Summary
כאן, אנו מתארים שיטה להמרת תאי T אנושיים עם לוציפראז כדי להקל על מעקב in vivo אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במחקרים כדי להעריך את היעילות והמנגנון נגד גידולים של נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T.
Abstract
נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) נמצאים בשלבים שונים של פיתוח פרה-קליני ובדיקות קליניות לגידולים מוצקים. גורמים כגון ערכיות, סידור מרחבי, מרחק בין-תחומי ומוטציות Fc משפיעים על היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים אלה, בדרך כלל על ידי השפעה על הביות של תאי T לגידולים, מה שנותר אתגר גדול. כאן, אנו מתארים שיטה להתמרה של תאי T אנושיים פעילים עם לוציפראז, המאפשרת מעקב in vivo של תאי T במהלך מחקרי טיפול T-BsAb. היכולת של T-BsAbs להפנות תאי T לגידולים ניתנת להערכה כמותית במספר נקודות זמן במהלך הטיפול, מה שמאפשר לחוקרים לקשר את היעילות האנטי-סרטנית של T-BsAbs והתערבויות אחרות עם ההתמדה של תאי T בגידולים. שיטה זו מקלה על הצורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול כדי להעריך היסטולוגית את חדירת תאי T וניתן לחזור עליה במספר נקודות זמן כדי לקבוע את הקינטיקה של סחר בתאי T במהלך הטיפול ולאחריו.
Introduction
נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T (T-BsAbs) הם נוגדנים מהונדסים המשמשים למתן ספציפיות מלאכותית לתאי T רב-שבטיים על ידי הפעלת תאי T דרך זרוע קשירה אחת ואנטיגן גידולי דרך זרוע קושרת אחרת. טכנולוגיה זו יושמה בהצלחה על סרטן המטולוגי (CD19-targeting blinatumomab1), ומספר רב של T-BsAbs נמצאים בפיתוח פרה-קליני וקליני עבור מגוון גידולים מוצקים כמו גם2. T-BsAbs מפעילים תאי T רב-שבטיים באופן בלתי תלוי בקומפלקס היסטו-תאימות (MHC), ולכן אפילו גידולים שמפחיתים את הרגולציה של אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (HLAs) רגישים לסוג זה של טיפול 3,4. T-BsAbs פותחו בעשרות פורמטים שונים, עם הבדלים בערכיות ובסידור המרחבי של תא T וזרועות קשירת גידולים, מרחקים בין תחומים, והכללת תחום Fc, המשפיע על מחצית החיים ויכול לגרום לפונקציות אפקט אם קיים5. עבודות קודמות במעבדה שלנו הראו כי גורמים אלה משפיעים באופן משמעותי על היעילות נגד גידולים של T-BsAbs, עם הבדלים של עד פי 1,000 בעוצמה6. באמצעות עבודה זו, זיהינו את פורמט IgG-[L]-scFv כפלטפורמה האידיאלית עבור T-BsAbs (ראה סעיף תוצאות מייצגות לפרטים נוספים לגבי פורמטים של T-BsAb), ויישמנו פלטפורמה זו על מטרות כולל GD2 (נוירובלסטומה), HER2 (סרטן השד ואוסטאוסרקומה), GPA33 (סרטן המעי הגס), STEAP1 (יואינג סרקומה), CD19 (ממאירויות תאי B) ו- CD33 (ממאירויות תאי B)7, 8,9,10,11,12,13.
אחד האתגרים העיקריים ביישום מוצלח של טיפול T-BsAb בגידולים מוצקים הוא התגברות על מיקרו-סביבה של גידולים מדכאי חיסון (TME) כדי להניע סחר בתאי T לגידולים14. הגורמים המשפיעים על יעילות T-BsAb שתוארו לעיל משפיעים באופן משמעותי על היכולת של T-BsAbs לגרום ביעילות לביות תאי T לגידולים, אך קשה להעריך השפעה זו במערכת in vivo בזמן אמת. כתב יד זה מספק תיאור מפורט של השימוש בתאי T מותמרים לוציפראז במחקרים פרה-קליניים של T-BsAbs כדי להעריך סחר בתאי T לרקמות שונות במודלים ניסיוניים של עכברים מדוכאי חיסון במהלך הטיפול. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק אמצעי להערכת חדירת תאי T לגידולים ולרקמות אחרות, כמו גם תובנה בזמן אמת לגבי קינטיקה והתמדה של ביות תאי T, ללא צורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול. עבור המספר ההולך וגדל של חוקרים המתמקדים באימונותרפיה תאית, היכולת לעקוב אחר תאי T in vivo במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים היא קריטית. אנו שואפים לספק תיאור יסודי ומפורט של השיטה בה השתמשנו למעקב אחר תאי T מותמרים של לוציפראז כדי לאפשר לחוקרים אחרים לשכפל בקלות טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים הבאים הוערכו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של Memorial Sloan Kettering.
1. טרנספקציה של תאי 293T עם לוציפראז וקציר של supernatant ויראלי
- תרבית של 293T תאים
- הכן מדיה על ידי הוספת הדברים הבאים לליטר DMEM כל אחד: 110 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 11 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין.
- הפשיר 5 x 106 293T תאים ולהעביר אותם לתוך בקבוק T175 עם מדיה מוכן כמתואר לעיל.
- פצל את תאי 293T 1:10 כל 3 ימים למשך 6 ימים. אל תאפשר לתאים להיות יותר מ 90% confluent.
- טרנספקציה של תאי 293T
הערה: הכמויות הבאות של ריאגנטים מחושבות עבור הדבקת בקבוק T175 אחד של 293T תאים. התאימו בהתאם אם רוצים להמיר צלוחיות נוספות.- העבר 1.5 מ"ל של מדיה לכל אחד משני צינורות 50 מ"ל באמצעות פיפטה. לצינור אחד, הוסיפו 10 מיקרוגרם של פלסמיד VSV-G, 20 מיקרוגרם של Gag/pol ו-20 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז עגבניות TD אדומות של חיפושית קליק (CBR-TDR) וערבבו. לצינור השני, להוסיף 100 μL של DNA במבחנה transfection מגיב ולערבב. יש לדגור על שני הצינורות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
הערה: כל הפלסמידים המתוארים בכתב יד זה סופקו על ידי ד"ר ולדימיר פונומרב. - מעבירים את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה החוץ-גופית של הדנ"א בטיפה לצינור המכיל את פלסמידים הדנ "א (מעל 30 שניות בקירוב) ומערבבים בעדינות עם פיפטה. יש לדגור ב-RT במשך 20 דקות.
- במהלך דגירה זו של 20 דקות, נתקו את תאי 293T על ידי הוספת 5-10 מ"ל של 0.05% טריפסין. לאחר ניתוק התאים, הוסף 10 מ"ל של מדיה וצנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות. להשעות את התאים ב 1.5 מ"ל של מדיה.
- הוסף את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של DNA במבחנה ואת פלסמידים DNA לתאי 293T ודגור ב 37 ° C במשך 30 דקות.
- מעבירים לבקבוק T175 ומוסיפים 18 מ"ל מדיה. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
- למחרת, בזהירות לשאוף את התקשורת עם פיפטה זכוכית מבלי לנתק את התאים. החלף עם 18 מ"ל של מדיה טרייה. יש לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באינקובטור.
- העבר 1.5 מ"ל של מדיה לכל אחד משני צינורות 50 מ"ל באמצעות פיפטה. לצינור אחד, הוסיפו 10 מיקרוגרם של פלסמיד VSV-G, 20 מיקרוגרם של Gag/pol ו-20 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז עגבניות TD אדומות של חיפושית קליק (CBR-TDR) וערבבו. לצינור השני, להוסיף 100 μL של DNA במבחנה transfection מגיב ולערבב. יש לדגור על שני הצינורות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
- קצירת סופרנאטנט ויראלי
- מוציאים את הסופרנאטנט הנגיפי בעזרת פיפטה שמונחת על קרח. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים ואת הפסולת.
הערה: אם גלולת התא גדולה, סביר להניח שהתאים שובשו מהבקבוק כאשר הסופרנאטנט הוסר. תאים אלה יכולים להיות מצופים שוב בקבוק חדש עם מדיה טרייה. - סננו את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר.
- השתמש supernatant ויראלי מיד. שמרו אותו על קרח או בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות, או הקפיאו אותו בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
- מוציאים את הסופרנאטנט הנגיפי בעזרת פיפטה שמונחת על קרח. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים ואת הפסולת.
2. הרחבה והתמרה של תאי T אנושיים מופעלים עם לוציפראז
- הפעלה של תאי T אנושיים במבחנה
- שטפו את החרוזים על ידי הוספת 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מילימטר חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) לצינור סטרילי של 15 מ"ל, הוספת חרוזים (חרוז אחד לכל שני תאי T), הנחת במדף מגנטים למשך 2 דקות ושיבת PBS.
- הכינו חומרי הדפסה כמתואר בשלב 1.1.1, ולאחר מכן הוסיפו IL-2 לריכוז סופי של 30 IU/mL והוסיפו את החרוזים השטופים. צור 2.5 מ"ל של מדיה עבור כל שני מיליון תאי T שיופעלו.
- ספרו את תאי ה-T (שטוהרו או טוהרו בעבר, הוקפאו, הופשרו ונשטפו) באמצעות המוציטומטר וכתם כחול טריפאן. הוסף תאי T למדיה שהוכנה בשלב 2.1.2 והפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. תאי T יתרחבו לפחות פי 20 בהתאם למקור ולבריאות הכללית של התאים. קבע את מספר תאי T שיש להפעיל על ידי חישוב המספר הדרוש לטיפול בעכברים וחלוקה ב- 20. כאן, 20 x 106 תאי T לכל עכבר שימשו על בסיס ניסויים ראשוניים.
- צלחת 2.5 מ"ל של מדיה המכילה שני מיליון תאי T, חרוזים ו- IL-2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 5% CO2 .
- בחן את תאי T תחת מיקרוסקופ 20x כל יום במשך 3 הימים הבאים כדי לקבוע מתי להתמיר עם luciferase. התאים מוכנים כאשר הם מתקבצים יחד ומרוקנים את המדיה, והופכים אותה מאדומה/ורודה לכתומה בהירה.
- הכנת צלחות רטרונקטין
הערה: רטרונקטין משמש לציפוי הלוחות המשמשים להתמרה מכיוון שהוא משפר את התמרה גנטית15.- הוסף 2 מ"ל של 20 מיקרוגרם / מ"ל רטרונקטין ב- PBS לבאר של צלחת 6 בארות לא מטופלת. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT או שעה אחת ב-37°C. באר אחת מצופה רטרונקטין נדרשת לכל שני מיליון תאי T כדי לעבור טרנספורמציה.
- שאפו את הרטרונקטין מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
- הוסף 3 מ"ל של 2% BSA ב- PBS (מסונן סטרילי) לכל באר בצלחת 6 הקידוחים. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
- ספינוקולציה
- שאפו את ה-BSA מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
- לשטוף את הבארות פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS לכל באר. המשיכו או החליפו ב-PBS טרי והשאירו את הצלחת מכוסה ב-4°C למשך הלילה.
- הוסף 2 מ"ל של CBR-TDR luciferase viral supernatant (נאסף בשלב 1.3) לכל באר.
- צנטריפוגה ב-1,240 x גרם למשך 90 דקות ב-32°C.
- התמרה
- ספור את תאי T.
- שאפו את הסופרנאטנט הוויראלי מבלי לגרד את תחתית הצלחת.
- צלחת שני מיליון תאי T לבאר ב 6 מ"ל של תווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 30 IU/mL IL-2 אנושי.
- בדוק את תאי T מדי יום. תאי T מוכנים להרחבה כאשר הם כמעט נפגשים, בדרך כלל לאחר יומיים.
- כאשר התאים כמעט נפגשים, שטפו אותם בעדינות מתחתית הצלחת באמצעות פיפטה והעבירו כל באר לצלוחית T75 נפרדת. הוסף 9 מ"ל של מדיה עבור סך של 15 מ"ל של מדיה לכל בקבוק.
- למחרת, להוסיף עוד 15 מ"ל של מדיה. התאים צריכים להיות מוכנים להזרקה לעכברים יום לאחר תוספת זו של מדיה. אשר התמרה מוצלחת על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה (מבנה הלוציפראז מכיל פלואורופור עגבניות TD הנראה בערוץ PE)16.
3. השתלת תאי T מותמרים של לוציפראז בעכברים מדוכאי חיסון
- הכינו וספרו את תאי ה-T להזרקה.
- הסר את תאי T מהצלוחיות וספור. התאים מוכנים להזרקה כאשר הם התרחבו פי 20-30, בדרך כלל ביום השביעי לאחר ההפעלה.
- צנטריפוגה את תאי T ב 800 x גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש ב -2 מ"ל של מדיה והסר את החרוזים באמצעות מתלה מגנט.
- בניסויים שבהם תאי T יוזרקו בנפרד מנוגדנים דו-ספציפיים, ספרו את תאי ה-T והשהו מחדש כך שהריכוז הסופי יהיה 20 מיליון תאי T לכל 100 מיקרוליטר מדיה. דלג לשלב 3.2. עבור ניסויים באמצעות תאי T חמושים ex vivo (EATs), דלג לשלב 3.1.4.
- עבור ניסויים המשתמשים בתאי T חמושים ex vivo , ספרו את תאי T והפרידו אותם לצינורות בודדים של 1.5 מ"ל עבור כל קבוצה, עם 20 מיליון תאים לכל עכבר. לדוגמה, אם יש שלוש קבוצות של חמישה עכברים כל אחת, להכין שלוש צינורות 1.5 מ"ל עם 100 מיליון תאי T כל אחד.
- צנטריפוגה את צינורות 1.5 מ"ל ב 800 x גרם במשך 5 דקות. הסר את המדיה בזהירות מבלי להפריע לגלולת תא T. יש להשהות מחדש בלא יותר מ-50 מיקרוליטר של מדיה המכילה את הנוגדנים הדו-ספציפיים. יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות.
הערה: לצורך ניסויים שנערכו במחקר זה, נעשה שימוש בנוגדנים דו-ספציפיים קנייניים מסוג IgG-[L]-scFv T העוסקים בתאי T שנוצרו במעבדה. לחימוש תאי T, יש להשתמש ב-5 מיקרוגרם נוגדנים לכל 20 x 106 תאי T. ניתן להשתמש גם בנוגדנים דו-ספציפיים הזמינים מסחרית. - שטפו נוגדנים עודפים על ידי הוספת 1,450 מיקרוליטר של מדיה לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, בזהירות לשאוף את התקשורת, ולהשהות מחדש בריכוז של 20 מיליון תאי T חמושים לכל 100 μL מדיה.
- הזרקה והשתלה לעכברים
- מרדימים את העכברים בתא המספק איזופלורן בשאיפה של 3.5% (v/v) בחמצן של ליטר/דקה. העכברים מורדמים לחלוטין כאשר רפלקס הנסיגה של דוושת הגפה האחורית נעלם.
הערה: ספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך. - באמצעות מחט של 26 גרם, הזריקו 20 מיליון תאי T ב-100 מיקרוליטר של מדיה רטרואורביטלית לכל עכבר.
- מתן 1,000 U רקומביננטי IL-2 תת עורית לתמיכה בהישרדות תאי T in vivo.
- מתן הנוגדנים הדו-ספציפיים באופן רטרואורביטלי (לעין שאינה משמשת להזרקת תאי T) או תוך צפקית. אפשרו לעכברים להתאושש מההרדמה ולחזור לכלובים.
הערה: שוב, כאן, נעשה שימוש בנוגדנים קנייניים שנוצרו במעבדה, אך ניתן להשתמש בנוגדנים זמינים מסחרית במקום. בניסויים כאן ניתנו 0.3-10 מק"ג נוגדנים לעכבר למנה. הנוגדנים ניתנו פעמיים בשבוע במשך 3-4 שבועות.
- מרדימים את העכברים בתא המספק איזופלורן בשאיפה של 3.5% (v/v) בחמצן של ליטר/דקה. העכברים מורדמים לחלוטין כאשר רפלקס הנסיגה של דוושת הגפה האחורית נעלם.
4. הדמיה In vivo של עכברים שהושתלו בהם תאי T מותמרים של לוציפראז
הערה: שלב זה יבוצע ביום ההדמיה, שאינו בהכרח אותו יום שבו תאי T ו/או נוגדנים ניתנים לעכברים. בדרך כלל, אנו מבצעים הדמיה 24 שעות לאחר מתן תאי T מותמרים לוציפראז.
- הכנת D-luciferin
- להמיס 1 גרם של D-luciferin ב 33.3 מ"ל של PBS סטרילי (ריכוז סופי: 30 מ"ג / מ"ל).
- Aliquot מומס D-luciferin לתוך 33 x 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולשמור על צינורות ב -20 °C.
- ביום ההדמיה, להפשיר מספיק aliquots של 30 מ"ג / מ"ל D-luciferin עבור מספר בעלי החיים להיות תמונה. צינור אחד מספיק עבור 10 בעלי חיים.
הערה: יש להקפיא מחדש את שארית D-לוציפרין לאחר השימוש. D-luciferin יציב לפחות חמישה מחזורי הקפאה/הפשרה.
- מתן D-luciferin לעכברים
הערה: לפני מתן D-luciferin לעכברים, פתח את תוכנת ההדמיה ואתחל את המערכת. המצלמה עשויה להימשך מספר דקות כדי להתקרר, וזה צריך להיעשות לפני העכברים מוזרקים עם D-luciferin כדי להבטיח כי הדמיה יכולה להתרחש 5 דקות לאחר מתן המצע.- יש להרדים עד חמישה עכברים בתא המספק איזופלורן בשאיפה של 3.5% (v/v) בחמצן של ליטר/דקה. העכברים מורדמים לחלוטין כאשר רפלקס הנסיגה של דוושת הגפה האחורית נעלם.
- לאחר הרדמה מלאה של העכברים, יש לתת 100 מיקרוליטר של 30 מ"ג/מ"ל D-לוציפרין לעכבר (3 מ"ג לעכבר) על ידי הזרקה רטרואורביטלית עם מחט 26 גרם. דמיינו את קבוצת העכברים הזו לפני מתן D-luciferin לקבוצה הבאה. הניחו את קבוצת העכברים הבאה בתא האיזופלורן להרדים בזמן שהקבוצה הקודמת נמצאת בתמונה.
- הדמיה של תאי T מותמרים של לוציפראז
- העבירו את העכברים המורדמים לתא האטום לאור של מכשיר ההדמיה והמשיכו לתת איזופלורן 3% ב-0.5 ליטר/דקה. הניחו את העכברים על צידיהם כך שהאגף הנושא את הקסנוגרפט פונה כלפי מעלה לכיוון המצלמה. צלם קבוצה נוספת של תמונות עם העכברים במצב שכיבה כדי להעריך את נוכחות תאי T בריאות.
- בלוח הבקרה של הרכישה, בחר זוהר, תצלום ושכבת-על. הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, את האיגוד לבינוני ואת F/Stop ל- 1. רכוש תמונות. לאחר התמונה הראשונה, הגדירו את זמן החשיפה כך שיתאים לזמן שחושב אוטומטית לתמונה הראשונה, כך שניתן יהיה להשוות ישירות בין התמונות הבאות. כדאי לצלם תמונות עם זמני חשיפה מרובים כדי לקבוע את זמן החשיפה המיטבי להשגת האות הבהיר ביותר ללא רוויית פיקסלים.
- הוציאו את העכברים מהאיזופלורן, חזרו לכלובים שלהם והתבוננו עד שהם ערים ואמבולטוריים.
- חזור על השלבים משלב 4.2.1 עד שכל הקבוצות יצולמו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמתואר בשלב 4.3, עכברים יכולים להיות מכוונים בתנוחות שונות במהלך ההדמיה כדי להעריך את נוכחותם של תאי T ברקמות שונות. מיקום שכיבה מאפשר הערכה של תאי T בריאות, דבר שכיח בנקודות זמן מוקדמות לאחר ההזרקה. מיקום רוחבי עם xenograft תת עורית פונה כלפי מעלה משמש כדי להעריך בצורה הטובה ביותר את הסחר בתאי T לגידול. נקבות עכברי C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac שימשו לכל הניסויים המתוארים בכתב יד זה. איור 1 מראה תמונות מניסוי שבו עכברים שנשאו קסנוגרפטים חיוביים ל-GD2 טופלו בתאי T מותמרים של לוציפראז חמושים ex vivo עם GD2 BsAb או תאי T מותמרים של לוציפראז ו-GD2 BsAb שהוזרקו בנפרד17. איור 1A מראה שתאי T חמושים נסחרו לגידול מהר יותר מתאי T לא חמושים (איור 1B), ועוזבים את הריאות יומיים מוקדם יותר. איור 1C מראה את הכימות של התופעה. איור 1E-G מראה שאפשר לעקוב אחר סחר בתאי T במשך 28 יום לפחות לאחר הזרקת תאי T מותמרים לוציפראז, מה שמאפשר לחוקרים לעקוב אחר ביות תאי T והתמדתם לאורך כל הטיפול, בניגוד לשיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה (IHC) שמאפשרות רק תמונת מצב של חדירת תאי T.
ללא היכולת להעריך סחר בתאי T in vivo, חוקרים הבודקים T-BsAbs אינם מסוגלים לקבוע אם תאי T מסתננים ומתמידים בגידולים במהלך הטיפול. אם הטיפול נכשל, מבלי להקריב בעלי חיים ולבצע IHC, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי לדעת אם הכישלון נבע מחוסר סחר בתאי T, התמדה, תשישות תאי T, או סיבה אחרת. איור 2A-C מראה ניסוי שבו עכברים הנושאים קסנוגרפטים שמקורם בסרטן השד טופלו בתאי T אנושיים מותמרים לוציפראז וב-BsAbs ממוקד HER2 הנושאים מוטציות שונות להשתקת פונקציות Fc7. איור 2C מראה שטיפול ב-HER2 BsAb עם Fc לא מושתק לא השפיע על צמיחת הגידול בהשוואה ל-BsAb ביקורתי, בעוד שטיפול ב-HER2 BsAbs שהכיל מוטציית N297A בלבד או בשילוב עם מוטציית K322A הצליח לעצור לחלוטין את צמיחת הגידול. איור 2A ואיור 1B מראים שבקבוצות עם מוטציות ההשתקה, אות ההארה של תאי T הגיע לשיא גבוה יותר ביום השלישי שלאחר ההזרקה, ונמשך ברמה גבוהה יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת BsAb ול-HER2 BsAb שלא הושתק. ניסויי המשך הראו כי בעכברים שטופלו בתאי T וב-BsAbs עם Fcs לא מושתק, תאי T באזורים פריווסקולריים של הריאות היו מוקפים בנויטרופילים מורינים ומקרופאגים, מה שמרמז על קיבוע תלוי Fc של תאי T הקשורים ל-BsAb אשר מונע הגירה לגידול. ההשפעה הפרו-גידולית של מקרופאגים מקוטבים M2 תושבי הגידול תוארה היטב. איור 3A,B מראה שבעכברים הנושאים קסנוגרפטים שמקורם בחולה נוירובלסטומה (PDXs), דלדול המקרופאגים החיוביים ל-Ly6c מגביר באופן משמעותי את ביות תאי T לגידולים, וכתוצאה מכך ירידה בצמיחת הגידול והישרדות ממושכת (איור 3C)18. ההשפעה הזו בולטת אפילו יותר ב-PDX של אוסטאוסרקומה (איור 3D).
In vivo מעקב אחר תאי T גם מאפשר לחוקרים לעקוב אחר האופן שבו קינטיקה של סחר בתאי T מושפעת ממשתנים אחרים בהנדסת נוגדנים, כולל תצורה מבנית. כפי שמתואר בהקדמה של מאמר זה, עבודה קודמת במעבדה שלנו הדגישה את החשיבות של bivalency ואוריינטציה cis של זרועות קושרות תאי הגידול ותאי T עבור יעילות in vivo של BsAbs. איור 4 מראה שבקרב פאנל של BsAbs שהתמקד באנטיגן הגידול STEAP1 (איור 4A), פורמט IgG-[L]-scFv הביא לחדירה משמעותית יותר של תאי T ביום 6 לאחר המנה הראשונה של תאי T, שנמשכה במשך הטיפול (איור 4C)10. תופעה זו לא נחזתה על-ידי מבחני ציטוטוקסיות חוץ גופית (איור 4B), המדגישים את החשיבות של אישור תוצאות במבחנה במודלים in vivo.
איור 1: תאי T חמושים מפגינים קינטיקה מהירה יותר של ביות הגידול מאשר תאי T לא חמושים המכוונים על-ידי BsAb, ועוקפים במהירות את קיבוע הריאות. תאי T מותמרים של לוציפראז הורחבו וחומשו ב-BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EATs (10 מיקרוגרם של GD2-BsAb/2×10 7 תאי T) אותאי T לא חמושים של Luc(+) (2 x 107 תאים) עם או בלי GD2-BsAb (10 מיקרוגרם) ניתנו דרך הווריד לעכברים נושאי PDX נוירובלסטומה חיוביים ל-GD2 כאשר נפח הגידול הממוצע הגיע ל-100 מ"מ3. (A) תמונות ביולומינסנציה של סחר GD2-EAT בגידולים. (B) תמונות ביולומינסנציה של GD2 BsAb מכוון תאי T לא חמושים הסוחרים לתוך גידולים במשך ימים. (C) כימות של חדירת תאי T לגידולים לאורך זמן הנמדדת על ידי ביולומינסנציה (n = 5 עכברים לקבוצה) המתבטאת בשטף כולל או בקרינה (פוטונים/ים) לפיקסל המשולבים על פני מתאר הגידול (ROI). (D) עקומות גדילה של גידולים של עכברים בודדים שטופלו ב-GD2-EATs, GD2-BsAb בתוספת תאי T לא חמושים, או תאי T לא חמושים. כדי לבדוק את ההתמדה in vivo של EATs ספציפיים לאנטיגן מטרה, Luc(+) GD2-EATs (חמושים ב-10 מיקרוגרם של GD2-BsAb/2×107 תאי T) או Luc(+) HER2-EATs (10 מיקרוגרם של תאי HER2-BsAb/2×107 T) ניתנו דרך הווריד לעכברים נושאי אוסטאוסרקומה TEOS1C PDX. שתי מנות נוספות של GD2-EAT או HER2-EATs שאינם מותמרים לוציפראז ניתנו ביום השביעי וביום ה-14. (E) כימות של ביולומינסנציה של Luc(+) EATs בגידולים לאחר הטיפול. (F) עקומות גדילה סרטניות של עכברים בודדים שטופלו ב-GD2-EATs, HER2-EATs או תאי T לא חמושים, או ללא טיפול. (G) תמונות ביולומינסנציה של Luc(+) GD2-EATs (עליון) או Luc(+) HER2-EATs (תחתון) בגידולים לאורך זמן. Bioluminescence של Luc(+) EATs זוהה במשך 28 ימים לאחר ההזרקה. קיצורים: EATs = תאי T חמושים ex vivo; ROI = אזור עניין. קווי שגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. נתון זה שונה מ- Park et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סחר בתאי T לסרטן שד אנושי חיובי ל-HER2 PDX בעכברי DKO. (A) תמונות ביולומינסנציה מייצגות של סחר בתאי T. (B) כימות של סחר תאי T בגידולים לאורך זמן על ידי ביולומינסנציה (n = 5 עכברים לקבוצה) המתבטאת בשטף כולל או בקרינה (פוטונים/ים) בכל פיקסל המשולב על פני כל מתאר הגידול (ROI). (C) סרטן שד חיובי ל-HER2 PDX (M37) גדילה (n = 5 עכברים לקבוצה) לאחר טיפול ב-Ctrl BsAb, HER2 BsAb ומוטנטים ב-Fc. התוצאות המוצגות הן תוצאות מייצגות של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. ההבדלים המשמעותיים חושבו על בסיס השטח שמתחת לעקומה (AUC). קווי שגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. נתון זה שונה מ- Wang et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של דלדול מונוציטים על BsAb כיוונו סחר בתאי T ותגובה אנטי-סרטנית in vivo. (A) תאי T מותמרים של לוציפראז (Luc(+) T תאים) או תאי T חמושים GD2-BsAb מותמרים (Luc(+) GD2-EATs) ניתנו עם נוגדן אנטי-Ly6C לעכברים הנושאים קסנוגרפט שמקורו בחולה נוירובלסטומה (PDX). (B) בוצע מעקב אחר ביולומינסנציה בנגעי הגידול. תמונות הביולומינסנציה ביום 7 וכימות הביולומינסנציה בנגעי הגידול. (C) תגובה אנטי-סרטנית In vivo על ידי GD2-EATs עם נוגדן anti-Ly6C נבדקה כנגד נוירובלסטומה PDXs. (D) השפעה אנטי-סרטנית In vivo של GD2-EATs עם נוגדן anti-Ly6C נבדקה כנגד PDX אוסטאוסרקומה, והישרדות לטווח ארוך נותחה. קווי שגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. אפקט אנטי-סרטני In vivo הושווה על ידי ניתוח AUC ועקומת הישרדות. לימפוציטים חודרי גידול כומתו באמצעות AUC של bioluminescence. ההבדלים בין הדגימות שצוינו באיור נבדקו למובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט עבור שתי קבוצות נתונים ומבחן ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey עבור שלוש קבוצות נתונים או יותר. * עמ' < 0.05; ** עמ' < 0.01; עמ' < 0.001; עמ' < 0.0001. נתון זה שונה מ- Park et al.18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פעילות אנטי-סרטנית של נוגדן דו-ספציפי אנטי-STEAP1 T העוסק בתאי T. (A) ייצוג סכמטי של שש התבניות המבניות של STEAP1 BsAb. (B) בדיקת ציטוטוקסיות בתיווך תאי T (ADTC) תלוית נוגדנים כנגד קווי תאי EFT (TC32 ad TC71) באמצעות פורמטים שונים של STEAP1 BsAb. יחס תא האפקט למטרה (ET) היה 10:1. (C) דימות ביולומינסנציה (BLI) של תאי T Luc(+) חמושים בשש תבניות שונות של STEAP1 BsAb ביום (א) יום 6 ו-(ב) יום 18 לאחר הטיפול וכימות עוצמת הביולומינסנציה בנגעים של הגידול. תאי T מותמרים של לוציפראז (Luc(+) T תאים) היו חמושים בפורמטים שונים של STEAP1 BsAb (10 מיקרוגרם של STEAP1 BsAb/2 x 107 תאי T) וניתנו עם IL-2 משלים (1,000 IU / מנה) לעכברים הנושאים EFT PDXs (ES15a), ואת BLIfollowed. קיצורים: EFT = יואינג סרקומה משפחה של גידולים; PDXs = xenografts גידול שמקורו בחולה; STEAP = אנטיגן אפיתל של שש טרנסממברנה של הערמונית. קווי שגיאה מציינים שגיאת תקן של הממוצע. לימפוציטים חודרי גידול כומתו על ידי חישוב השטח מתחת לעקומת הביולומינסנציה. ההבדלים בין הדגימות שצוינו באיור נבדקו למובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey. עמ' < 0.0001. נתון זה שונה מ Lin et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד T-BsAb blinatumomab אושר עבור ממאירויות המטולוגיות חיוביות CD19, היישום המוצלח של T-BsAbs בגידולים מוצקים הוכח הרבה יותר קשה. Catumaxomab, T-BsAb המכוון נגד מולקולת הידבקות תאי אפיתל (EPCAM), אושר לטיפול במיימת ממאירה בחולות סרטן השחלות, אך ייצור התרופה הופסק לאחר מכן מסיבות מסחריות19. T-BsAbs אחרים לא אושרו לגידולים מוצקים, מה שמדגיש את האתגרים הקשורים לסוג זה של טיפול. רעילות עקב תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) היא בעיה נפוצה, אם כי ניתן לטפל בה באמצעות סטרואידים ומעכבי ציטוקינים. בנוסף לרעילות, חוסר יעילות נפוץ בניסויים של T-BsAbs עבור גידולים מוצקים. גרימת סחר בתאי T והתמדה בגידול הוכחה כקשה, ככל הנראה בשל גורמים שונים המדכאים את מערכת החיסון ב- TME14. עם זאת, אפילו מבחינה פרה-קלינית, לעתים קרובות לא ברור מדוע T-BsAb המתפקד היטב במבחנה אינו מצליח לטפל ביעילות בגידולים in vivo.
השיטה למעקב אחר תאי T in vivo בזמן אמת המתוארת במאמר זה שימושית לחוקרים מכמה סיבות. ניטור ביות תאי T מספק תובנה מכניסטית מדוע T-BsAbs מסוימים מצליחים או נכשלים בכך שהוא מאפשר לחוקרים לקבוע מתי החל הסחר בתאי T וכמה זמן תאי T נשארו בגידול במהלך הטיפול. ניתן לחזור על השיטה במספר נקודות זמן, מה שמאפשר לחוקרים לשרטט את הקינטיקה של ביות תאי T במשך מספר שבועות. (תוצאות מייצגות באיור 1 מראות שתאי T נשארים בגידול לפחות 28 יום.) הדמיה In vivo של תאי T מותמרים לוציפראז גם מבטלת את הצורך להקריב בעלי חיים במהלך הטיפול לצורך הערכה היסטולוגית של חדירת תאי T, ומפחיתה את העלות הכוללת ואת מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי. מכיוון שניתן לחזור על ההדמיה בתדירות הנדרשת, היא גם מאפשרת הערכה הרבה יותר קלה ויסודית של קינטיקה של ביות תאי T בהשוואה לניתוח היסטולוגי, שהוא למעשה תמונת מצב של נקודת זמן אחת, אלא אם כן מקריבים מספר בעלי חיים בנקודות זמן שונות.
השלב הקריטי ביותר של שיטה זו הוא התמרה מוצלחת של תאי T עם מבנה luciferase. התמרה לא מוצלחת עלולה להוביל למוות של תאי T או לחוסר אות לוציפראז in vivo. אם תאי T אינם מתרחבים כצפוי לאחר הטרנסדוקציה, ייתכן שניתן יהיה להפחית את הטיטר הנגיפי שבו הם מומרים על מנת להפחית רעילות פוטנציאלית מתהליך הטרנסדוקציה. גישה אחרת תהיה להמתין יום נוסף בין שלבי ההתפשטות של תאי T כדי לאפשר לתאי T להיות יותר מתמזגים לפני הרחבתם לכלי תרבית תאים גדול יותר. לפני הזרקת תאי T לעכברים, כדאי לאשר את הצלחת הטרנסדוקציה באמצעות ציטומטריית זרימה (כדי לבדוק את הביטוי של כתב עגבניות TD) או קורא צלחות ביולומינסנטיות. אם תאי T המומרים עדיין אינם נראים בהדמיה ביולומינסנטית, ייתכן שמספר תאי T נמוך מדי לגילוי באמצעות טכניקה זו. רבינוביץ' ועמיתיו מתארים שיטה דומה המשתמשת בלוציפראז משופר של הגחליליות כדי לזהות רק 10 תאי T מורין, אשר עשויים להיות מיושמים במצבים הדורשים רמה זו של רגישות20.
לסיכום, מעקב in vivo אחר תאי T מותמרים של לוציפראז מספק כלי רב ערך לחוקרים החוקרים T-BsAbs במודלים של סרטן בעכברים מדוכאי חיסון. בנוסף ליישומים שנדונו לעיל, שיטה זו של מעקב אחר תאי T יושמה על תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) ויכולה לכאורה להיות מיושמת גם על מודלים סינגניים של עכברים המשתמשים בתאי T שהועברו באימוץ21. אנו מקווים כי אסטרטגיה זו תועיל לחוקרים המפתחים T-BsAbs תרגומי ותוביל להצלחה מוגברת של טיפולים אלה בחולים עם גידולים מוצקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NKC מדווחת על קבלת מענקי מחקר מסחריים מחברת Y-mAbs Therapeutics. NKC היא הממציאה והבעלים של פטנטים שהונפקו ברישיון על ידי MSK ל-Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand ו-Abpro-labs. ל-MSK ול-NKC יש אינטרס כלכלי ב-Y-mAbs. NKC מדווחת על קבלת אופציות למניות מחברת Eureka Therapeutics. ל-HFG ול-MEC אין גילויים רלוונטיים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר ולדימיר פונומרב על שיתוף מבני הלוציפראז המשמשים בניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
References
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
- Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
- Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
- Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
- Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
- Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
- Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
- Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
- Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
- Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
- Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
- Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
- Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
- Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
- Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
- Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).
