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Cancer Research

Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion von humanen T-Zellen mit Luciferase, um die in vivo Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren in Studien zur Evaluierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit und des Mechanismus von T-Zell-bindenden bispezifischen Antikörpern zu ermöglichen.

Abstract

T-Zell-bindende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) befinden sich in verschiedenen Stadien der präklinischen Entwicklung und klinischen Erprobung solider Tumore. Faktoren wie Valenz, räumliche Anordnung, Interdomänendistanz und Fc-Mutationen beeinflussen die Anti-Tumor-Wirksamkeit dieser Therapien, in der Regel durch die Beeinflussung des Homings von T-Zellen zu Tumoren, was nach wie vor eine große Herausforderung darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion aktivierter humaner T-Zellen mit Luciferase, die es ermöglicht, in vivo T-Zellen während T-BsAb-Therapiestudien zu verfolgen. Die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zellen zu Tumoren umzuleiten, kann zu mehreren Zeitpunkten während der Behandlung quantitativ bewertet werden, was es den Forschern ermöglicht, die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs und anderen Interventionen mit der Persistenz von T-Zellen in Tumoren zu korrelieren. Diese Methode verringert die Notwendigkeit, Tiere während der Behandlung zu opfern, um die T-Zell-Infiltration histologisch zu beurteilen, und kann zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, um die Kinetik des T-Zell-Transports während und nach der Behandlung zu bestimmen.

Introduction

T-Zell-aktivierende bispezifische Antikörper (T-BsAbs) sind technisch hergestellte Antikörper, die verwendet werden, um polyklonalen T-Zellen eine künstliche Spezifität zu verleihen, indem T-Zellen durch einen Bindungsarm und ein Tumorantigen durch einen anderen Bindungsarm angegriffen werden. Diese Technologie wurde erfolgreich bei hämatologischen Krebserkrankungen eingesetzt (CD19-gerichtetes Blinatumomab1), und zahlreiche T-BsAbs befinden sich auch für eine Vielzahl solider Tumore in der präklinischen und klinischen Entwicklung2. T-BsAbs binden polyklonale T-Zellen auf eine vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) unabhängige Weise, und daher sind auch Tumore, die humane Leukozytenantigene (HLAs) herunterregulieren, für diese Artder Therapie anfällig 3,4. T-BsAbs wurden in Dutzenden von verschiedenen Formaten entwickelt, mit Unterschieden in der Wertigkeit und räumlichen Anordnung der T-Zell- und Tumorbindungsarme, den Interdomänenabständen und dem Einschluss einer Fc-Domäne, die die Halbwertszeit beeinflusst und Effektorfunktionen induzieren kann, falls vorhanden5. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass diese Faktoren die Anti-Tumor-Wirksamkeit von T-BsAbs signifikant beeinflussen, mit bis zu 1.000-fachen Unterschieden in der Potenz6. Durch diese Arbeit haben wir das IgG-[L]-scFv-Format als ideale Plattform für T-BsAbs identifiziert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für weitere Details zu T-BsAb-Formaten) und haben diese Plattform auf Ziele wie GD2 (Neuroblastom), HER2 (Brustkrebs und Osteosarkom), GPA33 (Darmkrebs), STEAP1 (Ewing-Sarkom), CD19 (B-Zell-Malignome) und CD33 (B-Zell-Malignome) angewendet7. 8,9,10,11,12,13.

Eine der größten Herausforderungen bei der erfolgreichen Implementierung der T-BsAb-Therapie bei soliden Tumoren ist die Überwindung einer immunsuppressiven Tumormikroumgebung (TME), die den Transport von T-Zellen zu Tumoren fördert14. Die oben beschriebenen Faktoren, die die Wirksamkeit von T-BsAb beeinflussen, haben einen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit von T-BsAbs, T-Zell-Homing zu Tumoren effektiv zu induzieren, aber dieser Effekt ist in einem In-vivo-System in Echtzeit schwer zu bewerten. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Verwendung von Luciferase-transduzierten T-Zellen in präklinischen Studien mit T-BsAbs zur Bewertung des T-Zell-Transports in verschiedene Gewebe in experimentellen immungeschwächten Mausmodellen während der Behandlung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Mittel zur Bewertung der T-Zell-Infiltration in Tumoren und anderen Geweben sowie einen Echtzeit-Einblick in die Kinetik und Persistenz von T-Zellen zu erhalten, ohne dass Tiere während der Behandlung geopfert werden müssen. Für die zunehmende Zahl von Forschern, die sich auf zelluläre Immuntherapien konzentrieren, ist die Fähigkeit, T-Zellen in vivo in präklinischen Tiermodellen zu verfolgen, von entscheidender Bedeutung. Unser Ziel ist es, eine gründliche, detaillierte Beschreibung der Methode zu liefern, die wir zur Verfolgung von Luciferase-transduzierten T-Zellen verwendet haben, damit andere Forscher diese Technik leicht replizieren können.

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Protocol

Die folgenden Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Memorial Sloan Kettering bewertet und genehmigt.

1. Transfektion von 293T-Zellen mit Luciferase und Entnahme des viralen Überstands

  1. Kultur von 293T-Zellen
    1. Bereiten Sie das Medium vor, indem Sie jeweils einem Liter DMEM Folgendes hinzufügen: 110 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS), 11 ml Penicillin-Streptomycin.
    2. 5 x 106 293T-Zellen auftauen und in einen T175-Kolben überführen, wobei das Medium wie oben beschrieben vorbereitet ist.
    3. Teilen Sie die 293T-Zellen 6 Tage lang alle 3 Tage im Verhältnis 1:10 auf. Lassen Sie die Zellen nicht zu mehr als 90 % zusammenfließen.
  2. Transfektion von 293T-Zellen
    HINWEIS: Die folgenden Mengen an Reagenzien werden für die Transfektion eines T175-Kolbens mit 293T-Zellen berechnet. Passen Sie entsprechend an, wenn mehr Kolben übertragen werden sollen.
    1. Übertragen Sie mit einer Pipette jeweils 1,5 ml Medium in jedes der beiden 50-ml-Röhrchen. In ein Röhrchen 10 μg VSV-G-Plasmid, 20 μg Knebel/pol und 20 μg Schnellkäfer-Luziferase-Plasmid der roten TD-Tomate (CBR-TDR) geben und mischen. In das andere Röhrchen 100 μl DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz geben und mischen. Inkubieren Sie beide Röhrchen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
      HINWEIS: Alle in diesem Manuskript beschriebenen Plasmide wurden von Dr. Vladimir Ponomarev zur Verfügung gestellt.
    2. Übertragen Sie das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz tropfenweise in das Röhrchen mit den DNA-Plasmiden (über ca. 30 s) und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette. Bei RT 20 Minuten inkubieren.
    3. Während dieser 20-minütigen Inkubation werden die 293T-Zellen durch Zugabe von 5-10 ml 0,05%igem Trypsin abgelöst. Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 10 ml Medium hinzu und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 800 x g . Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 ml Medium.
    4. Das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz und den DNA-Plasmiden wird in die 293T-Zellen gegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert.
    5. In einen T175-Kolben überführen und 18 ml Medium hinzufügen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
    6. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Glaspipette ab, ohne die Zellen zu lösen. Ersetzen Sie es durch 18 ml frisches Medium. Bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator inkubieren.
  3. Ernte des viralen Überstandes
    1. Entfernen Sie den Virusüberstand mit einer Pipette, die auf Eis gelegt wird. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 Minuten, um die Zellen und Ablagerungen zu pelletieren.
      HINWEIS: Wenn das Zellpellet groß ist, wurden die Zellen wahrscheinlich aus dem Kolben entfernt, als der Überstand entfernt wurde. Diese Zellen können in einem neuen Kolben mit frischen Medien wieder plattiert werden.
    2. Filtern Sie den viralen Überstand mit einem 0,22-μm-Filter.
    3. Verwenden Sie den viralen Überstand sofort. Bewahren Sie es bis zu 24 h auf Eis oder bei 4 °C auf oder frieren Sie es bei -80 ° C für die Langzeitlagerung ein.

2. Expansion und Transduktion von aktivierten humanen T-Zellen mit Luciferase

  1. Aktivierung humaner T-Zellen in vitro
    1. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in ein steriles 15-ml-Röhrchen geben, Perlen (eine Perle pro zwei T-Zellen) hinzufügen, 2 Minuten lang in ein Magnetgestell legen und das PBS absaugen.
    2. Bereiten Sie das Medium wie in Schritt 1.1.1 beschrieben vor, fügen Sie dann IL-2 zu einer Endkonzentration von 30 I.E./ml hinzu und fügen Sie die gewaschenen Kügelchen hinzu. Stellen Sie 2,5 ml Medium für jeweils zwei Millionen zu aktivierende T-Zellen her.
    3. Zählen Sie die T-Zellen (frisch gereinigt oder zuvor gereinigt, eingefroren, aufgetaut und gewaschen) mit einem Hämozytometer und einer Trypanblaufärbung. Fügen Sie T-Zellen zu dem in Schritt 2.1.2 vorbereiteten Medium hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Die T-Zellen dehnen sich mindestens 20x aus, abhängig von der Quelle und dem allgemeinen Gesundheitszustand der Zellen. Bestimmen Sie die Anzahl der zu aktivierenden T-Zellen, indem Sie die Anzahl berechnen, die für die Behandlung der Mäuse benötigt wird, und durch 20 teilen. Hier wurden auf Basis von Vorversuchen 20 x 106 T-Zellen pro Maus verwendet.
    4. Platte 2,5 ml Medien mit zwei Millionen T-Zellen, Beads und IL-2 in jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Kultur bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2 -Inkubator.
    5. Untersuchen Sie die T-Zellen in den nächsten 3 Tagen täglich unter einem 20-fachen Mikroskop, um zu bestimmen, wann sie mit Luciferase transduzieren müssen. Die Zellen sind fertig, wenn sie verklumpen und das Medium erschöpfen, indem sie es von rot/rosa zu hellorange färben.
  2. Herstellung von Retronektinplatten
    HINWEIS: Retronectin wird verwendet, um die bei der Transduktion verwendeten Platten zu beschichten, da es die Gentransduktion verbessert15.
    1. Geben Sie 2 ml 20 μg/ml Retronektin in PBS in eine Vertiefung einer unbehandelten 6-Well-Platte. 2 h bei RT oder 1 h bei 37 °C inkubieren. Für jeweils zwei Millionen zu transduzierende T-Zellen wird eine retronektinbeschichtete Vertiefung benötigt.
    2. Aspirieren Sie das Retronektin, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen.
    3. Fügen Sie 3 ml 2 % BSA in PBS (steril gefiltert) pro Vertiefung in die 6-Well-Platte hinzu. 30 min bei RT inkubieren.
  3. Spinokulation
    1. Saugen Sie den BSA ab, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen.
    2. Waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 3 ml PBS pro Vertiefung. Fahren Sie fort oder ersetzen Sie es durch frisches PBS und lassen Sie die Platte über Nacht zugedeckt bei 4 °C stehen.
    3. Fügen Sie 2 ml CBR-TDR-Luciferase-Virusüberstand (in Schritt 1.3 gesammelt) pro Vertiefung hinzu.
    4. Zentrifugieren bei 1.240 x g für 90 min bei 32 °C.
  4. Transduktion
    1. Zähle die T-Zellen.
    2. Aspirieren Sie den viralen Überstand, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen.
    3. Platte von zwei Millionen T-Zellen pro Well in 6 ml des modifizierten Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco, das 30 IU/ml humanes IL-2 enthält.
    4. Untersuchen Sie die T-Zellen täglich. Die T-Zellen sind bereit, expandiert zu werden, wenn sie fast konfluieren, in der Regel nach 2 Tagen.
    5. Wenn die Zellen fast konfluieren, waschen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette vom Boden der Platte ab und geben Sie jede Vertiefung in einen separaten T75-Kolben. Fügen Sie 9 ml Medium hinzu, um insgesamt 15 ml Medium pro Kolben zu erhalten.
    6. Fügen Sie am nächsten Tag weitere 15 ml Medium hinzu. Die Zellen sollten am Tag nach dieser Zugabe von Medien bereit sein, Mäusen zu injizieren. Bestätigen Sie die erfolgreiche Transduktion durch Durchführung einer Durchflusszytometrie (das Luciferase-Konstrukt enthält einen TD-Tomatenfluorophor, der im PE-Kanal sichtbar ist)16.

3. Transplantation von Luciferase-transduzierten T-Zellen in immungeschwächten Mäusen

  1. Bereiten Sie die T-Zellen für die Injektion vor und zählen Sie sie.
    1. Nehmen Sie die T-Zellen aus den Kolben und zählen Sie. Die Zellen sind bereit zur Injektion, wenn sie sich um das 20- bis 30-fache ausgedehnt haben, in der Regel am 7. Tag nach der Aktivierung.
    2. Zentrifugieren Sie die T-Zellen bei 800 x g für 5 min. Resuspendieren Sie die Perlen in 2 ml Medium und entfernen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell.
    3. Bei Experimenten, bei denen T-Zellen getrennt von bispezifischen Antikörpern injiziert werden, werden die T-Zellen gezählt und resuspendiert, so dass die Endkonzentration 20 Millionen T-Zellen pro 100 μl Medium beträgt. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort. Für Experimente mit ex vivo bewaffneten T-Zellen (EATs) fahren Sie mit Schritt 3.1.4 fort.
    4. Für Experimente mit ex vivo bewaffneten T-Zellen werden die T-Zellen gezählt und in einzelne 1,5-ml-Röhrchen für jede Gruppe mit 20 Millionen Zellen pro Maus aufgeteilt. Wenn es beispielsweise drei Gruppen zu je fünf Mäusen gibt, bereiten Sie drei 1,5-ml-Röhrchen mit jeweils 100 Millionen T-Zellen vor.
    5. Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen bei 800 x g für 5 Minuten. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, ohne das T-Zell-Pellet zu stören. Resuspendieren Sie in nicht mehr als 50 μl Medien, die die bispezifischen Antikörper enthalten. Bei RT 30 Minuten inkubieren.
      HINWEIS: Für die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden proprietäre IgG-[L]-scFv-T-Zell-aktivierende bispezifische Antikörper verwendet, die im Labor erzeugt wurden. Verwenden Sie für die T-Zell-Bewaffnung 5 μg Antikörper pro 20 x 106 T-Zellen. Auch kommerziell erhältliche bispezifische Antikörper könnten verwendet werden.
    6. Waschen Sie überschüssige Antikörper ab, indem Sie jedem Röhrchen 1.450 μl Medium hinzufügen. Bei 800 x g für 5 min zentrifugieren, das Medium vorsichtig absaugen und bei einer Konzentration von 20 Millionen bewaffneten T-Zellen pro 100 μl Medium resuspendieren.
  2. Injektion und Transplantation in Mäuse
    1. Anästhesieren Sie die Mäuse in einer Kammer, die 3,5 % (v/v) inhaliertes Isofluran in 1 l/min Sauerstoff zuführt. Die Mäuse werden vollständig betäubt, wenn der Rückzugsreflex der Hintergliedmaßenpedale verschwunden ist.
      Anmerkungen: Sorgen Sie während des gesamten Verfahrens für Wärmeunterstützung.
    2. Injizieren Sie mit einer 26-G-Nadel retroorbital 20 Millionen T-Zellen in 100 μl Medium pro Maus.
    3. Verabreichung von 1.000 U rekombinantem IL-2 subkutan zur Unterstützung des T-Zell-Überlebens in vivo.
    4. Verabreichen Sie die bispezifischen Antikörper retroorbital (in das Auge, das nicht für die T-Zell-Injektion verwendet wird) oder intraperitoneal. Lassen Sie die Mäuse sich von der Narkose erholen und in ihre Käfige zurückkehren.
      HINWEIS: Auch hier wurden proprietäre Antikörper verwendet, die im Labor erzeugt wurden, aber stattdessen könnten auch kommerziell erhältliche Antikörper verwendet werden. In den Experimenten wurden 0,3-10 μg Antikörper pro Maus und Dosis verabreicht. Die Antikörper wurden 3-4 Wochen lang zweimal pro Woche verabreicht.

4. In-vivo-Bildgebung von Mäusen, die mit Luciferase-transduzierten T-Zellen transplantiert wurden

HINWEIS: Dieser Schritt muss am Tag der Bildgebung durchgeführt werden, der nicht unbedingt am selben Tag liegt, an dem den Mäusen die T-Zellen und/oder Antikörper verabreicht werden. In der Regel führen wir 24 h nach Verabreichung der Luciferase-transduzierten T-Zellen eine Bildgebung durch.

  1. Herstellung von D-Luciferin
    1. 1 g D-Luciferin werden in 33,3 ml sterilem PBS gelöst (Endkonzentration: 30 mg/ml).
    2. Aliquotieren Sie das gelöste D-Luciferin in 33 x 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Röhrchen bei -20 °C.
    3. Tauen Sie am Tag der Bildgebung genügend Aliquots von 30 mg/ml D-Luciferin auf, um die Anzahl der abzubildenden Tiere zu erhöhen. Ein Röhrchen reicht für 10 Tiere.
      Anmerkungen: Frieren Sie das restliche D-Luciferin nach Gebrauch wieder ein. D-Luciferin ist für mindestens fünf Gefrier-/Auftauzyklen stabil.
  2. Verabreichung von D-Luciferin an Mäuse
    HINWEIS: Öffnen Sie vor der Verabreichung von D-Luciferin an die Mäuse die Bildgebungssoftware und initialisieren Sie das System. Das Abkühlen der Kamera kann mehrere Minuten dauern, und dies sollte vor der Injektion von D-Luciferin an die Mäuse erfolgen, um sicherzustellen, dass die Bildgebung 5 Minuten nach der Verabreichung des Substrats erfolgen kann.
    1. Anästhesieren Sie bis zu fünf Mäuse in einer Kammer mit 3,5 % (v/v) inhaliertem Isofluran in 1 l/min Sauerstoff. Die Mäuse werden vollständig betäubt, wenn der Rückzugsreflex der Hintergliedmaßenpedale verschwunden ist.
    2. Sobald die Mäuse vollständig betäubt sind, verabreichen Sie 100 μl 30 mg/ml D-Luciferin pro Maus (3 mg pro Maus) durch retroorbitale Injektion mit einer 26-G-Nadel. Stellen Sie sich diese Gruppe von Mäusen vor, bevor Sie der nächsten Gruppe D-Luciferin verabreichen. Legen Sie die nächste Gruppe von Mäusen in die Isoflurankammer, um sie zu betäuben, während die vorherige Gruppe abgebildet wird.
  3. Bildgebung von Luciferase-transduzierten T-Zellen
    1. Bringen Sie die betäubten Mäuse in die lichtdichte Kammer des Imagers und setzen Sie die Verabreichung von 3 % Isofluran bei 0,5 l/min fort. Legen Sie die Mäuse so auf die Seite, dass die Flanke, die das Xenotransplantat trägt, zur Kamera zeigt. Machen Sie eine weitere Reihe von Bildern mit den Mäusen in Rückenlage, um das Vorhandensein von T-Zellen in der Lunge zu bewerten.
    2. Wählen Sie in der Erfassungssteuerung die Optionen "Lumineszierend", " Foto" und " Überlagerung" aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch, das Binning auf mittel und F/Stop auf 1 ein. Erfassen Sie Bilder. Stellen Sie nach dem ersten Bild die Belichtungszeit so ein, dass sie mit der Belichtungszeit übereinstimmt, die automatisch für das erste Bild berechnet wurde, so dass nachfolgende Bilder direkt verglichen werden können. Es kann sinnvoll sein, Bilder mit mehreren Belichtungszeiten aufzunehmen, um die optimale Belichtungszeit zu bestimmen, um das hellste Signal ohne Pixelsättigung zu erzielen.
    3. Entfernen Sie die Mäuse aus Isofluran, kehren Sie in ihre Käfige zurück und beobachten Sie, bis sie wach und gehfähig sind.
    4. Wiederholen Sie die Schritte ab Schritt 4.2.1, bis alle Gruppen abgebildet wurden.

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Representative Results

Wie in Schritt 4.3 beschrieben, können Mäuse während der Bildgebung in verschiedenen Positionen orientiert werden, um das Vorhandensein von T-Zellen in verschiedenen Geweben zu beurteilen. Die Lagerung in Rückenlage ermöglicht die Beurteilung von T-Zellen in der Lunge, was zu frühen Zeitpunkten nach der Injektion üblich ist. Die laterale Positionierung mit dem subkutanen Xenotransplantat nach oben wird verwendet, um den T-Zelltransport zum Tumor am besten zu beurteilen. Für alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden weibliche C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac Mäuse verwendet. Abbildung 1 zeigt Bilder aus einem Experiment, in dem Mäuse mit GD2-positiven Xenotransplantaten entweder mit Luciferase-transduzierten T-Zellen behandelt wurden, die ex vivo mit einem GD2-BsAb oder Luciferase-transduzierten T-Zellen bewaffnet waren, und GD2-BsAb separat injiziert wurden17. Abbildung 1A zeigt, dass bewaffnete T-Zellen schneller zum Tumor transportiert wurden als unbewaffnete T-Zellen (Abbildung 1B) und die Lunge 2 Tage früher verließen. Abbildung 1C zeigt die Quantifizierung dieses Phänomens. Abbildung 1E-G zeigt, dass es möglich ist, den T-Zell-Transport für mindestens 28 Tage nach der Injektion der Luciferase-transduzierten T-Zellen zu überwachen, was es den Forschern ermöglicht, das Homing und die Persistenz von T-Zellen während des gesamten Behandlungsverlaufs zu verfolgen, im Gegensatz zu anderen Techniken wie der Immunhistochemie (IHC), die nur eine Momentaufnahme der T-Zell-Infiltration ermöglichen.

Ohne die Möglichkeit, den T-Zell-Transport in vivo zu beurteilen, können Forscher, die T-BsAbs testen, nicht feststellen, ob T-Zellen während der Behandlung in Tumore eindringen und dort persistieren. Wenn eine Behandlung fehlschlägt, ohne Tiere zu opfern und IHC durchzuführen, kann es schwierig oder unmöglich sein zu wissen, ob das Versagen auf einen Mangel an T-Zell-Transport, Persistenz, T-Zell-Erschöpfung oder eine andere Ursache zurückzuführen ist. Abbildung 2A-C zeigt ein Experiment, in dem Mäuse mit Xenotransplantaten, die von Brustkrebspatientinnen stammen, mit Luciferase-transduzierten humanen T-Zellen und HER2-gerichteten BsAbs behandelt wurden, die unterschiedliche Mutationen trugen, um Fc-Funktionen zum Schweigen zu bringen 7. Abbildung 2C zeigt, dass die Behandlung mit dem HER2-BsAb mit einem nicht stummgeschalteten Fs im Vergleich zu einem Kontroll-BsAb keinen Einfluss auf das Tumorwachstum hatte, während die Behandlung mit HER2-BsAbs, die eine N297A-Mutation allein oder in Kombination mit einer K322A-Mutation enthielten, das Tumorwachstum vollständig stoppen konnte. Abbildung 2A und Abbildung 1B zeigen, dass das Lumineszenzsignal der T-Zellen in Gruppen mit den Silencing-Mutationen am Tag 3 nach der Injektion einen höheren Höhepunkt erreichte und im Vergleich zu Kontroll-BsAb und nicht stummgeschaltetem HER2-BsAb auf einem höheren Niveau persistierte. Folgeexperimente zeigten, dass bei Mäusen, die mit T-Zellen und BsAbs mit nicht silenced Fcs behandelt wurden, die T-Zellen in perivaskulären Regionen der Lunge von murinen Neutrophilen und Makrophagen umgeben waren, was auf eine Fc-abhängige Sequestrierung der BsAb-gebundenen T-Zellen hindeutet, die die Migration in den Tumor verhindert. Die pro-tumorigene Wirkung von tumorresidenten M2-polarisierten Makrophagen ist gut beschrieben. Abbildung 3A,B zeigt, dass bei Mäusen, die von Neuroblastom-Patienten abgeleitete Xenotransplantate (PDXs) tragen, die Depletion von Ly6c-positiven Makrophagen das Homing von T-Zellen zu Tumoren signifikant erhöht, was zu einem verringerten Tumorwachstum und einem verlängerten Überleben führt (Abbildung 3C)18. Dieser Effekt ist bei Osteosarkom-PDXs noch ausgeprägter (Abbildung 3D).

Im lebenden Organismus Das T-Zell-Tracking ermöglicht es den Forschern auch, zu überwachen, wie die Kinetik des T-Zell-Transports durch andere Variablen bei der Antikörperentwicklung, einschließlich der strukturellen Konfiguration, beeinflusst wird. Wie in der Einleitung dieses Artikels beschrieben, unterstrichen frühere Arbeiten in unserem Labor die Bedeutung der Bivalenz und cis-Orientierung der Tumor- und T-Zell-bindenden Arme für die in vivo Wirksamkeit von BsAbs. Abbildung 4 zeigt, dass bei einer Gruppe von BsAbs, die auf das Tumorantigen STEAP1 abzielen (Abbildung 4A), das IgG-[L]-scFv-Format an Tag 6 nach der ersten Dosis von T-Zellen zu einer signifikant höheren T-Zell-Infiltration führte, die für die Dauer der Behandlung anhielt (Abbildung 4C)10. Dieses Phänomen wurde durch In-vitro-Zytotoxizitätsassays nicht vorhergesagt (Abbildung 4B), was die Bedeutung der Bestätigung von In-vitro-Ergebnissen in In-vivo-Modellen unterstreicht.

Figure 1
Abbildung 1: Bewaffnete T-Zellen zeigen eine schnellere Tumor-Homing-Kinetik als BsAb-gerichtete unbewaffnete T-Zellen, wodurch die Lungensequestrierung schnell umgangen wird. Luciferase-transduzierte T-Zellen wurden expandiert und mit BsAb (Luc(+) GD2-EATs bestückt). Luc(+) GD2-EATs (10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-Zellen) oder Luc(+) unbewaffnete T-Zellen (2 x 107 Zellen) mit oder ohne GD2-BsAb (10 μg) wurden GD2-positiven Neuroblastom-PDX-tragenden Mäusen intravenös verabreicht, wenn das durchschnittliche Tumorvolumen 100 mm erreichte3. (A) Biolumineszenzbilder von GD2-EATs, die in Tumore eingeschleust werden. (B) Biolumineszenzbilder von GD2 BsAb-gerichteten unbewaffneten T-Zell-Transporten in Tumore über Tage. (C) Quantifizierung der T-Zell-Infiltration in Tumore über die Zeit, gemessen durch Biolumineszenz (n = 5 Mäuse/Gruppe), ausgedrückt als Gesamtfluss oder Strahldichte (Photonen/s) pro Pixel, das über die Tumorkontur integriert ist (ROI). (D) Tumorwachstumskurven einzelner Mäuse, die mit GD2-EATs, GD2-BsAb plus unbewaffneten T-Zellen oder unbewaffneten T-Zellen behandelt wurden. Um die in vivo Persistenz von Zielantigen-spezifischen EATs zu testen, wurden Luc(+) GD2-EATs (bewaffnet mit 10 μg GD2-BsAb/2×107 T-Zellen) oder Luc(+) HER2-EATs (10 μg HER2-BsAb/2×107 T-Zellen) intravenös an TEOS1C-PDX-tragende Mäuse verabreicht. An Tag 7 und Tag 14 wurden zwei zusätzliche Dosen von GD2-EATs oder HER2-EATs verabreicht, die nicht mit Luciferase transduziert wurden. (E) Quantifizierung der Biolumineszenz von Luc(+) EATs in Tumoren nach Behandlung. (F) Tumorwachstumskurven einzelner Mäuse, die mit GD2-EATs, HER2-EATs oder unbewaffneten T-Zellen oder ohne Behandlung behandelt wurden. (G) Biolumineszenzbilder von Luc(+) GD2-EATs (oben) oder Luc(+) HER2-EATs (unten) in Tumoren im Zeitverlauf. Die Biolumineszenz von Luc(+)-EATs wurde über 28 Tage nach der Injektion nachgewiesen. Abkürzungen: EATs = ex vivo bewaffnete T-Zellen; ROI = Region of Interest. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Diese Zahl wurde von Park et al.17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: T-Zell-Transport in HER2-positives humanes Mammakarzinom PDX in DKO-Mäusen. (A) Repräsentative Biolumineszenzbilder des T-Zell-Transports. (B) Quantifizierung des T-Zell-Transports in Tumore im Laufe der Zeit durch Biolumineszenz (n = 5 Mäuse/Gruppe), ausgedrückt als Gesamtfluss oder Strahldichte (Photonen/s) in jedem Pixel, das über die gesamte Tumorkontur (ROI) integriert ist. (C) Wachstum von HER2-positivem Brustkrebs PDX (M37) (n = 5 Mäuse/Gruppe) nach Behandlung mit Ctrl BsAb, HER2 BsAb und seinen Fc-Mutanten. Bei den gezeigten Ergebnissen handelt es sich um repräsentative Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die signifikanten Differenzen wurden auf Basis der Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Diese Abbildung wurde von Wang et al.7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Auswirkungen der Monozytendepletion auf den BsAb-gerichteten T-Zelltransport und die In-vivo-Antitumorantwort. (A) Luciferase-transduzierte T-Zellen (Luc(+) T-Zellen) oder Luciferase-transduzierte GD2-BsAb-bewaffnete T-Zellen (Luc(+) GD2-EATs) wurden den Mäusen, die ein von Neuroblastompatienten abgeleitetes Xenotransplantat (PDX) trugen, mit Anti-Ly6C-Antikörpern verabreicht. (B) Die Biolumineszenz in den Läsionen des Tumors wurde überwacht. Die Biolumineszenzbilder an Tag 7 und Quantifizierung der Biolumineszenz in den Läsionen des Tumors. (C) Die In-vivo-Antitumorantwort von GD2-EATs mit Anti-Ly6C-Antikörpern wurde gegen Neuroblastom-PDXs getestet. (D) Die In-vivo-Antitumorwirkung von GD2-EATs mit Anti-Ly6C-Antikörpern wurde gegen Osteosarkom-PDXs getestet und das Langzeitüberleben analysiert. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Die In-vivo-Antitumorwirkung wurde durch die Analyse der AUC und der Überlebenskurve verglichen. Tumorinfiltrierende Lymphozyten wurden mit Hilfe der AUC der Biolumineszenz quantifiziert. Die Unterschiede zwischen den in der Abbildung angegebenen Stichproben wurden mit einem zweiseitigen Student-t-Test für zwei Datensätze und einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test für drei oder mehr Datensätze auf statistische Signifikanz getestet. * p < 0,05; ** p < 0,01; S. < 0,001; p < 0,0001. Diese Abbildung wurde von Park et al.18 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Anti-Tumor-Aktivitäten von anti-STEAP1 T-Zell-aktivierenden bispezifischen Antikörpern. (A) Schematische Darstellung der sechs Strukturformate von STEAP1 BsAb. (B) Antikörper-abhängiger T-Zell-vermittelter Zytotoxizitätstest (ADTC) gegen EFT-Zelllinien (TC32 und TC71) unter Verwendung verschiedener STEAP1-BsAb-Formate. Das Verhältnis von Effektor-zu-Ziel-Zellen (ET) betrug 10:1. (C) Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Luc(+)-T-Zellen, die mit sechs verschiedenen Formaten von STEAP1 BsAb an (a) Tag 6 und (b) Tag 18 nach der Behandlung bewaffnet waren, und Quantifizierung der Biolumineszenzintensität in den Läsionen des Tumors. Luciferase-transduzierte T-Zellen (Luc(+)-T-Zellen) wurden mit verschiedenen Formaten von STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb/2 x 107 T-Zellen) bestückt und den Mäusen, die EFT-PDXs (ES15a) trugen, zusätzlich IL-2 (1.000 I.E./Dosis) verabreicht. Abkürzungen: EFT = Ewing-Sarkom-Tumorfamilie; PDXs = patienteneigene Tumor-Xenotransplantate; STEAP = Sechs-Transmembran-Epithelantigen der Prostata. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Tumorinfiltrierende Lymphozyten wurden quantifiziert, indem die Fläche unter der Kurve der Biolumineszenz berechnet wurde. Die Unterschiede zwischen den in der Abbildung dargestellten Stichproben wurden mit Hilfe der einfaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test nach Tukey auf statistische Signifikanz getestet. p < 0,0001. Diese Abbildung wurde von Lin et al.10 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Während das T-BsAb Blinatumomab für CD19-positive hämatologische Malignome zugelassen ist, hat sich die erfolgreiche Implementierung von T-BsAbs bei soliden Tumoren als deutlich schwieriger erwiesen. Catumaxomab, ein T-BsAb, das gegen das Epithelzelladhäsionsmolekül (EPCAM) gerichtet ist, wurde für die Behandlung von malignem Aszites bei Patientinnen mit Eierstockkrebs zugelassen, die Produktion des Medikaments wurde jedoch aus kommerziellen Gründen gestoppt19. Für solide Tumore sind keine weiteren T-BsAbs zugelassen, was die Herausforderungen verdeutlicht, die mit dieser Art der Therapie verbunden sind. Toxizität aufgrund des Zytokinfreisetzungssyndroms (CRS) ist ein häufiges Problem, obwohl dies mit Steroiden und Zytokininhibitoren behandelt werden kann. Neben der Toxizität ist in Studien mit T-BsAbs bei soliden Tumoren häufig eine mangelnde Wirksamkeit zu beobachten. Die Induktion des T-Zell-Transports und der Persistenz im Tumor hat sich als schwierig erwiesen, was wahrscheinlich auf verschiedene immunsuppressive Faktoren im TMEzurückzuführen ist 14. Doch auch präklinisch ist oft unklar, warum ein T-BsAb, das in vitro gut funktioniert, Tumore in vivo nicht wirksam behandeln kann.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode zur Verfolgung von T-Zellen in vivo in Echtzeit ist für Forscher aus mehreren Gründen nützlich. Die Überwachung des T-Zell-Homings liefert einen mechanistischen Einblick in den Erfolg oder Misserfolg bestimmter T-BsAbs, indem sie es den Forschern ermöglicht, festzustellen, wann der T-Zell-Transport begonnen hat und wie lange die T-Zellen während der Therapie im Tumor verblieben. Die Methode kann zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, so dass die Forscher die Kinetik des T-Zell-Homings über mehrere Wochen hinweg aufzeichnen können. (Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 1 zeigen, dass T-Zellen mindestens 28 Tage im Tumor persistieren.) Durch die In-vivo-Bildgebung von Luciferase-transduzierten T-Zellen entfällt auch die Notwendigkeit, Tiere während der Behandlung zur histologischen Beurteilung der T-Zell-Infiltration zu opfern, wodurch die Gesamtkosten und die Anzahl der pro Experiment benötigten Tiere reduziert werden. Da die Bildgebung beliebig oft wiederholt werden kann, ermöglicht sie auch eine viel einfachere und gründlichere Bewertung der T-Zell-Homing-Kinetik im Vergleich zur histologischen Analyse, bei der es sich im Wesentlichen um eine Momentaufnahme eines einzelnen Zeitpunkts handelt, es sei denn, mehrere Tiere werden zu verschiedenen Zeitpunkten geopfert.

Der kritischste Schritt dieser Methode ist die erfolgreiche Transduktion von T-Zellen mit dem Luciferase-Konstrukt. Eine erfolglose Transduktion kann zum Tod der T-Zellen oder zu einem Mangel an Luciferase-Signal in vivo führen. Wenn sich T-Zellen nach der Transduktion nicht wie erwartet vermehren, kann es möglich sein, den Virustiter, mit dem sie transduziert werden, zu reduzieren, um eine potenzielle Toxizität durch den Transduktionsprozess zu reduzieren. Ein anderer Ansatz wäre, zwischen den Expansionsschritten der T-Zellen einen weiteren Tag zu warten, damit die T-Zellen konfluenter werden können, bevor sie in ein größeres Zellkulturgefäß expandieren. Bevor die T-Zellen in die Mäuse injiziert werden, ist es eine gute Idee, den Transduktionserfolg mit Hilfe der Durchflusszytometrie (zur Überprüfung der Expression des TD-Tomatenreporters) oder eines biolumineszenten Plattenlesers zu bestätigen. Wenn die transduzierten T-Zellen mit der Biolumineszenz-Bildgebung immer noch nicht sichtbar sind, kann es sein, dass die Anzahl der T-Zellen zu gering ist, um sie mit dieser Technik zu detektieren. Rabinovich et al. beschreiben eine ähnliche Methode, bei der eine verbesserte Glühwürmchen-Luciferase zum Nachweis von nur 10 murinen T-Zellen verwendet wird, die in Situationen eingesetzt werden kann, die dieses Maß an Sensitivität erfordern20.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die In-vivo-Verfolgung von Luciferase-transduzierten T-Zellen ein wertvolles Werkzeug für Forscher darstellt, die T-BsAbs in immungeschwächten Mausmodellen für Krebs untersuchen. Zusätzlich zu den oben diskutierten Anwendungen wurde diese Methode des T-Zell-Trackings auf chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR) angewendet und könnte möglicherweise auch auf syngene Mausmodelle angewendet werden, die adoptiv übertragene T-Zellen verwenden21. Wir hoffen, dass diese Strategie für Forscher, die translationale T-BsAbs entwickeln, hilfreich sein wird und zu einem höheren Erfolg dieser Therapien bei Patienten mit soliden Tumoren führen wird.

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Disclosures

NKC berichtet, dass es kommerzielle Forschungszuschüsse von Y-mAbs Therapeutics erhalten hat. NKC ist der Erfinder und Inhaber der erteilten Patente, die von MSK an Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand und Abpro-labs lizenziert wurden. MSK und NKC sind finanziell an Y-mAbs beteiligt. NKC berichtet, Aktienoptionen von Eureka Therapeutics erhalten zu haben. HFG und MEC haben keine relevanten Angaben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Vladimir Ponomarev für die Bereitstellung der Luciferase-Konstrukte, die in den Experimenten verwendet wurden, die im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dieses Artikels beschrieben sind.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

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References

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  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
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  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Cancer Research Heft 195 bispezifische Antikörper T-Zell-Engager Luciferase T-Zellen Xenotransplantate
Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen
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Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

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