Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Sporing av bispesifikk antistoffindusert T-cellehandel ved bruk av Luciferase-transducerte humane T-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Her beskriver vi en metode for å transdusere humane T-celler med luciferase for å lette in vivo-sporing av bispesifikk antistoffindusert T-celletrafikk til svulster i studier for å evaluere antitumoreffekten og mekanismen til T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer.

Abstract

T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer (T-BsAbs) er i ulike stadier av preklinisk utvikling og klinisk testing for solide svulster. Faktorer som valens, romlig arrangement, interdomain avstand og Fc-mutasjoner påvirker antitumoreffekten av disse terapiene, ofte ved å påvirke homing av T-celler til svulster, noe som fortsatt er en stor utfordring. Her beskriver vi en metode for å transdusere aktiverte humane T-celler med luciferase, noe som tillater in vivo-sporing av T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs evne til å omdirigere T-celler til svulster kan kvantitativt evalueres på flere tidspunkter under behandlingen, slik at forskere kan korrelere antitumoreffekten av T-BsAbs og andre inngrep med utholdenheten av T-celler i svulster. Denne metoden lindrer behovet for å ofre dyr under behandling for histologisk å vurdere T-celleinfiltrasjon og kan gjentas på flere tidspunkter for å bestemme kinetikken til T-cellehandel under og etter behandling.

Introduction

T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer (T-BsAbs) er konstruerte antistoffer som brukes til å gi kunstig spesifisitet til polyklonale T-celler ved å engasjere T-celler gjennom en bindende arm og et tumorantigen gjennom en annen bindende arm. Denne teknologien har blitt brukt på hematologiske kreftformer (CD19-målrettede blinatumomab1), og mange T-BsAbs er i preklinisk og klinisk utvikling for en rekke solide svulster også2. T-BsAbs engasjerer polyklonale T-celler på en viktig histokompatibilitetskompleks (MHC) -uavhengig måte, og derfor er selv svulster som nedregulerer humane leukocyttantigener (HLA) utsatt for denne typen terapi 3,4. T-BsAbs har blitt utviklet i dusinvis av forskjellige formater, med forskjeller i valens og romlig arrangement av T-celle- og tumorbindende armer, interdomeneavstander og inkludering av et Fc-domene, som påvirker halveringstiden og kan indusere effektorfunksjoner hvis de er tilstede5. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist at disse faktorene signifikant påvirker antitumoreffekten av T-BsAbs, med opptil 1000 ganger forskjeller i potens6. Gjennom dette arbeidet identifiserte vi IgG-[L]-scFv-formatet som den ideelle plattformen for T-BsAbs (se avsnittet Representative resultater for mer informasjon om T-BsAb-formater), og har brukt denne plattformen på mål inkludert GD2 (neuroblastom), HER2 (brystkreft og osteosarkom), GPA33 (kolorektal kreft), STEAP1 (Ewing sarkom), CD19 (B-celle maligniteter) og CD33 (B-celle maligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.

En av de store utfordringene for å lykkes med å implementere T-BsAb-terapi i solide svulster er å overvinne et immunosuppressivt tumormikromiljø (TME) for å drive T-celletrafikk til svulster14. Faktorene som påvirker T-BsAb-effekten beskrevet ovenfor har en signifikant innvirkning på T-BsAbs evne til effektivt å indusere T-cellehoming til svulster, men denne effekten er vanskelig å evaluere i et in vivo-system i sanntid. Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av bruken av luciferase-transduserte T-celler i prekliniske studier av T-BsAbs for å evaluere T-celletrafikk til forskjellige vev i eksperimentelle immunkompromitterte musemodeller under behandling. Det overordnede målet med denne metoden er å gi et middel til å evaluere T-celleinfiltrasjon i svulster og annet vev, samt sanntidsinnsikt i T-celle homing kinetikk og utholdenhet, uten å måtte ofre dyr under behandling. For det økende antall forskere som fokuserer på cellulære immunterapier, er evnen til å spore T-celler in vivo i prekliniske dyremodeller avgjørende. Vi tar sikte på å gi en grundig, detaljert beskrivelse av metoden vi har brukt for å spore luciferase-transducerte T-celler for å gjøre det mulig for andre forskere å enkelt replikere denne teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende prosedyrer er evaluert og godkjent av Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Transfeksjon av 293T-celler med luciferase og høsting av viral supernatant

  1. Kultur av 293T-celler
    1. Forbered media ved å legge følgende til en liter DMEM hver: 110 ml varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.
    2. Tine 5 x 106 293T-celler og overføre dem til en T175-kolbe med mediet klargjort som beskrevet ovenfor.
    3. Del 293T-cellene 1:10 hver 3. dag i 6 dager. Ikke la cellene bli mer enn 90% sammenflytende.
  2. Transfeksjon av 293T-celler
    MERK: Følgende mengder reagenser er beregnet for transfektering av en T175-kolbe med 293T-celler. Juster deretter hvis flere kolber skal reduseres.
    1. Overfør 1,5 ml medier til hvert av de to 50 ml rørene ved hjelp av en pipette. Til ett rør, tilsett 10 μg VSV-G-plasmid, 20 μg Gag / pol og 20 μg klikkbillerød TD-tomat (CBR-TDR) luciferaseplasmid og bland. Til det andre røret, tilsett 100 μL DNA in vitro transfeksjonsreagens og bland. Inkuber begge rørene ved romtemperatur (RT) i 5 minutter.
      MERK: Alle plasmider beskrevet i dette manuskriptet ble levert av Dr. Vladimir Ponomarev.
    2. Overfør mediet som inneholder DNA in vitro transfeksjonsreagenset dråpevis til røret som inneholder DNA-plasmidene (over ca. 30 s) og bland forsiktig med en pipette. Inkuber ved RT i 20 min.
    3. I løpet av denne 20 minutters inkubasjonen, løsne 293T-cellene ved å tilsette 5-10 ml 0,05% trypsin. Når cellene har løsnet, tilsett 10 ml medier og sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter. Resuspender cellene i 1,5 ml medier.
    4. Tilsett mediet som inneholder DNA in vitro transfeksjonsreagenset og DNA-plasmidene til 293T-cellene og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    5. Overfør til en T175-kolbe og tilsett 18 ml medier. Inkuber ved 37 °C over natten.
    6. Neste dag, aspirer mediet forsiktig med en glasspipette uten å løsne cellene. Erstatt med 18 ml ferske medier. Inkuber ved 37 °C over natten i en inkubator.
  3. Høsting av viral supernatant
    1. Fjern den virale supernatanten ved hjelp av en pipette som legges på is. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min for å pelletere celler og rusk.
      MERK: Hvis cellepelleten er stor, ble cellene sannsynligvis forstyrret fra kolben da supernatanten ble fjernet. Disse cellene kan belegges igjen i en ny kolbe med ferske medier.
    2. Filtrer den virale supernatanten ved hjelp av et 0,22 μm filter.
    3. Bruk den virale supernatanten umiddelbart. Oppbevares på is eller ved 4 °C i opptil 24 timer, eller frys den ved -80 °C for langtidsoppbevaring.

2. Utvidelse og transduksjon av aktiverte humane T-celler med luciferase

  1. Aktivering av humane T-celler in vitro
    1. Vask kulene ved å tilsette 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til et sterilt 15 ml rør, tilsett perler (en perle per to T-celler), plasser i et magnetstativ i 2 minutter og suge ut PBS.
    2. Forbered mediet som beskrevet i trinn 1.1.1, tilsett deretter IL-2 til en endelig konsentrasjon på 30 IE/ml og tilsett de vaskede kulene. Lag 2,5 ml medier for hver to millioner T-celler som skal aktiveres.
    3. Telle T-cellene (nyrenset eller tidligere renset, frosset, tint og vasket) ved hjelp av et hemocytometer og trypanblå flekk. Legg T-celler til mediet som ble klargjort i trinn 2.1.2, og snu forsiktig røret for å blande. T-cellene vil utvide seg minst 20x avhengig av kilden og den generelle helsen til cellene. Bestem antall T-celler som skal aktiveres ved å beregne antallet som trengs for å behandle musene og dele med 20. Her ble 20 x 106 T-celler per mus brukt basert på foreløpige eksperimenter.
    4. Plate 2,5 ml media som inneholder to millioner T-celler, perler og IL-2 i hver brønn i en 24-brønns vevskulturplate. Dyrkning ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
    5. Undersøk T-cellene under et 20x mikroskop hver dag de neste 3 dagene for å bestemme når du skal transdusere med luciferase. Cellene er klare når de klumper seg sammen og tømmer mediet, og gjør det fra rødt / rosa til lys oransje.
  2. Fremstilling av retronektinplater
    MERK: Retronectin brukes til å belegge platene som brukes i transduksjonen, da det forbedrer gentransduksjon15.
    1. Tilsett 2 ml 20 μg / ml retronectin i PBS til en brønn på en ubehandlet 6-brønnsplate. Inkuber i 2 timer ved RT eller 1 time ved 37 °C. En retronectin-belagt brønn er nødvendig for hver to millioner T-celler som skal transduceres.
    2. Aspirer retronectin uten å skrape bunnen av platen.
    3. Tilsett 3 ml 2% BSA i PBS (sterilfiltrert) per brønn i 6-brønnsplaten. Inkuber i 30 min ved RT.
  3. Spinokulasjon
    1. Aspirer BSA uten å skrape bunnen av platen.
    2. Vask brønnene én gang med 3 ml PBS per brønn. Fortsett eller erstatt med fersk PBS og la platen være dekket til ved 4 °C over natten.
    3. Tilsett 2 ml CBR-TDR luciferase viral supernatant (samlet i trinn 1.3) per brønn.
    4. Sentrifuge ved 1 240 x g i 90 minutter ved 32 °C.
  4. Transduksjon
    1. Tell T-cellene.
    2. Aspirer den virale supernatanten uten å skrape bunnen av platen.
    3. Plate to millioner T-celler per brønn i 6 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) som inneholder 30 IE / ml human IL-2.
    4. Undersøk T-cellene daglig. T-cellene er klare til å utvides når de er nesten sammenflytende, vanligvis etter 2 dager.
    5. Når cellene er nesten sammenflytende, vask dem forsiktig av bunnen av platen med en pipette og overfør hver brønn til en separat T75-kolbe. Tilsett 9 ml medier for totalt 15 ml medier per kolbe.
    6. Neste dag legger du til ytterligere 15 ml medier. Cellene skal være klare til å injiseres i mus dagen etter denne tilsetningen av media. Bekreft vellykket transduksjon ved å utføre flowcytometri (luciferase-konstruksjonen inneholder en TD-tomatfluorofor som er synlig i PE-kanalen)16.

3. Engraftment av luciferase-transducerte T-celler i immunkompromitterte mus

  1. Forbered og tell T-cellene for injeksjon.
    1. Fjern T-cellene fra kolbene og tell. Cellene er klare til å injiseres når de har utvidet seg 20x-30x, vanligvis innen dag 7 etter aktivering.
    2. Sentrifuger T-cellene ved 800 x g i 5 minutter. Bryt opp igjen i 2 ml medier og fjern perlene med et magnetstativ.
    3. For eksperimenter der T-celler skal injiseres separat fra bispesifikke antistoffer, telle T-cellene og resuspendere slik at den endelige konsentrasjonen er 20 millioner T-celler per 100 μL media. Gå til trinn 3.2. For eksperimenter med ex vivo væpnede T-celler (EAT), hopp til trinn 3.1.4.
    4. For eksperimenter med ex vivo væpnede T-celler, tell T-cellene og skill dem inn i individuelle 1,5 ml rør for hver gruppe, med 20 millioner celler per mus. For eksempel, hvis det er tre grupper med fem mus hver, lag tre 1,5 ml rør med 100 millioner T-celler hver.
    5. Sentrifuger rørene på 1,5 ml ved 800 x g i 5 minutter. Fjern mediet forsiktig uten å forstyrre T-cellepelleten. Resuspender i maksimalt 50 mikrol medier som inneholder de bispesifikke antistoffene. Inkuber ved RT i 30 min.
      MERK: I forbindelse med eksperimenter utført i denne studien ble proprietære IgG-[L]-scFv T-celleengasjerende bispesifikke antistoffer generert i laboratoriet brukt. For T-cellearmering, bruk 5 μg antistoff per 20 x 106 T-celler. Kommersielt tilgjengelige bispesifikke antistoffer kan også brukes.
    6. Vask bort overflødige antistoffer ved å legge til 1,450 μL media til hvert rør. Sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter, aspirer mediet forsiktig og resuspender ved en konsentrasjon på 20 millioner væpnede T-celler per 100 μL media.
  2. Injeksjon og innpoding i mus
    1. Bedøv musene i et kammer som leverer 3,5 % (v/v) inhalert isofluran i 1 l/min oksygen. Musene er fullt bedøvet når tilbaketrekningsrefleksen for bakre lemmer har forsvunnet.
      MERK: Gi termisk støtte gjennom hele prosedyren.
    2. Bruk en 26 G kanyle til å injisere 20 millioner T-celler i 100 μL medier retroorbitalt per mus.
    3. Administrer 1000 E rekombinant IL-2 subkutant for å støtte T-celleoverlevelse in vivo.
    4. Administrer de bispesifikke antistoffene retroorbitalt (i øyet som ikke brukes til T-celleinjeksjon) eller intraperitonealt. La musene komme seg fra anestesi og gå tilbake til burene sine.
      MERK: Igjen, her ble proprietære antistoffer som ble generert i laboratoriet brukt, men kommersielt tilgjengelige antistoffer kunne brukes i stedet. I forsøkene her ble det gitt 0,3-10 μg antistoff per mus per dose. Antistoffene ble gitt to ganger per uke i 3-4 uker.

4. In vivo avbildning av mus innpodet med luciferase-transducerte T-celler

MERK: Dette trinnet skal utføres på avbildningsdagen, som ikke nødvendigvis er samme dag som T-cellene og / eller antistoffene administreres til musene. Vanligvis utfører vi avbildning 24 timer etter administrering av luciferase-transducerte T-celler.

  1. Tilberedning av D-luciferin
    1. Løs opp 1 g D-luciferin i 33,3 ml steril PBS (endelig konsentrasjon: 30 mg/ml).
    2. Aliquot det oppløste D-luciferinet i 33 x 1,5 ml mikrosentrifugerør og hold rørene ved -20 °C.
    3. På avbildningsdagen tiner du nok alikoter med 30 mg/ml D-luciferin til at antall dyr kan avbildes. Ett rør er nok for 10 dyr.
      MERK: Frys resten av D-luciferin på nytt etter bruk. D-luciferin er stabilt i minst fem fryse-/tinesykluser.
  2. Administrering av D-luciferin til mus
    MERK: Før D-luciferin administreres til musene, må du åpne bildebehandlingsprogramvaren og initialisere systemet. Det kan ta flere minutter å avkjøle kameraet, og dette bør gjøres før musene injiseres med D-luciferin for å sikre at avbildning kan finne sted 5 minutter etter administrering av underlaget.
    1. Bedøv opptil fem mus i et kammer som leverer 3,5 % (v/v) inhalert isofluran i 1 l/min oksygen. Musene er fullt bedøvet når tilbaketrekningsrefleksen for bakre lemmer har forsvunnet.
    2. Når musene er fullstendig bedøvet, administrer 100 μL 30 mg / ml D-luciferin per mus (3 mg per mus) ved retroorbital injeksjon med en 26 G nål. Se for deg denne gruppen mus før D-luciferin administreres til neste gruppe. Plasser den neste gruppen mus i isoflurankammeret som skal bedøves mens den forrige gruppen blir avbildet.
  3. Avbildning av luciferase-transduserte T-celler
    1. Flytt de bedøvede musene til det lysetette kammeret i bildeapparatet og fortsett å administrere 3 % isofluran ved 0,5 l/min. Plasser musene på siden slik at flanken som bærer xenograftet vender opp mot kameraet. Ta et annet sett med bilder med musene i en liggende posisjon for å evaluere T-celle tilstedeværelse i lungene.
    2. Bruk Oppkjøpskontrollpanel til å velge Luminescerende, Fotografi og Overlegg. Sett eksponeringstiden til auto, binning til middels og F / stopp til 1. Skaff bilder. Etter det første bildet stiller du inn eksponeringstiden slik at den samsvarer med den som automatisk ble beregnet for det første bildet, slik at påfølgende bilder kan sammenlignes direkte. Det kan være nyttig å ta bilder med flere eksponeringstider for å bestemme den optimale eksponeringstiden for å oppnå det lyseste signalet uten pikselmetning.
    3. Fjern musene fra isofluran, gå tilbake til burene og observer til de er våkne og ambulerende.
    4. Gjenta trinnene fra trinn 4.2.1 til alle gruppene er avbildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrevet i trinn 4.3, kan mus orienteres i forskjellige posisjoner under avbildning for å evaluere tilstedeværelsen av T-celler i forskjellige vev. Liggende posisjonering gjør det mulig å vurdere T-celler i lungene, noe som er vanlig tidlig etter injeksjon. Lateral posisjonering med subkutan xenograft vendt opp brukes for best å vurdere T-celletrafikk til svulsten. Kvinnelige C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac mus ble brukt til alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet. Figur 1 viser bilder fra et eksperiment der mus med GD2-positive xenotransplantater ble behandlet med enten luciferase-transducerte T-celler bevæpnet ex vivo med GD2 BsAb eller luciferase-transducerte T-celler og GD2 BsAb injisert separat17. Figur 1A viser at væpnede T-celler trafikkerte til svulsten raskere enn ubevæpnede T-celler (figur 1B), og forlot lungene 2 dager tidligere. Figur 1C viser kvantifiseringen av dette fenomenet. Figur 1E-G viser at det er mulig å overvåke T-cellehandel i minst 28 dager etter injeksjon av luciferase-transducerte T-celler, slik at forskere kan spore T-cellehus og utholdenhet gjennom hele behandlingsforløpet, i motsetning til andre teknikker som immunhistokjemi (IHC) som bare tillater et øyeblikksbilde av T-celleinfiltrasjon.

Uten muligheten til å vurdere T-cellehandel in vivo, er forskere som tester T-BsAbs ikke i stand til å avgjøre hvorvidt T-celler infiltrerer og vedvarer i svulster under behandlingen. Hvis en behandling mislykkes, uten å ofre dyr og utføre IHC, kan det være vanskelig eller umulig å vite om feilen skyldtes mangel på T-cellehandel, utholdenhet, T-celleutmattelse eller annen årsak. Figur 2A-C viser et eksperiment der mus med brystkreftpasientderiverte xenotransplantater ble behandlet med luciferase-transducerte humane T-celler og HER2-målrettede BsAbs med forskjellige mutasjoner for å dempe Fc-funksjoner 7. Figur 2C viser at behandling med HER2 BsAb med en udempet Fc ikke hadde noen effekt på tumorvekst sammenlignet med en kontroll-BsAb, mens behandling med HER2 BsAbs som inneholdt en N297A-mutasjon alene eller i kombinasjon med en K322A-mutasjon kunne stoppe tumorveksten fullstendig. Figur 2A og figur 1B viser at i grupper med deaktiveringsmutasjonene nådde T-cellenes luminescenssignal en høyere topp på dag 3 etter injeksjon og vedvarte på et høyere nivå sammenlignet med kontroll-BsAb og ulydbar HER2 BsAb. Oppfølgingseksperimenter viste at hos mus behandlet med T-celler og BsAbs med unsilenced Fcs, var T-cellene i perivaskulære områder av lungene omgitt av murine nøytrofiler og makrofager, noe som tyder på en Fc-avhengig sekvestrasjon av BsAb-bundne T-celler som forhindrer migrasjon til svulsten. Den protumorigene effekten av tumorresidente M2-polariserte makrofager er godt beskrevet. Figur 3A,B viser at hos mus som bærer nevroblastom pasientavledede xenotransplantater (PDX), øker uttømming av Ly6c-positive makrofager signifikant T-cellehoming til svulster, noe som resulterer i redusert tumorvekst og forlenget overlevelse (figur 3C) 18. Denne effekten er enda mer uttalt i osteosarkom PDX (figur 3D).

In vivo T-cellesporing gjør det også mulig for forskere å overvåke hvordan T-celletrafikkkinetikken påvirkes av andre variabler i antistoffteknikk, inkludert strukturell konfigurasjon. Som beskrevet i introduksjonen av denne artikkelen, har tidligere arbeid i laboratoriet vårt understreket betydningen av bivalens og cis-orientering av tumor- og T-cellebindende armer for in vivo-effekten av BsAbs. Figur 4 viser at blant et panel av BsAbs rettet mot tumorantigenet STEAP1 (figur 4A) ga IgG-[L]-scFv-formatet signifikant mer T-celleinfiltrasjon dag 6 etter første dose T-celler, som vedvarte så lenge behandlingen varte (figur 4C)10. Dette fenomenet ble ikke predikert av in vitro cytotoksisitetstester (figur 4B), som understreker viktigheten av å bekrefte in vitro-resultater i in vivo-modeller.

Figure 1
Figur 1: Bevæpnede T-celler utviser raskere tumorhoming-kinetikk enn BsAb-rettede ubevæpnede T-celler, og omgår raskt lungesekvestrasjon. Luciferase-transducerte T-celler ble utvidet og bevæpnet med BsAb (Luc(+) GD2-EATs). Luc(+) GD2-EATs (10 μg GD2-BsAb/2×10, 7 T-celler) eller Luc(+) ubevæpnede T-celler (2 x 10,7 celler) med eller uten GD2-BsAb (10 μg) ble administrert intravenøst til GD2-positive neuroblastom, PDX-bærende mus når gjennomsnittlig tumorvolum nådde 100 mm3. (A) Bioluminescensbilder av GD2-EATs som smugler inn i svulster. (B) Bioluminescensbilder av GD2 BsAb-rettet ubevæpnet T-cellehandel inn i svulster over dager. (C) Kvantifisering av T-celleinfiltrasjon i svulster over tid målt ved bioluminescens (n = 5 mus / gruppe) uttrykt som total fluks eller utstråling (fotoner / s) per piksel integrert over tumorkonturen (ROI). (D) Tumorvekstkurver for individuelle mus behandlet med GD2-EAT, GD2-BsAb pluss ubevæpnede T-celler eller ubevæpnede T-celler. For å teste in vivo-persistensen til målantigenspesifikke EAT-er, ble Luc(+) GD2-EATs (bevæpnet med 10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-celler) eller Luc(+) HER2-EATs (10 μg HER2-BsAb/2×107 T-celler) intravenøst administrert til osteosarkom TEOS1C PDX-bærende mus. Ytterligere to doser ikke-luciferase-transduserte GD2-EATs eller HER2-EATs ble administrert på dag 7 og dag 14. (E) Kvantifisering av bioluminescens av Luc (+) EATs i svulster etter behandling. (F) Tumorvekstkurver for individuelle mus behandlet med GD2-EATs, HER2-EATs eller ubevæpnede T-celler, eller ingen behandling. (G) Bioluminescensbilder av Luc(+) GD2-EATs (øvre) eller Luc(+) HER2-EATs (nedre) i svulster over tid. Bioluminescens av Luc(+) EATs ble påvist over 28 dager etter injeksjon. Forkortelser: EATs = ex vivo væpnede T-celler; ROI = interesseområde. Feilfelt angir standardfeilen til gjennomsnittet. Denne figuren er modifisert fra Park et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: T-celletrafikk til HER2-positiv human brystkreft PDX i DKO-mus. (A) Representative bioluminescensbilder av T-cellehandel. (B) Kvantifisering av T-celletrafikk til svulster over tid ved bioluminescens (n = 5 mus / gruppe) uttrykt som total fluks eller utstråling (fotoner / s) i hver piksel integrert over hele tumorkonturen (ROI). (C) HER2-positiv PDX-vekst (M37) for brystkreft (n = 5 mus/gruppe) etter behandling med Ctrl BsAb, HER2 BsAb og dets Fc-mutanter. Resultatene som vises er representative resultater fra minst tre uavhengige eksperimenter. De signifikante forskjellene ble beregnet ut fra arealet under kurven (AUC). Feilfelt angir standardfeilen til gjennomsnittet. Denne figuren er modifisert fra Wang et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effektene av monocyttuttømming på BsAb-rettet T-cellehandel og in vivo antitumorrespons. (A) Luciferase-transducerte T-celler (Luc(+) T-celler) eller luciferase-transduserte GD2-BsAb-væpnede T-celler (Luc(+) GD2-EATs) ble administrert med anti-Ly6C-antistoff mot musene som hadde et nevroblastom-pasientderivert xenograft (PDX). (B) Bioluminescens i lesjonene i svulsten ble overvåket. Bioluminescensbildene på dag 7 og kvantifisering av bioluminescensen i svulstens lesjoner. (C) In vivo antitumorrespons av GD2-EATs med anti-Ly6C antistoff ble testet mot neuroblastom PDX. (D) In vivo antitumoreffekt av GD2-EATs med anti-Ly6C antistoff ble testet mot osteosarkom PDX, og langsiktig overlevelse ble analysert. Feilfelt angir standardfeilen til gjennomsnittet. In vivo antitumoreffekt ble sammenlignet med AUC- og overlevelseskurveanalyser. Tumorinfiltrerende lymfocytter ble kvantifisert ved bruk av AUC for bioluminescens. Forskjeller mellom prøvene angitt i figuren ble testet for statistisk signifikans ved hjelp av en tosidig Student t-test for to sett med data og enveis ANOVA med Tukeys post hoc-test for tre eller flere sett med data. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Park et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Antitumoraktiviteter av anti-STEAP1 T-celleengasjerende bispesifikt antistoff. (A) Skjematisk fremstilling av de seks strukturformatene til STEAP1 BsAb. (B) Antistoffavhengig T-cellemediert cytotoksisitet (ADTC)-analyse mot EFT-cellelinjer (TC32 ad TC71) ved bruk av forskjellige formater av STEAP1 BsAb. Forholdet mellom effektor og mål (ET) var 10:1. (C) Bioluminescensavbildning (BLI) av Luc (+) T-celler bevæpnet med seks forskjellige formater av STEAP1 BsAb på (a) dag 6 og (b) dag 18 etter behandling og kvantifisering av bioluminescensintensitet i svulstens lesjoner. Luciferase-transduserte T-celler (Luc(+) T-celler) ble bevæpnet med forskjellige formater av STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb/2 x 107 T-celler) og administrert med supplerende IL-2 (1000 IE/dose) til musene med EFT PDX (ES15a), og BLIfollowed. Forkortelser: EFT = Ewing sarkom familie av svulster; PDX = pasientavledede tumorxenotransplantater; STEAP = seks-transmembran epitelial antigen av prostata. Feilfelt angir standardfeil for gjennomsnittet. Tumorinfiltrerende lymfocytter ble kvantifisert ved å beregne arealet under kurven for bioluminescensen. Forskjeller mellom prøvene angitt i figuren ble testet for statistisk signifikans ved bruk av enveis ANOVA med Tukeys post hoc-test. p < 0,0001. Denne figuren er modifisert fra Lin et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens T-BsAb blinatumomab er godkjent for CD19-positive hematologiske maligniteter, har vellykket implementering av T-BsAbs i solide tumorer vist seg mye vanskeligere. Catumaxomab, et T-BsAb rettet mot epitelcelleadhesjonsmolekyl (EPCAM), ble godkjent for behandling av ondartede ascites hos eggstokkreftpasienter, men produksjonen av legemidlet ble senere stanset av kommersielle årsaker19. Ingen andre T-BsAbs har blitt godkjent for solide svulster, noe som understreker utfordringene forbundet med denne typen terapi. Toksisitet på grunn av cytokin frigjøringssyndrom (CRS) er et vanlig problem, selv om dette kan håndteres med steroider og cytokinhemmere. I tillegg til toksisitet er mangel på effekt vanlig i studier av T-BsAbs for solide svulster. Indusering av T-celletrafikk og persistens i svulsten har vist seg vanskelig, sannsynligvis på grunn av ulike immunsuppressive faktorer i TME14. Men selv preklinisk er det ofte uklart hvorfor en T-BsAb som fungerer godt in vitro ikke effektivt behandler svulster in vivo.

Metoden for sporing av T-celler in vivo i sanntid beskrevet i denne artikkelen er nyttig for forskere av flere grunner. Overvåking av T-cellehus gir mekanistisk innsikt i hvorfor visse T-BsAbs lykkes eller mislykkes ved å la forskere bestemme når T-celletrafikk har begynt og hvor lenge T-cellene har vedvart i svulsten under behandlingen. Metoden kan gjentas på flere tidspunkter, slik at forskerne kan plotte kinetikken til T-cellehoming i løpet av flere uker. (Representative resultater i figur 1 viser at T-celler vedvarer i svulsten i minst 28 dager.) In vivo avbildning av luciferase-transduserte T-celler eliminerer også behovet for å ofre dyr under behandling for histologisk vurdering av T-celleinfiltrasjon, noe som reduserer den totale kostnaden og antall dyr som trengs per eksperiment. Fordi avbildningen kan gjentas så ofte som nødvendig, tillater den også en mye enklere og grundigere evaluering av T-cellehoming kinetikk sammenlignet med histologisk analyse, som egentlig er et øyeblikksbilde av et enkelt tidspunkt, med mindre flere dyr ofres på forskjellige tidspunkter.

Det mest kritiske trinnet i denne metoden er vellykket transduksjon av T-celler med luciferase-konstruksjonen. Mislykket transduksjon kan føre til T-celledød eller mangel på luciferasesignal in vivo. Hvis T-celler ikke ekspanderer som forventet etter transduksjon, kan det være mulig å redusere virustiteren som de transduseres med for å redusere potensiell toksisitet fra transduksjonsprosessen. En annen tilnærming ville være å vente en annen dag mellom T-celleutvidelsestrinnene for å tillate at T-cellene blir mer konfluente før de utvides til et større cellekulturbeholder. Før du injiserer T-cellene i musene, er det en god ide å bekrefte transduksjonssuksess ved hjelp av flowcytometri (for å sjekke om TD-tomatreporteren er ekspresjon) eller en bioluminescerende plateleser. Hvis de transducerte T-cellene fortsatt ikke er synlige med bioluminescerende avbildning, kan det være mulig at antall T-celler er for lavt for deteksjon ved hjelp av denne teknikken. Rabinovich et al. beskriver en lignende metode ved hjelp av forbedret firefly luciferase for å oppdage så få som 10 murine T-celler, som kan implementeres i situasjoner som krever dette følsomhetsnivået20.

Oppsummert gir in vivo-sporing av luciferase-transduserte T-celler et verdifullt verktøy for forskere som studerer T-BsAbs i immunkompromitterte musemodeller av kreft. I tillegg til applikasjonene som er diskutert ovenfor, har denne metoden for T-cellesporing blitt brukt på kimære antigenreseptor (CAR) T-celler og kan tilsynelatende brukes på syngene musemodeller som bruker adoptivoverførte T-celler også21. Vi håper at denne strategien vil være nyttig for forskere som utvikler translasjonelle T-BsAbs og vil føre til økt suksess for disse terapiene hos pasienter med solide svulster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NKC rapporterer å motta kommersielle forskningsstipendier fra Y-mAbs Therapeutics. NKC er oppfinner og eier av utstedte patenter lisensiert av MSK til Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon / Lallemand og Abpro-labs. MSK og NKC har økonomiske interesser i Y-mAbs. NKC rapporterer å motta aksjeopsjoner fra Eureka Therapeutics. HFG og MEC har ingen relevante avsløringer.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Vladimir Ponomarev for å dele luciferase-konstruksjonene som brukes i forsøkene beskrevet i delen om representative resultater i denne artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Cancer Research bispesifikke antistoffer T-celle engagers luciferase T-celler xenotransplantater
Sporing av bispesifikk antistoffindusert T-cellehandel ved bruk av Luciferase-transducerte humane T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter