих визуализации. Одной трубки хватает на 10 животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно заморозьте оставшийся D-люциферин после использования. D-люциферин стабилен в течение как минимум пяти циклов замораживания/оттаивания.
  2. Введение D-люциферина мышам
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением D-люциферина мышам откройте программное обеспечение для визуализации и инициализируйте систему. Камере может потребоваться несколько минут, чтобы остыть, и это должно быть сделано до того, как мышам будет введен D-люциферин, чтобы гарантировать, что визуализация может произойти через 5 минут после введения субстрата.
    1. Анестезируйте до пяти мышей в камере, обеспечивающей 3,5% (об./об.) вдыхаемого изофлурана в 1 л/мин кислорода. Мышей полностью обезболивают, когда исчезает рефлекс отвода педали задних конечностей.
    2. После того, как мыши будут полностью анестезированы, введите 100 мкл 30 мг / мл D-люциферина на мышь (3 мг на мышь) путем ретроорбитальной инъекции иглой 26 G. Представьте себе эту группу мышей, прежде чем вводить D-люциферин следующей группе. Поместите следующую группу мышей в камеру изофлурана для анестезии, в то время как предыдущая группа будет визуализирована.
  3. Визуализация Т-клеток, трансдуцированных люциферазой
    1. Переместите анестезированных мышей в светонепроницаемую камеру тепловизора и продолжайте вводить 3% изофлурана со скоростью 0,5 л/мин. Положите мышей на бок так, чтобы бок, несущий ксенотрансплантат, был обращен вверх к камере. Сделайте еще один набор изображений с мышами в положении лежа на спине, чтобы оценить присутствие Т-клеток в легких.
    2. С помощью панели управления сбором данных выберите « Люминесцентный», « Фотография» и «Наложение». Установите время экспозиции на авто, биннинг на среднее и F / Stop на 1. Получение изображений. После первого изображения установите время экспозиции, соответствующее тому, которое было автоматически рассчитано для первого изображения, чтобы последующие изображения можно было сравнивать напрямую. Может быть полезно снимать изображения с несколькими временами экспозиции, чтобы определить оптимальное время экспозиции для достижения самого яркого сигнала без насыщенности пикселей.
    3. Удалите мышей из изофлурана, вернитесь в их клетки и наблюдайте, пока они не проснутся и не начнут передвигаться.
    4. Повторяйте шаги, начиная с шага 4.2.1, до тех пор, пока не будут созданы образы всех групп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как описано на шаге 4.3, мыши могут быть ориентированы в разных положениях во время визуализации для оценки присутствия Т-клеток в различных тканях. Положение лежа на спине позволяет оценить наличие Т-клеток в легких, что является обычным явлением в ранние моменты времени после инъекции. Боковое позиционирование подкожного ксенотрансплантата вверх используется для наилучшей оценки трафика Т-клеток в опухоль. Самки мышей C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac использовались для всех экспериментов, описанных в этой рукописи. На рисунке 1 показаны изображения из эксперимента, в котором мышей, несущих GD2-положительные ксенотрансплантаты, лечили либо трансдуцированными люциферазой Т-клетками, вооруженными ex vivo GD2 BsAb, либо Т-клетками, трансдуцированными люциферазой, и GD2 BsAb, вводимыми отдельно17. На рисунке 1А показано, что вооруженные Т-клетки доставляются в опухоль быстрее, чем невооруженные Т-клетки (рис. 1B), покидая легкие на 2 дня раньше. На рисунке 1С показана количественная оценка этого явления. На рисунке 1E-G показано, что можно контролировать трафик Т-клеток в течение как минимум 28 дней после инъекции Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, что позволяет исследователям отслеживать самонахождение и персистенцию Т-клеток на протяжении всего курса лечения, в отличие от других методов, таких как иммуногистохимия (ИГХ), которые позволяют сделать только снимок инфильтрации Т-клеток.

Не имея возможности оценить торговлю Т-клетками in vivo, исследователи, тестирующие T-BsAb, не могут определить, проникают ли Т-клетки и сохраняются ли они в опухолях во время лечения. Если лечение терпит неудачу, без жертвования животными и выполнения ИГХ, может быть трудно или невозможно узнать, была ли неудача вызвана отсутствием торговли Т-клетками, персистенцией, истощением Т-клеток или какой-либо другой причиной. На рисунке 2A-C показан эксперимент, в котором мышей, несущих ксенотрансплантаты, полученные от пациентов с раком молочной железы, обрабатывали трансдуцированными люциферазой человеческими Т-клетками и BsAb, нацеленными на HER2, несущими различные мутации, чтобы заставить замолчать функции Fc7. На рисунке 2C показано, что лечение HER2 BsAb с незаглушенным Fc не влияло на рост опухоли по сравнению с контрольным BsAb, тогда как лечение HER2 BsAb, содержащими мутацию N297A, отдельно или в сочетании с мутацией K322A, могло полностью остановить рост опухоли. На рисунках 2А и 1В показано, что в группах с мутациями молчания люминесцентный сигнал Т-клеток достиг более высокого пика на 3-й день после инъекции и сохранялся на более высоком уровне по сравнению с контрольным BsAb и неглушащим HER2 BsAb. Последующие эксперименты показали, что у мышей, получавших Т-клетки и BsAb с неглушащими Fcs, Т-клетки в периваскулярных областях легких были окружены мышиными нейтрофилами и макрофагами, что свидетельствует о Fc-зависимой секвестрации BsAb-связанных Т-клеток, которая предотвращает миграцию в опухоль. Проонкогенный эффект опухолевидных М2-поляризованных макрофагов хорошо описан. На рисунке 3A, B показано, что у мышей, несущих ксенотрансплантаты, полученные от пациентов с нейробластомой (PDX), истощение Ly6c-положительных макрофагов значительно увеличивает самонахождение Т-клеток в опухолях, что приводит к снижению роста опухоли и увеличению выживаемости (рис. 3C)18. Этот эффект еще более выражен при остеосаркоме PDX (рис. 3D).

В естественных условиях Отслеживание Т-клеток также позволяет исследователям отслеживать, как на кинетику трафика Т-клеток влияют другие переменные в инженерии антител, включая структурную конфигурацию. Как описано во введении к этой статье, предыдущая работа в нашей лаборатории подчеркнула важность бивалентности и цис-ориентации рук, связывающих опухоль и Т-клетки, для эффективности BsAb in vivo . На рисунке 4 показано, что среди панели BsAb, нацеленных на опухолевый антиген STEAP1 (рис. 4A), формат IgG-[L]-scFv приводил к значительно большей инфильтрации Т-клеток на 6-й день после первой дозы Т-клеток, которая сохранялась в течение всего периода лечения (рис. 4C)10. Это явление не было предсказано анализами цитотоксичности in vitro (рис. 4B), что подчеркивает важность подтверждения результатов in vitro на моделях in vivo .

Figure 1
Рисунок 1: Вооруженные Т-клетки демонстрируют более быструю кинетику самонаведения опухоли, чем невооруженные Т-клетки, направленные на BsAb, быстро обходя секвестрацию легких. Т-клетки, трансдуцированные люциферазой, были расширены и вооружены BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EATs (10 мкг GD2-BsAb/2×10, 7 Т-клеток) или Luc(+) невооруженные Т-клетки (2 x 10,7 клеток) с GD2-BsAb или без него (10 мкг) вводили внутривенно мышам, несущим GD2-положительную нейробластому PDX, когда средний объем опухоли достигал 100мм3. (A) Биолюминесцентные изображения транспортировки GD2-EAT в опухоли. (B) Биолюминесцентные изображения невооруженного трафика Т-клеток, направленного на GD2 BsAb, в опухоли в течение нескольких дней. (C) Количественное определение инфильтрации Т-клеток в опухоли с течением времени, измеренное с помощью биолюминесценции (n = 5 мышей / группа), выраженной как общий поток или сияние (фотоны / с) на пиксель, интегрированный по контуру опухоли (ROI). (D) Кривые роста опухоли у отдельных мышей, получавших GD2-EAT, GD2-BsAb плюс невооруженные Т-клетки или невооруженные Т-клетки. Чтобы проверить персистенцию in vivo целевых антиген-специфических EAT, Luc (+) GD2-EAT (вооруженные 10 мкг GD2-BsAb / 2×10 7 Т-клеток) или Luc (+) HER2-EAT (10 мкг HER2-BsAb / 2×107 Т-клеток) вводили внутривенно мышам, несущим остеосаркому TEOS1C PDX. Две дополнительные дозы нелюциферазных трансдуцированных GD2-EAT или HER2-EAT вводили на 7-й и 14-й день. (E) Количественное определение биолюминесценции Luc (+) EAT в опухолях после лечения. (F) Кривые роста опухоли у отдельных мышей, получавших GD2-EAT, HER2-EATs или невооруженные Т-клетки или без лечения. (G) Биолюминесцентные изображения Luc (+) GD2-EAT (верхний) или Luc (+) HER2-EAT (нижний) в опухолях с течением времени. Биолюминесценция Luc (+) EATs была обнаружена в течение 28 дней после инъекции. Сокращения: EATs = Т-клетки, вооруженные ex vivo; ROI = регион интереса. Столбцы погрешности указывают на стандартную погрешность среднего значения. Эта цифра была изменена по сравнению с Park et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Торговля Т-клетками в HER2-положительный рак молочной железы человека PDX у мышей DKO. (A) Репрезентативные биолюминесцентные изображения торговли Т-клетками. (B) Количественная оценка трафика Т-клеток в опухоли с течением времени с помощью биолюминесценции (n = 5 мышей / группа), выраженной как общий поток или сияние (фотоны / с) в каждом пикселе, интегрированном по всему контуру опухоли (ROI). (C) HER2-положительный рост PDX (M37) рака молочной железы (n = 5 мышей / группа) после лечения Ctrl BsAb, HER2 BsAb и его мутантами Fc. Показанные результаты являются репрезентативными результатами, по крайней мере, трех независимых экспериментов. Значимые различия были рассчитаны на основе площади под кривой (AUC). Столбцы погрешности указывают на стандартную погрешность среднего значения. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние истощения моноцитов на направленный трафик Т-клеток BsAb и противоопухолевый ответ in vivo. (A) Трансдуцированные люциферазой Т-клетки (Luc (+) Т-клетки) или трансдуцированные люциферазой Т-клетки GD2-BsAb (Luc (+) GD2-EATs) вводили антитела против Ly6C мышам, несущим ксенотрансплантат, полученный от пациента с нейробластомой (PDX). (B) Мониторинг биолюминесценции в очагах поражения опухоли. Биолюминесцентные изображения на 7-й день и количественная оценка биолюминесценции в очагах поражения опухоли. (C) Противоопухолевый ответ in vivo GD2-EATs с антителами против Ly6C был протестирован против нейробластомы PDX. (D) Противоопухолевый эффект in vivo GD2-EATs с антителами против Ly6C был протестирован против PDX остеосаркомы, и была проанализирована долгосрочная выживаемость. Столбцы погрешности указывают на стандартную погрешность среднего значения. Противоопухолевый эффект in vivo сравнивали с помощью анализа AUC и кривой выживаемости. Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, количественно определяли с использованием AUC биолюминесценции. Различия между выборками, указанными на рисунке, были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента для двух наборов данных и одностороннего ANOVA с тестом Тьюки post hoc для трех или более наборов данных. * p < 0,05; ** < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Эта цифра была изменена по сравнению с Park et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Противоопухолевая активность биспецифического антитела против STEAP1 Т-клеток. А) Схематическое изображение шести структурных форматов STEAP1 BsAb. (B) Антителозависимый анализ Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADTC) против клеточных линий EFT (TC32 ad TC71) с использованием различных форматов STEAP1 BsAb. Соотношение эффекторных и целевых (ET) клеток составляло 10:1. (C) Биолюминесцентная визуализация (BLI) Т-клеток Luc(+) с шестью различными форматами STEAP1 BsAb на (а) 6-й день и (б) 18-й день после лечения и количественное определение интенсивности биолюминесценции в поражениях опухоли. Трансдуцированные люциферазой Т-клетки (Luc (+) Т-клетки) были вооружены различными форматами STEAP1 BsAb (10 мкг STEAP1 BsAb / 2 x 107 Т-клеток) и вводили дополнительный IL-2 (1000 МЕ / доза) мышам, несущим EFT PDX (ES15a), и BLIfollowed. Сокращения: EFT = семейство опухолей саркомы Юинга; PDX = опухолевые ксенотрансплантаты, полученные от пациента; STEAP = шеститрансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы. Полосы погрешности показывают стандартную погрешность среднего значения. Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, были количественно определены путем вычисления площади под кривой биолюминесценции. Различия между выборками, показанными на рисунке, были проверены на статистическую значимость с использованием одностороннего ANOVA с тестом Тьюки post hoc. p < 0,0001. Эта цифра была изменена по сравнению с Lin et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В то время как B-BsAb блинатумомаб был одобрен для CD19-положительных гематологических злокачественных новообразований, успешное внедрение T-BsAb в солидных опухолях оказалось гораздо более трудным. Катумаксомаб, T-BsAb, направленный против молекулы адгезии эпителиальных клеток (EPCAM), был одобрен для лечения злокачественного асцита у пациентов с раком яичников, но впоследствии производство препарата было остановлено по коммерческим причинам19. Никакие другие T-BsAb не были одобрены для лечения солидных опухолей, что подчеркивает проблемы, связанные с этим типом терапии. Токсичность из-за синдрома высвобождения цитокинов (CRS) является распространенной проблемой, хотя с ней можно справиться с помощью стероидов и ингибиторов цитокинов. В дополнение к токсичности, отсутствие эффективности часто встречается в испытаниях T-BsAb для солидных опухолей. Индуцирование трафика и персистенции Т-клеток в опухоли оказалось трудным, вероятно, из-за различных иммуносупрессивных факторов в TME14. Однако даже доклинически часто неясно, почему T-BsAb, который хорошо работает in vitro , не может эффективно лечить опухоли in vivo.

Метод отслеживания Т-клеток in vivo в режиме реального времени, описанный в этой статье, полезен исследователям по нескольким причинам. Мониторинг самонаведения Т-клеток дает механистическое представление о том, почему определенные T-BsAb преуспевают или терпят неудачу, позволяя исследователям определить, когда начался трафик Т-клеток и как долго Т-клетки сохранялись в опухоли во время терапии. Метод может быть повторен в несколько временных точек, что позволяет исследователям построить график кинетики самонаведения Т-клеток в течение нескольких недель. (Репрезентативные результаты на рисунке 1 показывают, что Т-клетки сохраняются в опухоли не менее 28 дней.) Визуализация in vivo Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, также устраняет необходимость приносить в жертву животных во время лечения для гистологической оценки инфильтрации Т-клеток, снижая общую стоимость и количество животных, необходимых для эксперимента. Поскольку визуализация может повторяться так часто, как это необходимо, она также позволяет гораздо проще и тщательнее оценить кинетику самонаведения Т-клеток по сравнению с гистологическим анализом, который, по сути, является моментальным снимком одного момента времени, если только несколько животных не будут принесены в жертву в разные моменты времени.

Наиболее важным этапом этого метода является успешная трансдукция Т-клеток с конструкцией люциферазы. Неудачная трансдукция может привести к гибели Т-клеток или отсутствию сигнала люциферазы in vivo. Если Т-клетки не расширяются, как ожидалось, после трансдукции, может быть возможно уменьшить вирусный титр, с которым они трансдуцируются, чтобы уменьшить потенциальную токсичность от процесса трансдукции. Другой подход заключается в том, чтобы подождать еще один день между этапами экспансии Т-клеток, чтобы позволить Т-клеткам стать более сливающимися, прежде чем расширять их в более крупный сосуд для клеточной культуры. Перед введением Т-клеток мышам рекомендуется подтвердить успех трансдукции с помощью проточной цитометрии (для проверки экспрессии томатного репортера TD) или биолюминесцентного считывателя планшетов. Если трансдуцированные Т-клетки по-прежнему не видны с помощью биолюминесцентной визуализации, возможно, что количество Т-клеток слишком мало для обнаружения с помощью этого метода. Рабинович и др. описывают аналогичный метод с использованием усиленной люциферазы светлячков для обнаружения всего лишь 10 мышиных Т-клеток, который может быть реализован в ситуациях, требующих такого уровня чувствительности20.

Таким образом, отслеживание in vivo Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, является ценным инструментом для исследователей, изучающих T-BsAb в моделях рака у мышей с ослабленным иммунитетом. В дополнение к приложениям, рассмотренным выше, этот метод отслеживания Т-клеток был применен к Т-клеткам химерного антигенного рецептора (CAR) и предположительно может быть применен к сингенным моделям мышей, использующим адоптивно перенесенные Т-клетки, а также21. Мы надеемся, что эта стратегия будет полезна исследователям, разрабатывающим трансляционные T-BsAb, и приведет к увеличению успеха этих методов лечения у пациентов с солидными опухолями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NKC сообщает о получении коммерческих исследовательских грантов от Y-mAbs Therapeutics. NKC является изобретателем и владельцем выданных патентов, лицензированных центром MSK для Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand и Abpro-labs. MSK и NKC имеют финансовую заинтересованность в Y-mAb. NKC сообщает о получении опционов на акции от Eureka Therapeutics. HFG и MEC не раскрывают соответствующую информацию.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Владимира Пономарева за то, что он поделился конструкциями люциферазы, используемыми в экспериментах, описанных в разделе репрезентативных результатов этой статьи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Исследование рака выпуск 195 биспецифические антитела Т-клеточные активаторы люцифераза Т-клетки ксенотрансплантаты
Отслеживание индуцированного биспецифическими антителами трафика Т-клеток с использованием Т-клеток человека, трансдуцированных люциферазой
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter