Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Sporing af bispecifik antistofinduceret T-cellehandel ved hjælp af luciferase-transducerede humane T-celler

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Her beskriver vi en metode til transducering af humane T-celler med luciferase for at lette in vivo-sporing af bispecifik antistofinduceret T-cellehandel til tumorer i undersøgelser for at evaluere antitumoreffekten og mekanismen for T-celleengagerende bispecifikke antistoffer.

Abstract

T-celleengagerende bispecifikke antistoffer (T-BsAbs) er i forskellige stadier af præklinisk udvikling og klinisk test for solide tumorer. Faktorer som valens, rumligt arrangement, interdomain afstand og Fc-mutationer påvirker antitumoreffektiviteten af disse terapier, almindeligvis ved at påvirke homing af T-celler til tumorer, hvilket fortsat er en stor udfordring. Her beskriver vi en metode til at transducere aktiverede humane T-celler med luciferase, hvilket muliggør in vivo-sporing af T-celler under T-BsAb-terapistudier. T-BsAbs evne til at omdirigere T-celler til tumorer kan kvantitativt evalueres på flere tidspunkter under behandlingen, så forskere kan korrelere antitumoreffektiviteten af T-BsAbs og andre interventioner med persistensen af T-celler i tumorer. Denne metode lindrer behovet for at ofre dyr under behandlingen for histologisk at vurdere T-celleinfiltration og kan gentages på flere tidspunkter for at bestemme kinetikken af T-cellehandel under og efter behandlingen.

Introduction

T-celleengagerende bispecifikke antistoffer (T-BsAbs) er konstruerede antistoffer, der anvendes til at tilvejebringe kunstig specificitet til polyklonale T-celler ved at engagere T-celler gennem en bindingsarm og et tumorantigen gennem en anden bindingsarm. Denne teknologi er med succes blevet anvendt til hæmatologiske kræftformer (CD19-målrettet blinatumomab1), og adskillige T-BsAbs er også i præklinisk og klinisk udvikling for en række solide tumorer2. T-BsAbs engagerer polyklonale T-celler på en større histokompatibilitetskompleks (MHC) -uafhængig måde, og derfor er selv tumorer, der nedregulerer humane leukocytantigener (HLA'er), modtagelige for denne type terapi 3,4. T-BsAbs er udviklet i snesevis af forskellige formater med forskelle i valens og rumligt arrangement af T-celle- og tumorbindingsarme, interdomæneafstande og inkludering af et Fc-domæne, hvilket påvirker halveringstiden og kan fremkalde effektorfunktioner, hvis de er til stede5. Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist, at disse faktorer signifikant påvirker antitumoreffekten af T-BsAbs, med op til 1.000 gange forskelle i styrke6. Gennem dette arbejde identificerede vi IgG-[L]-scFv-formatet som den ideelle platform til T-BsAbs (se afsnittet Repræsentative resultater for flere detaljer om T-BsAb-formater) og har anvendt denne platform til mål, herunder GD2 (neuroblastom), HER2 (brystkræft og osteosarkom), GPA33 (kolorektal cancer), STEAP1 (Ewing Sarcoma), CD19 (B-cellemaligniteter) og CD33 (B-cellemaligniteter)7, 8,9,10,11,12,13.

En af de største udfordringer for en vellykket implementering af T-BsAb-terapi i solide tumorer er at overvinde et immunsuppressivt tumormikromiljø (TME) for at drive T-cellehandel til tumorer14. De faktorer, der påvirker T-BsAb-effekten beskrevet ovenfor, har en betydelig indvirkning på T-BsAbs evne til effektivt at inducere T-celle homing til tumorer, men denne effekt er vanskelig at evaluere i et in vivo-system i realtid. Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af brugen af luciferase-transducerede T-celler i prækliniske studier af T-BsAbs til evaluering af T-cellehandel til forskellige væv i eksperimentelle immunkompromitterede musemodeller under behandlingen. Det overordnede mål med denne metode er at give et middel til at evaluere T-celleinfiltration i tumorer og andre væv samt realtidsindsigt i T-celle homing kinetik og persistens uden behov for at ofre dyr under behandlingen. For det stigende antal forskere, der fokuserer på cellulære immunterapier, er evnen til at spore T-celler in vivo i prækliniske dyremodeller afgørende. Vi tilstræber at give en grundig, detaljeret beskrivelse af den metode, vi har anvendt til sporing af luciferase-transducerede T-celler, så andre forskere nemt kan replikere denne teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende procedurer er blevet evalueret og godkendt af Memorial Sloan Ketterings Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Transfektion af 293T-celler med luciferase og høst af viral supernatant

  1. Kultur af 293T-celler
    1. Forbered medier ved at tilføje følgende til en liter DMEM hver: 110 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 11 ml penicillin-streptomycin.
    2. 5 x 106 293T-celler optøs og overføres til en T175-kolbe med mediet fremstillet som beskrevet ovenfor.
    3. Opdel 293T-cellerne 1:10 hver 3. dag i 6 dage. Lad ikke cellerne blive mere end 90% sammenflydende.
  2. Transfektion af 293T-celler
    BEMÆRK: Følgende mængder reagenser beregnes til transfektering af en T175-kolbe med 293T-celler. Der indstilles tilsvarende, hvis der skal transduceres flere kolber.
    1. Overfør 1,5 ml medier til hvert af de to 50 ml rør ved hjælp af en pipette. Til et rør tilsættes 10 μg VSV-G-plasmid, 20 μg Gag/pol og 20 μg klikbillerød TD-tomat (CBR-TDR) luciferase plasmid og blandes. Til det andet rør tilsættes 100 μL DNA in vitro transfektionsreagens og blandes. Begge glas inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
      BEMÆRK: Alle plasmider beskrevet i dette manuskript blev leveret af Dr. Vladimir Ponomarev.
    2. Mediet indeholdende in vitro-transfektionsreagenset overføres dråbevis til røret indeholdende DNA-plasmiderne (over ca. 30 s) og blandes forsigtigt med en pipette. Inkuber ved RT i 20 min.
    3. I løbet af denne 20 minutters inkubation løsnes 293T-cellerne ved at tilsætte 5-10 ml 0,05% trypsin. Når cellerne har løsnet sig, tilsættes 10 ml medie og centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter. Resuspender cellerne i 1,5 ml medier.
    4. Der tilsættes medier indeholdende in vitro-transfektionsreagenset DNA og DNA-plasmiderne til 293T-cellerne, og der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
    5. Overfør til en T175-kolbe, og tilsæt 18 ml medie. Der inkuberes ved 37 °C natten over.
    6. Den næste dag skal du forsigtigt aspirere medierne med en glaspipette uden at løsne cellerne. Udskift med 18 ml friske medier. Der inkuberes ved 37 °C natten over i en inkubator.
  3. Høst af viral supernatant
    1. Den virale supernatant fjernes med en pipette lagt på is. Centrifuger ved 800 x g i 5 minutter for at pelletere celler og snavs.
      BEMÆRK: Hvis cellepillen er stor, blev cellerne sandsynligvis forstyrret fra kolben, da supernatanten blev fjernet. Disse celler kan belægges igen i en ny kolbe med friske medier.
    2. Virussupernatanten filtreres med et 0,22 μm filter.
    3. Viral supernatant anvendes straks. Opbevar den på is eller ved 4 °C i op til 24 timer, eller frys den ved -80 °C til langtidsopbevaring.

2. Udvidelse og transduktion af aktiverede humane T-celler med luciferase

  1. Aktivering af humane T-celler in vitro
    1. Puds perlerne ved at tilsætte 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til et sterilt 15 ml rør, tilsæt perler (en perle pr. to T-celler), anbring i et magnetstativ i 2 minutter og sug PBS ud.
    2. Klargør medier som beskrevet i trin 1.1.1, tilsæt derefter IL-2 til en slutkoncentration på 30 IE/ml, og tilsæt de vaskede perler. Lav 2,5 ml medier for hver to millioner T-celler, der skal aktiveres.
    3. Tæl T-cellerne (friskrenset eller tidligere renset, frosset, optøet og vasket) ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblå plet. Der tilsættes T-celler til det i trin 2.1.2 fremstillede medium, og vend forsigtigt glasset om for at blande. T-cellerne udvides mindst 20x afhængigt af cellernes kilde og generelle sundhed. Bestem antallet af T-celler, der skal aktiveres, ved at beregne det antal, der er nødvendigt for at behandle musene og dividere med 20. Her blev der brugt 20 x 106 T-celler pr. mus baseret på foreløbige forsøg.
    4. Plade 2,5 ml medier indeholdende to millioner T-celler, perler og IL-2 i hver brønd i en 24-brønds vævskulturplade. Kultur ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 inkubator.
    5. Undersøg T-cellerne under et 20x mikroskop hver dag i de næste 3 dage for at bestemme, hvornår de skal transduceres med luciferase. Cellerne er klar, når de klumper sig sammen og nedbryder mediet og gør det fra rød/pink til lysorange.
  2. Fremstilling af retronectinplader
    BEMÆRK: Retronectin bruges til at belægge pladerne, der anvendes i transduktionen, da det forbedrer gentransduktion15.
    1. Tilsæt 2 ml 20 μg / ml retronectin i PBS til en brønd af en ubehandlet 6-brøndplade. Der inkuberes i 2 timer ved RT eller 1 time ved 37 °C. Der kræves en retronectinbelagt brønd for hver to millioner T-celler, der skal transduceres.
    2. Opsug retronectin uden at ridse bunden af pladen.
    3. Der tilsættes 3 ml 2 % BSA i PBS (sterilfiltreret) pr. hul i 6-brøndspladen. Inkuber i 30 minutter ved RT.
  3. Spinokulation
    1. Opsug BSA uden at ridse bunden af pladen.
    2. Brøndene vaskes én gang med 3 ml PBS pr. hul. Fortsæt eller udskift med frisk PBS, og lad pladen være tildækket ved 4 °C natten over.
    3. Der tilsættes 2 ml CBR-TDR luciferase viral supernatant (indsamlet i trin 1.3) pr. hul.
    4. Der centrifugeres ved 1.240 x g i 90 minutter ved 32 °C.
  4. Transduktion
    1. Tæl T-cellerne.
    2. Opsug den virale supernatant uden at ridse bunden af pladen.
    3. Plade to millioner T-celler pr. brønd i 6 ml af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 30 IE / ml human IL-2.
    4. Undersøg T-cellerne dagligt. T-cellerne er klar til at blive udvidet, når de næsten er sammenflydende, normalt efter 2 dage.
    5. Når cellerne er næsten sammenflydende, vaskes de forsigtigt af bunden af pladen med en pipette og overføres hvert hul til en separat T75-kolbe. Der tilsættes 9 ml medier til i alt 15 ml medier pr. kolbe.
    6. Den næste dag skal du tilføje yderligere 15 ml medier. Cellerne skal være klar til at injicere i mus dagen efter denne tilsætning af medier. Bekræft vellykket transduktion ved at udføre flowcytometri (luciferasekonstruktionen indeholder en TD-tomatfluorofor, der er synlig i PE-kanalen)16.

3. Engraftment af luciferase-transducerede T-celler i immunkompromitterede mus

  1. Klargør og tæl T-cellerne til injektion.
    1. T-cellerne fjernes fra kolberne og tæller. Cellerne er klar til at injicere, når de har udvidet sig 20x-30x, normalt på dag 7 efter aktivering.
    2. T-cellerne centrifugeres ved 800 x g i 5 min. Resuspender i 2 ml medie og fjern perlerne ved hjælp af et magnetstativ.
    3. For forsøg, hvor T-celler injiceres separat fra bispecifikke antistoffer, tælles T-cellerne og resuspenderes, så den endelige koncentration er 20 millioner T-celler pr. 100 μL medier. Gå videre til trin 3.2. For eksperimenter, der anvender ex vivo-væbnede T-celler (EAT'er), skal du gå videre til trin 3.1.4.
    4. For eksperimenter med ex vivo-væbnede T-celler tælles T-cellerne og adskilles i individuelle 1,5 ml rør for hver gruppe med 20 millioner celler pr. Mus. For eksempel, hvis der er tre grupper på fem mus hver, skal du forberede tre 1,5 ml rør med 100 millioner T-celler hver.
    5. Centrifuger de 1,5 ml rør ved 800 x g i 5 min. Fjern mediet forsigtigt uden at forstyrre T-cellepelleten. Resuspenderes i højst 50 μL medier, der indeholder de bispecifikke antistoffer. Inkuber ved RT i 30 min.
      BEMÆRK: Med henblik på eksperimenter udført i denne undersøgelse blev proprietære IgG-[L]-scFv T-celleengagerende bispecifikke antistoffer genereret i laboratoriet anvendt. Til T-cellearmning skal du bruge 5 μg antistof pr. 20 x 106 T-celler. Kommercielt tilgængelige bispecifikke antistoffer kan også anvendes.
    6. Overskydende antistoffer vaskes væk ved at tilsætte 1.450 μL medier til hvert rør. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter, centrifugeres forsigtigt, og resuspenderes i en koncentration på 20 millioner bevæbnede T-celler pr. 100 μL medie.
  2. Injektion og indkapsling i mus
    1. Bedøv musene i et kammer, der leverer 3,5% (v / v) inhaleret isofluran i 1 l / min ilt. Musene bedøves fuldt ud, når pedaludtagningsrefleksen på bagbenet er forsvundet.
      BEMÆRK: Giv termisk støtte under hele proceduren.
    2. Brug en 26 G nål til at injicere 20 millioner T-celler i 100 μL medier retroorbitalt pr. mus.
    3. Administrer 1.000 U rekombinant IL-2 subkutant for at understøtte T-celleoverlevelse in vivo.
    4. Administrer de bispecifikke antistoffer retroorbitalt (i øjet, der ikke anvendes til T-celleinjektion) eller intraperitonealt. Lad musene komme sig efter anæstesi og vende tilbage til deres bur.
      BEMÆRK: Igen, her blev proprietære antistoffer, der blev genereret i laboratoriet, brugt, men kommercielt tilgængelige antistoffer kunne bruges i stedet. I forsøgene her blev 0,3-10 μg antistof pr. mus pr. dosis administreret. Antistofferne blev administreret to gange om ugen i 3-4 uger.

4. In vivo-billeddannelse af mus podet med luciferase-transducerede T-celler

BEMÆRK: Dette trin skal udføres på billeddannelsesdagen, hvilket ikke nødvendigvis er samme dag, som T-cellerne og/eller antistofferne administreres til musene. Typisk udfører vi billeddiagnostik 24 timer efter administration af luciferase-transducerede T-celler.

  1. Fremstilling af D-luciferin
    1. 1 g D-luciferin opløses i 33,3 ml steril PBS (slutkoncentration: 30 mg/ml).
    2. Det opløste D-luciferin hældes i 33 x 1,5 ml mikrocentrifugeglas, og glassene opbevares ved -20 °C.
    3. På billeddannelsesdagen optøs tilstrækkeligt mange delprøver af 30 mg/ml D-luciferin til, at der kan tages billeder af det antal dyr, der skal tages billeder af. Et rør er nok til 10 dyr.
      BEMÆRK: Genfrys det resterende D-luciferin efter brug. D-luciferin er stabil i mindst fem fryse-/optøningscyklusser.
  2. Administration af D-luciferin til mus
    BEMÆRK: Før du administrerer D-luciferin til musene, skal du åbne billedbehandlingssoftwaren og initialisere systemet. Kameraet kan tage flere minutter at afkøle, og dette bør gøres, før musene injiceres med D-luciferin for at sikre, at billeddannelse kan finde sted 5 minutter efter administration af substratet.
    1. Bedøv op til fem mus i et kammer, der leverer 3,5% (v / v) inhaleret isofluran i 1 l / min ilt. Musene bedøves fuldt ud, når pedaludtagningsrefleksen på bagbenet er forsvundet.
    2. Når musene er fuldt bedøvet, administreres 100 μL 30 mg/ml D-luciferin pr. mus (3 mg pr. mus) ved retroorbital injektion med en 26 G kanyle. Forestil dig denne gruppe mus, før du administrerer D-luciferin til den næste gruppe. Placer den næste gruppe mus i isoflurankammeret, der skal bedøves, mens den forrige gruppe afbildes.
  3. Billeddannelse af luciferase-transducerede T-celler
    1. Flyt de bedøvede mus til billedapparatets lystætte kammer og fortsæt med at administrere 3% isofluran ved 0,5 l / min. Placer musene på siden, så flanken, der bærer xenograften, vender opad mod kameraet. Tag et andet sæt billeder med musene i liggende stilling for at evaluere T-celle tilstedeværelse i lungerne.
    2. Brug kontrolpanelet til anskaffelse til at vælge Selvlysende, Fotografi og Overlejring. Indstil eksponeringstiden til auto, binning til medium og F/Stop til 1. Hent billeder. Efter det første billede skal du indstille eksponeringstiden, så den svarer til den, der automatisk blev beregnet for det første billede, så efterfølgende billeder kan sammenlignes direkte. Det kan være nyttigt at tage billeder med flere eksponeringstider for at bestemme den optimale eksponeringstid for at opnå det lyseste signal uden pixelmætning.
    3. Fjern musene fra isofluran, vend tilbage til deres bure og observer, indtil de er vågne og ambulante.
    4. Gentag trinnene fra trin 4.2.1, indtil alle grupper er blevet afbildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrevet i trin 4.3 kan mus orienteres i forskellige positioner under billeddannelse for at evaluere tilstedeværelsen af T-celler i forskellige væv. Liggende positionering muliggør vurdering af T-celler i lungerne, hvilket er almindeligt på tidlige tidspunkter efter injektion. Lateral positionering med den subkutane xenograft opad bruges til bedst at vurdere T-cellehandel til tumoren. Hunmus C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac blev brugt til alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript. Figur 1 viser billeder fra et eksperiment, hvor mus med GD2-positive xenotransplantater blev behandlet med enten luciferase-transducerede T-celler bevæbnet ex vivo med en GD2 BsAb eller luciferase-transducerede T-celler og GD2 BsAb injiceret separat17. Figur 1A viser, at væbnede T-celler handles til tumoren hurtigere end ubevæbnede T-celler (figur 1B), hvilket forlader lungerne 2 dage tidligere. Figur 1C viser kvantificeringen af dette fænomen. Figur 1E-G viser, at det er muligt at overvåge T-cellehandel i mindst 28 dage efter injektion af luciferase-transducerede T-celler, hvilket gør det muligt for forskere at spore T-cellehoming og persistens i hele behandlingsforløbet, i modsætning til andre teknikker såsom immunhistokemi (IHC), som kun tillader et øjebliksbillede af T-celleinfiltration.

Uden evnen til at vurdere T-cellehandel in vivo er forskere, der tester T-BsAbs, ikke i stand til at afgøre, om T-celler infiltrerer og vedvarer i tumorer under behandlingen. Hvis en behandling mislykkes uden at ofre dyr og udføre IHC, kan det være svært eller umuligt at vide, om fejlen skyldtes manglende T-cellehandel, persistens, T-celleudmattelse eller en anden årsag. Figur 2A-C viser et eksperiment, hvor mus med brystkræftpatientafledte xenotransplantater blev behandlet med luciferase-transducerede humane T-celler og HER2-målrettede BsAbs, der bærer forskellige mutationer for at dæmpe Fc-funktioner 7. Figur 2C viser, at behandling med HER2 BsAb med en ikke-tavs Fc ikke havde nogen effekt på tumorvækst sammenlignet med en kontrol BsAb, hvorimod behandling med HER2 BsAbs indeholdende en N297A-mutation alene eller i kombination med en K322A-mutation var i stand til fuldstændigt at standse tumorvækst. Figur 2A og figur 1B viser, at i grupper med hæmningsmutationerne nåede T-cellernes luminescenssignal en højere top på dag 3 efter injektion og fortsatte på et højere niveau sammenlignet med kontrol BsAb og uhæmmet HER2 BsAb. Opfølgningsforsøg viste, at hos mus behandlet med T-celler og BsAbs med uhæmmet Fcs var T-cellerne i perivaskulære områder af lungerne omgivet af murine neutrofiler og makrofager, hvilket tyder på en Fc-afhængig sekvestrering af de BsAb-bundne T-celler, som forhindrer migration til tumoren. Den protumorigene virkning af tumorresidente M2-polariserede makrofager er velbeskrevet. Figur 3A,B viser, at hos mus, der bærer neuroblastom patientafledte xenotransplantater (PDX'er), øger udtømning af Ly6c-positive makrofager signifikant T-cellehoming til tumorer, hvilket resulterer i nedsat tumorvækst og forlænget overlevelse (figur 3C)18. Denne effekt er endnu mere udtalt i osteosarkom PDX'er (figur 3D).

In vivo T-cellesporing giver også forskere mulighed for at overvåge, hvordan T-cellehandelskinetik påvirkes af andre variabler inden for antistofteknik, herunder strukturel konfiguration. Som beskrevet i indledningen til denne artikel understregede tidligere arbejde i vores laboratorium vigtigheden af bivalens og cis-orientering af tumor- og T-cellebindende arme for in vivo-effekten af BsAbs. Figur 4 viser, at blandt et panel af BsAb'er, der var rettet mod tumorantigenet STEAP1 (figur 4A), resulterede IgG-[L]-scFv-formatet i signifikant mere T-celleinfiltration på dag 6 efter den første dosis T-celler, som varede under hele behandlingen (figur 4C)10. Dette fænomen blev ikke forudsagt af in vitro cytotoksicitetsassays (figur 4B), hvilket understreger vigtigheden af at bekræfte in vitro-resultater i in vivo-modeller.

Figure 1
Figur 1: Bevæbnede T-celler udviser hurtigere tumorhoming-kinetik end BsAb-rettede ubevæbnede T-celler, der hurtigt omgår lungesekvestrering. Luciferase-transducerede T-celler blev udvidet og bevæbnet med BsAb (Luc (+) GD2-EAT'er). Luc(+) GD2-EAT'er (10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-celler) eller Luc(+) ubevæbnede T-celler (2 x 107 celler) med eller uden GD2-BsAb (10 μg) blev administreret intravenøst i GD2-positive PDX-bærende neuroblastommus, når det gennemsnitlige tumorvolumen nåede 100 mm3. (A) Bioluminescensbilleder af GD2-EAT'er, der handler ind i tumorer. (B) Bioluminescensbilleder af GD2 BsAb-rettet ubevæbnet T-cellehandel i tumorer over dage. (C) Kvantificering af T-celleinfiltration i tumorer over tid målt ved bioluminescens (n = 5 mus / gruppe) udtrykt som total flux eller udstråling (fotoner / s) pr. pixel integreret over tumorkonturen (ROI). (D) Tumorvækstkurver for individuelle mus behandlet med GD2-EAT'er, GD2-BsAb plus ubevæbnede T-celler eller ubevæbnede T-celler. For at teste in vivo-persistensen af målantigenspecifikke EAT'er blev Luc(+) GD2-EAT'er (bevæbnet med 10 μg GD2-BsAb/2×10 7 T-celler) eller Luc(+) HER2-EAT'er (10 μg HER2-BsAb/2×107 T-celler) administreret intravenøst i osteosarkom TEOS1C PDX-bærende mus. To yderligere doser af ikke-luciferase transducerede GD2-EATs eller HER2-EATs blev administreret på dag 7 og dag 14. (E) Kvantificering af bioluminescens af Luc(+) EATs i tumorer efter behandling. (F) Tumorvækstkurver for individuelle mus behandlet med GD2-EAT'er, HER2-EATT'er eller ubevæbnede T-celler eller ingen behandling. (G) Bioluminescensbilleder af Luc (+) GD2-EATs (øvre) eller Luc (+) HER2-EATs (nedre) i tumorer over tid. Bioluminescens af Luc(+) EATs blev påvist over 28 dage efter injektion. Forkortelser: EATs = ex vivo væbnede T-celler; ROI = region af interesse. Fejlbjælker angiver standardfejlen i middelværdien. Dette tal er ændret fra Park et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: T-cellehandel til HER2-positiv human brystkræft PDX i DKO-mus. (A) Repræsentative bioluminescensbilleder af handel med T-celler. (B) Kvantificering af T-cellehandel i tumorer over tid ved bioluminescens (n = 5 mus / gruppe) udtrykt som total flux eller udstråling (fotoner / s) i hver pixel integreret over hele tumorkonturen (ROI). (C) HER2-positiv brystkræft PDX (M37) vækst (n = 5 mus/gruppe) efter behandling med Ctrl BsAb, HER2 BsAb og dets Fc-mutanter. De viste resultater er repræsentative resultater fra mindst tre uafhængige eksperimenter. De signifikante forskelle blev beregnet ud fra arealet under kurven (AUC). Fejlbjælker angiver standardfejlen i middelværdien. Denne figur er blevet ændret fra Wang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Virkningerne af monocytudtømning på BsAb-rettet T-cellehandel og in vivo-antitumorrespons. (A) Luciferasetransducerede T-celler (Luc(+) T-celler) eller luciferase transducerede GD2-BsAb væbnede T-celler (Luc(+) GD2-EATs) blev administreret med anti-Ly6C-antistof til mus, der bærer et neuroblastompatientafledt xenograft (PDX). (B) Bioluminescens i tumorens læsioner blev overvåget. Bioluminescensbillederne på dag 7 og kvantificering af bioluminescensen i tumorens læsioner. (C) In vivo antitumorrespons af GD2-EATs med anti-Ly6C antistof blev testet mod neuroblastom PDX'er. (D) In vivo antitumoreffekt af GD2-EATs med anti-Ly6C antistof blev testet mod osteosarkom PDX'er, og langsigtet overlevelse blev analyseret. Fejlbjælker angiver standardfejlen i middelværdien. In vivo antitumoreffekt blev sammenlignet ved hjælp af AUC og overlevelseskurveanalyser. Tumorinfiltrerende lymfocytter blev kvantificeret ved anvendelse af AUC for bioluminescens. Forskelle mellem prøver angivet i figuren blev testet for statistisk signifikans ved hjælp af en to-halet studerendes t-test for to datasæt og envejs ANOVA med Tukeys post hoc-test for tre eller flere datasæt. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tal er ændret fra Park et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Antitumoraktiviteter af anti-STEAP1 T-celleengagerende bispecifikt antistof. (A) Skematisk gengivelse af de seks strukturelle formater af STEAP1 BsAb. (B) Antistofafhængig T-cellemedieret cytotoksicitetsanalyse (ADTC) mod EFT cellelinjer (TC32 ad TC71) ved anvendelse af forskellige formater af STEAP1 BsAb. Effektor til mål (ET) celleforhold var 10: 1. (C) Bioluminescensbilleddannelse (BLI) af Luc(+) T-celler bevæbnet med seks forskellige formater af STEAP1 BsAb på (a) dag 6 og (b) dag 18 efterbehandling og kvantificering af bioluminescensintensitet i tumorens læsioner. Luciferase transducerede T-celler (Luc(+) T-celler) blev bevæbnet med forskellige formater af STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb/2 x 107 T-celler) og administreret med supplerende IL-2 (1.000 IE/dosis) til mus med EFT PDX'er (ES15a), og BLIfulgte. Forkortelser: EFT = Ewing sarkom familie af tumorer; PDX'er = patientafledte tumorxenotransplantater; STEAP = seks-transmembran epitelantigen af prostata. Fejlbjælker angiver standardfejl i middelværdien. Tumorinfiltrerende lymfocytter blev kvantificeret ved at beregne arealet under kurven for bioluminescensen. Forskelle mellem prøver angivet i figuren blev testet for statistisk signifikans ved hjælp af envejs ANOVA med Tukeys post hoc-test. p < 0,0001. Dette tal er ændret fra Lin et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens T-BsAb blinatumomab er blevet godkendt til CD19-positive hæmatologiske maligniteter, har den vellykkede implementering af T-BsAbs i solide tumorer vist sig meget vanskeligere. Catumaxomab, en T-BsAb rettet mod epitelcelleadhæsionsmolekyle (EPCAM), blev godkendt til behandling af ondartede ascites hos ovariecancerpatienter, men produktionen af lægemidlet blev efterfølgende stoppet af kommercielle årsager19. Ingen andre T-BsAbs er blevet godkendt til solide tumorer, hvilket understreger udfordringerne forbundet med denne type terapi. Toksicitet på grund af cytokinfrigivelsessyndrom (CRS) er et almindeligt problem, selvom dette kan styres med steroider og cytokinhæmmere. Ud over toksicitet er manglende effekt almindelig i forsøg med T-BsAbs for solide tumorer. Inducering af T-cellehandel og persistens i tumoren har vist sig vanskelig, sandsynligvis på grund af forskellige immunsuppressive faktorer i TME14. Men selv præklinisk er det ofte uklart, hvorfor en T-BsAb, der fungerer godt in vitro , ikke effektivt behandler tumorer in vivo.

Metoden til sporing af T-celler in vivo i realtid beskrevet i denne artikel er nyttig for forskere af flere grunde. Overvågning af T-celle homing giver mekanistisk indsigt i, hvorfor visse T-BsAbs lykkes eller mislykkes ved at give forskere mulighed for at bestemme, hvornår T-cellehandel er begyndt, og hvor længe T-cellerne har vedvaret i tumoren under behandlingen. Metoden kan gentages på flere tidspunkter, så forskere kan plotte kinetikken af T-celle homing i løbet af flere uger. (Repræsentative resultater i figur 1 viser, at T-celler vedvarer i tumoren i mindst 28 dage.) In vivo-billeddannelse af luciferase-transducerede T-celler eliminerer også behovet for at ofre dyr under behandling til histologisk vurdering af T-celleinfiltration, hvilket reducerer de samlede omkostninger og antallet af dyr, der er nødvendige pr. Forsøg. Fordi billeddannelsen kan gentages så ofte som nødvendigt, giver det også mulighed for en meget lettere og mere grundig evaluering af T-celle homing kinetik sammenlignet med histologisk analyse, som i det væsentlige er et øjebliksbillede af et enkelt tidspunkt, medmindre flere dyr ofres på forskellige tidspunkter.

Det mest kritiske trin i denne metode er den vellykkede transduktion af T-celler med luciferasekonstruktionen. Mislykket transduktion kan føre til T-celledød eller mangel på luciferasesignal in vivo. Hvis T-celler ikke udvider sig som forventet efter transduktion, kan det være muligt at reducere den virale titer, som de transduceres med, for at reducere potentiel toksicitet fra transduktionsprocessen. En anden tilgang ville være at vente endnu en dag mellem T-celleudvidelsestrin for at gøre det muligt for T-cellerne at blive mere sammenflydende, før de udvides til et større cellekulturbeholder. Før du injicerer T-cellerne i musene, er det en god ide at bekræfte transduktionssucces ved hjælp af flowcytometri (for at kontrollere ekspression af TD-tomatreporteren) eller en bioluminescerende pladelæser. Hvis de transducerede T-celler stadig ikke er synlige med bioluminescerende billeddannelse, kan det være muligt, at antallet af T-celler er for lavt til detektion ved hjælp af denne teknik. Rabinovich et al. beskriver en lignende metode ved hjælp af forbedret firefly luciferase til at detektere så få som 10 murine T-celler, som kan implementeres i situationer, der kræver dette følsomhedsniveau20.

Sammenfattende giver in vivo-sporing af luciferase-transducerede T-celler et værdifuldt værktøj for forskere, der studerer T-BsAbs i immunkompromitterede musemodeller af kræft. Ud over de anvendelser, der er diskuteret ovenfor, er denne metode til T-cellesporing blevet anvendt på kimære antigenreceptor (CAR) T-celler og kunne tilsyneladende også anvendes på syngeneiske musemodeller, der også anvender adoptivt overførte T-celler21. Vi håber, at denne strategi vil være nyttig for forskere, der udvikler translationelle T-BsAbs og vil føre til en øget succes med disse terapier hos patienter med solide tumorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NKC rapporterer, at de modtager kommercielle forskningsbevillinger fra Y-mAbs Therapeutics. NKC er opfinder og ejer af udstedte patenter licenseret af MSK til Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand og Abpro-labs. MSK og NKC har økonomiske interesser i Y-mAbs. NKC rapporterer, at de modtager aktieoptioner fra Eureka Therapeutics. HFG og MEC har ingen relevante oplysninger.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Vladimir Ponomarev for at dele luciferase-konstruktionerne, der anvendes i eksperimenterne beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater i denne artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Kræftforskning udgave 195 bispecifikke antistoffer T-celleengagere luciferase T-celler xenotransplantater
Sporing af bispecifik antistofinduceret T-cellehandel ved hjælp af luciferase-transducerede humane T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter