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Cancer Research

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64558
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,3
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Summary

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Abstract

A lo largo de su vida, las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) adquieren mutaciones somáticas. Algunas de estas mutaciones alteran las propiedades funcionales de HSPC como la proliferación y la diferenciación, promoviendo así el desarrollo de neoplasias hematológicas. Se requiere una manipulación genética eficiente y precisa de las HSPC para modelar, caracterizar y comprender mejor las consecuencias funcionales de las mutaciones somáticas recurrentes. Las mutaciones pueden tener un efecto perjudicial en un gen y provocar pérdida de función (LOF) o, en marcado contraste, pueden mejorar la función o incluso conducir a nuevas características de un gen en particular, denominadas ganancia de función (GOF). En contraste con las mutaciones LOF, las mutaciones GOF ocurren casi exclusivamente de manera heterocigótica. Los protocolos actuales de edición del genoma no permiten la orientación selectiva de alelos individuales, lo que dificulta la capacidad de modelar mutaciones GOF heterocigóticas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo diseñar mutaciones heterocigotas de puntos calientes GOF en HSPC humanas combinando la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR / Cas9 y la tecnología AAV6 recombinante para una transferencia eficiente de plantillas de donantes de ADN. Es importante destacar que esta estrategia hace uso de un sistema de reportero fluorescente dual para permitir el seguimiento y la purificación de HSPC editados con éxito de forma heterocigótica. Esta estrategia se puede emplear para investigar con precisión cómo las mutaciones GOF afectan la función de HSPC y su progresión hacia neoplasias hematológicas.

Introduction

Con el desarrollo de la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9, se ha agregado un instrumento nuevo y extremadamente poderoso al conjunto de herramientas de los científicos. Esta tecnología permite la ingeniería precisa del genoma y ha demostrado ser extremadamente útil no sólo para fines de investigación (revisada en Hsu et al.1), sino que más recientemente también se ha traducido con éxito en el ámbito clínico 2,3,4. Las estrategias de edición de CRISPR/Cas9 se basan en la actividad de una proteína Cas9 y un ARN guía simple (sgRNA)5,6,7. En la célula huésped, la proteína Cas9 se guía a un sitio específico en el ADN que es complementario a la secuencia sgRNA e introducirá una ruptura de doble cadena de ADN (DSB). Una vez que se genera un DSB, hay dos mecanismos de reparación principales y competitivos que pueden ocurrir: la unión final no homóloga (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es un mecanismo de reparación propenso a errores, predominantemente utilizado que conduce a inserciones y deleciones (indels), mientras que HDR, al usar la cromátida hermana como plantilla de reparación, es muy preciso pero limitado a la fase S o G2 del ciclo celular8. En ingeniería genómica, HDR se puede utilizar para la modificación específica del ADN al proporcionar una plantilla de donante que está flanqueada por brazos de homología idénticos a ambos extremos de ADN del DSB inducido por Cas9 (Figura 1). El tipo de plantilla de donante que se utiliza para HDR puede tener un gran impacto en la eficiencia de edición. Para la ingeniería genética en HSPC humanas, el virus adenoasociado serotipo 6 (AAV6) ha sido descrito recientemente como un excelente vehículo para la entrega de plantillas de ADN monocatenario 9,10.

La ingeniería del genoma CRISPR/Cas9 se puede emplear terapéuticamente para corregir mutaciones perjudiciales11, pero también se puede utilizar para introducir mutaciones patogénicas en el ADN para modelar el desarrollo del cáncer12. El cáncer de la sangre, como la leucemia, se desarrolla a través de la adquisición secuencial de mutaciones somáticas en HSPC sanas13,14. Los eventos genéticos tempranos conducen a una ventaja proliferativa clonal, resultando en hematopoyesis clonal de potencial indeterminado (CHIP)15,16. La adquisición adicional de mutaciones eventualmente conducirá a la transformación leucémica y al desarrollo de la enfermedad. Las mutaciones somáticas se pueden encontrar en genes que controlan la autorrenovación, supervivencia, proliferación y diferenciación17.

La introducción de mutaciones individuales a través de la ingeniería genómica en HSPC saludables permite modelar con precisión este proceso leucemogénico paso a paso. El número limitado de mutaciones recurrentes encontradas en neoplasias mieloides como la leucemia mieloide aguda (LMA)18,19 hace que esta enfermedad sea particularmente susceptible de ser recapitulada utilizando herramientas de ingeniería genómica.

Las mutaciones somáticas pueden surgir en un solo alelo (mutaciones monoalélicas/heterocigotas) o en ambos alelos (mutaciones bialélicas/homocigotas) y pueden tener efectos profundos en la función del gen, lo que podría causar una pérdida de función (LOF) o una ganancia de función (GOF). Las mutaciones LOF conducen a un LOF reducido (si un alelo está afectado) o completo (si ambos alelos están afectados) del gen, mientras que las mutaciones GOF conducen a una mayor activación o función nueva del gen. Las mutaciones GOF son típicamente heterocigotas20.

Es importante destacar que la cigosidad (hetero vs. homocigotos) tiene implicaciones importantes para el intento de modelar fielmente una mutación; por lo tanto, la manipulación dirigida de un solo alelo de un gen es necesaria para diseñar mutaciones GOF heterocigotas en hotspots. La NHEJ propensa a errores conduce a indeles de diferentes longitudes21 que pueden conducir a consecuencias biológicas variables e impredecibles. Sin embargo, dado que NHEJ es el programa de reparación predominante empleado por las células después de la introducción de un DSB, la mayoría de las plataformas CRISPR/Cas9 utilizadas actualmente para manipular HSPCs no permiten predecir con precisión el resultado genético22,23. En contraste, la introducción de una rotura de doble cadena mediada por CRISPR/Cas9 (DSB), combinada con el uso de plantillas de donantes de ADN basadas en vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para la ingeniería del genoma a través de HDR, permite la inserción de mutaciones específicas de alelos en HSPC humanas11,24. La integración simultánea de una secuencia mutante y una secuencia de tipo salvaje (WT) junto con distintos reporteros fluorescentes en los alelos individuales se puede realizar para seleccionar un genotipo heterocigoto (Figura 2). Esta estrategia se puede aprovechar como una herramienta poderosa para caracterizar con precisión los efectos de las mutaciones recurrentes, leucémicas y heterocigotas del punto caliente GOF sobre la función de HSPC, el inicio de la enfermedad y la progresión.

En este artículo, se proporciona un protocolo detallado para la ingeniería eficiente de mutaciones GOF heterocigotas mutadas recurrentemente en HSPC humanas primarias. Esta estrategia combina el uso de CRISPR/Cas9 y una transducción dual AAV6 para proporcionar plantillas de donantes de ADN mutante y WT para la generación prospectiva de la mutación GOF heterocigótica. Como ejemplo, se mostrará la ingeniería de las mutaciones recurrentes de tipo 1 (deleción de 52 pb) en el gen de la calreticulina (CALR) 25. La mutación heterocigótica GOF en el exón 9 de la CALR se encuentra recurrentemente en trastornos mieloproliferativos como la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (FMP)26. CALR es una proteína residente en retículo endoplásmico que tiene principalmente una función de control de calidad en el proceso de plegamiento de proteínas recién sintetizadas. Su estructura se puede dividir en tres dominios principales: un dominio amino (N)-terminal y un dominio P rico en prolina, que están involucrados en la función chaperona de la proteína, y un dominio C, que está involucrado en el almacenamiento y regulación del calcio27,28. Las mutaciones CALR causan un desplazamiento de marco +1, lo que lleva a la transcripción de un nuevo extremo C-terminal extendido y la pérdida de la señal de retención del retículo endoplásmico (ER) (KDEL). Se ha demostrado que la CALR mutante se une al receptor de trombopoyetina (TPO), lo que lleva a la señalización independiente de TPO con aumento de la proliferación29.

Figure 1
Figura 1: Reparación de NHEJ y HDR. Representación esquemática simplificada de los mecanismos de reparación NHEJ y HDR tras la introducción de una ruptura de doble cadena en el ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Descripción esquemática de la estrategia de edición HDR bialélica. Representación esquemática que muestra la integración de las plantillas de donantes en los alelos objetivo seguida de su traducción en ARNm funcionales. Los cuadros punteados de color naranja indican las regiones correspondientes al brazo de homología izquierdo (LHA) y al brazo de homología derecho (RHA). El tamaño ideal de las HA es de 400 pb cada una. El cuadro punteado verde representa la región correspondiente a la secuencia SA. El tamaño del SA es de 150 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Este protocolo requiere el uso de HSPC CD34+ derivadas de donantes sanos y requiere la aprobación ética de las juntas locales de revisión institucional (IRB) y el consentimiento informado firmado. Las HSPC CD34+ utilizadas en este protocolo se aislaron de la sangre del cordón umbilical (UCB) de partos a término (>34 semanas de gestación). Se obtuvo el consentimiento informado de las madres antes del parto, y se obtuvo la aprobación ética para la recolección de UCB (aprobación IRB: 31-322 ex 18/19) de la Universidad Médica de Graz. Una lista completa de los materiales utilizados en este protocolo se puede encontrar en la Tabla de materiales.

1. Diseño de sgRNA y evaluación de eficiencias de corte

  1. Busque la ubicación de la mutación deseada y la transcripción correcta en una herramienta de base de datos en línea (por ejemplo, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Seleccione un sgRNA adyacente a la mutación (orientación exónica) o en el intrón anterior (orientación intrónica) mediante una herramienta de diseño de sgRNA. En este protocolo, se utiliza la herramienta en línea de Benchling. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de posibles herramientas en línea para el diseño de sgRNA.
  3. Seleccione la opción + (crear) > Secuencia de ADN > Importar secuencias de ADN > Importar desde bases de datos. Ingrese el gen deseado, por ejemplo, CALR y seleccione humano como la especie > Buscar > Seleccione la transcripción correcta (por ejemplo, CALR-201 -ENST00000316448) > Importar. Seleccione la región de interés en la que desea introducir la pausa DS (por ejemplo, intrón 7).
  4. Seleccione la opción CRISPR en el lado derecho de la pantalla y seleccione Diseñar y analizar guías. Seleccione una sola guía, mantenga la longitud de la guía en 20 pb y la secuencia PAM para editar con SpCas9 (NGG).
  5. Elija una guía con una puntuación alta en el objetivo (alta probabilidad de editar en el lugar deseado) y una puntuación alta fuera del objetivo (baja probabilidad de editar en loci no deseados). Elija al menos tres guías para probar con el fin de encontrar el sgRNA de mejor rendimiento. Solicite el sgRNA como un sgRNA sintético modificado químicamente a un proveedor comercial.
    NOTA: Es aconsejable en esta etapa ordenar una pequeña cantidad de sgRNAs sintéticos para la detección inicial. Una vez que se haya identificado un sgRNA de buen rendimiento, proceda con un orden mayor del sgRNA seleccionado.
  6. Descongelar 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCs. Transfiera las células a 10 ml de RPMI1640 precalentado suplementado con antibióticos al 1% (por ejemplo, penicilina/estreptomicina).
    NOTA: Los HSPC CD34 + con una pureza >90% deben usarse para lograr los mejores y más reproducibles resultados.
  7. Centrifugadora a 350 x g a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Contar las células con un hemocitómetro y suspender las células en medio SFEM II suplementado con 0,2% de penicilina/estreptomicina (P/S), 100 ng/ml de trombopoyetina (TPO), factor de células madre (SCF) de 100 ng/ml, ligando 3 tirosina quinasa 3 similar a FMS/ml (FLT3L), 100 ng/ml de interleucina-6 (IL-6), 35 nM UM171 y 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) hasta una concentración de 2,5 x 105 células/ml. Incubar a 37 °C/5% de CO2 durante 48 h -72 h.
    NOTA: El medio completo se denominará a partir de ahora medio de retención HSPC.
  8. Recoja las células en un tubo de 15 ml y cuente las células. Compruebe la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripano.
    1. Antes de comenzar, encienda el sistema de transfección y seleccione la opción para las cubetas. Seleccione el programa y la solución de nucleofección apropiados para las HSPC (consulte la Tabla de materiales). Entre 2 x 10 5 y5 x 106 células pueden ser nucleofecadas en una cubeta de 100 μL. Reservar un pequeño número de células (por ejemplo, 1 x 10 5-2 x 105) para mantenerlas en cultivo durante 48 h para usarlas como control WT.
  9. Preparar el complejo RNP. En un tubo de 1,5 ml, añadir 15 μg de Cas9 y 8 μg de sgRNA (relación molar 1:2,5) e incubar a 25 °C durante 10 min en un bloque de calentamiento.
  10. Mientras el complejo RNP se está incubando, centrifugar las células a 350 x g a RT durante 5 min y desechar el sobrenadante usando una pipeta. Suspender las células en 100 μL de solución de nucleofección.
  11. Mezclar las células con el complejo RNP y transferir a la cubeta. Golpee suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire eventual que pueda haberse formado durante la transferencia.
  12. Inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células con el programa DZ-100.
  13. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 μL de medio de retención HSPC precalentado sin P/S.
  14. Transfiera las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo que contenga medio de retención de HSPC precalentado sin P/S. Dependiendo del número de células, utilice una placa de cultivo adecuada (placa de 24, 12 o 6 pocillos) para alcanzar una densidad entre 0,25 x 10 6 y 1 x 106 células/ml.
  15. Transfiera la placa a la incubadora a 37 °C/5% deCO2. Incubar las células nucleofecadas durante 6-8 h.
  16. Después de 6-8 h, retire el medio viejo y reemplácelo con un medio de retención de HSPC fresco precalentado complementado con P/S. Suspender las células a una concentración entre 2,5 x 10 5 y 5 x 105 y transferirlas a una placa de cultivo celular (placa de 24, 12 o 6 pocillos). Incubar las células durante 48 h a 37°C/5% deCO2.
  17. Cosechar 2 x 10 5 células y centrifugar a 350 x g a RT durante5 min. Antes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C.
  18. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 1 ml de 1x DPBS en un tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 350 x g a RT durante 5 min.
  19. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 50 μL de solución de extracción de ADN. Vórtice durante 15 s.
  20. Incubar durante 6 min a 65 °C. Vórtice durante 15 s e incubar durante 2 min a 98 °C.
  21. Amplificar la región del DSB mediante PCR utilizando cebadores que generan un amplicón de unos 400-600 pb con el DSB en el centro. Utilice 0,5-1 μL de ADN extraído para la reacción de PCR.
    NOTA: Debido a la composición de la solución de extracción de ADN, las concentraciones de ADN no se pueden cuantificar con precisión mediante espectrofotometría.
  22. Ejecute el producto de PCR con una escalera de ADN en un gel de agarosa al 1,5 % a 100 V durante 45-60 min. Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul o UV.
  23. Extraiga la banda de ADN del tamaño correcto del gel utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
  24. Secuenciar las muestras mediante secuenciación de Sanger utilizando el cebador directo o inverso de la PCR. Para productos de PCR de 400-600 pb de longitud, se requieren 75 ng de ADN para la secuenciación con una concentración de 5 ng/ml en un volumen total de 15 μL.
  25. Analizar la eficiencia de edición de los sgRNAs cargando los archivos de secuenciación en un programa diseñado para calcular la eficiencia de edición mediante la identificación de la inserción y deleciones producidas por el sgRNA. Seleccione el sgRNA de mejor rendimiento con el que desea continuar.
    NOTA: Las herramientas en línea dedicadas se enumeran en la Tabla de materiales. Este análisis requiere los archivos .ab1 de las HSPC transfectadas y WT, la secuencia sgRNA y la secuencia PAM.

2. Construcción vectorial de reparación dirigida por homología (HDR)

  1. Diseño de plantilla HDR
    NOTA: Se deben diseñar dos plantillas HDR: una plantilla para la secuencia WT y una plantilla para la secuencia mutada.
    1. Importe la secuencia genómica y la secuencia codificante (CDS) del gen deseado en un software apropiado para la clonación molecular (se pueden encontrar herramientas dedicadas enumeradas en la Tabla de materiales). A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología izquierda (HA) seleccionando idealmente 400 pb en el extremo 5' del DSB. Pegue esta secuencia en un archivo nuevo.
    2. Si un intrón está dirigido con el sgRNA, se debe incluir una secuencia aceptora de empalme (SA). Seleccione los últimos 150 pb del intrón de destino y péguelo después del HA izquierdo. Si el exón está dirigido directamente, esta secuencia no es necesaria (Figura 3).
    3. En el archivo CDS, seleccione el ADNc que le interese. En caso de que se dirija a una secuencia exónica, asegúrese de que el ADNc comience inmediatamente aguas abajo del sitio DSB e incluya todos los siguientes exones del gen de interés, así como el codón de parada. En caso de que se dirija un intrón, asegúrese de que el ADNc comience con el primer codón del siguiente exón. Codón-optimizar el ADNc e insertarlo después de la secuencia SA. Utilice herramientas en línea dedicadas para este propósito (Tabla de materiales).
    4. Inserte una señal de poliadenilación 3' (PolyA) después del ADNc de interés (por ejemplo, SV40 o bGH) (Tabla 1). Después de la PolyA, inserte una secuencia promotora (por ejemplo, virus formador de foco de bazo [SFFV] o poliubiquitina C [UBC], Tabla 1) para la proteína fluorescente.
    5. Inserte la secuencia para la proteína fluorescente (es decir, GFP, BFP o mCherry). Inserte una segunda señal PolyA diferente pero diferente.
      NOTA: La inserción de una secuencia PolyA diferente evitará problemas como la recombinación bacteriana del plásmido o problemas con la alineación de secuencias debido a dos secuencias idénticas en la plantilla.
    6. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el HA correcto seleccionando idealmente 400 pb en el extremo 3' del DSB. Inserte esta secuencia después del segundo PolyA.
    7. Cree una copia de toda la plantilla y modifique el ADNc de interés para que contenga la secuencia de la mutación deseada.
    8. Intercambie la proteína fluorescente con una proteína fluorescente diferente. Por ejemplo, si se usó GFP para la plantilla WT, cámbiela con BFP o mCherry por la plantilla mutante. Construya y clone las plantillas HDR en el plásmido pAAV-MCS (u otra columna vertebral adecuada).
      NOTA: Los fragmentos requeridos para el ensamblaje pueden ser producidos por PCR u ordenados comercialmente y necesitan contener secuencias superpuestas con sus fragmentos vecinos. Si la mutación de interés es una mutación puntual, una inserción pequeña o una pequeña deleción, el ADNc mutado se puede producir mediante PCR realizando una mutagénesis dirigida al sitio en la plantilla HDR que contiene el ADNc WT.
    9. Transforme la competente Escherichia coli con el producto ensamblado utilizando el método de choque térmico. Antes de comenzar, coloque las bacterias para descongelar en hielo durante 10 minutos.
    10. Añadir 2 μL de los productos ensamblados a 50 μL de bacterias. Mezcle el contenido moviendo suavemente.
    11. Coloque las muestras en hielo durante 30 minutos. Transfiera las muestras a un termobloque ajustado a 42 °C durante 30 s.
    12. Transfiera las muestras en hielo durante 5 minutos. Añadir 450 μL de medio SOC a temperatura ambiente e incubar las muestras a 37 °C durante 1 h.
    13. Extienda las muestras en placas de agar LB que contengan ampicilina. Para cada muestra, extienda 100 μL de tres diluciones diferentes de la solución bacteriana (sin diluir, 1:5 y 1:10) para obtener placas de agar LB con colonias individuales que se puedan recoger. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
    14. Al día siguiente, elija tres colonias por muestra. Transfiera las colonias a tubos de 15 ml con tapas que contengan 4 ml de medio LB suplementado con ampicilina e incubar durante la noche en un agitador a 37 °C.
    15. Alícuota 500 μL de la solución bacteriana de cada colonia y guárdela en la nevera para su uso posterior. Realice una mini preparación para extraer ADN plásmido según las instrucciones del fabricante.
    16. Enviar las muestras para la secuenciación de Sanger para confirmar el correcto ensamblaje de los plásmidos. Utilice suficientes cebadores distribuidos por todo el plásmido para garantizar la confirmación ininterrumpida de la secuencia, idealmente cubriendo cada región dos veces con lecturas hacia adelante y hacia atrás.
    17. Añadir 200 μL de la solución bacteriana que contiene el plásmido correctamente ensamblado a 200 ml de medio LB suplementado con ampicilina e incubar en un agitador durante la noche a 37 °C.
    18. Realice una preparación midi o maxi-para extraer el ADN plásmido según las instrucciones del fabricante. Conservar el ADN plásmido a -20 °C.
  2. Preparación AAV6 recombinante
    NOTA: Será necesario realizar dos preparaciones AAV6 separadas: una para el rAAV6 con la plantilla WT HDR y otra para el rAAV6 con la plantilla HDR mutada. En esta sección se describen los pasos necesarios para la preparación de un solo virus.
    1. Descongele las células HEK293T, transfiera las células a 10 ml de DMEM precalentado suplementado con 10% FBS, 1% P / S y 25 mM HEPES, y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min.
    2. Suspender las células a una concentración de 1 x 105 células/ml y transferirlas a un matraz adecuado (por ejemplo, un matraz de 175 cm2 ). Transferir el matraz a una incubadora a 37 °C/5% deCO2.
      NOTA: Las células HEK293T deben descongelarse por adelantado para permitir que las células se recuperen completamente y obtengan un número suficiente de células (11 x 107 células son necesarias para la producción de un virus). Se recomienda usar las celdas después de un mínimo de tres pasajes y mantener las celdas por debajo de 20 pasajes. Las células HEK293T deben dividirse tres veces a la semana. Mientras se mantienen las células, estas no deben exceder el 70% -80% de confluencia. El DMEM utilizado en la preparación AAV también debe complementarse con L-glutamina y piruvato de sodio.
    3. Recoger las células en un tubo de 50 ml y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min.
    4. Suspender las células en 20 mL de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S, y 25 mM HEPES y contar con un hemocitómetro. Use azul de tripano para la exclusión de células muertas.
    5. Semilla de 3 x 106 células en 20 ml de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S y 25 mM HEPES en un matraz de 175 cm2 . Para la producción de un virus, preparar al menos cuatro matraces de 175 cm2 . Incubar las células a 37 °C/5% deCO2 durante 3 días.
      NOTA: Este paso se realiza mejor un viernes, ya que permite que las células se expandan durante el fin de semana.
    6. Cosechar y contar las células HEK293T.
    7. Para la preparación de uno de los virus, prepare diez platos de 150 mm cada uno con 11 x 106 HEK293T en 20 ml de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P / S y 25 mM HEPES.
    8. Colocar los platos en la incubadora a 37 °C/5%CO2 durante 24 h. Deseche cuidadosamente el medio viejo y reemplácelo con 20 ml de DMEM libre de antibióticos suplementado con 10% de FBS, 25 mM de HEPES y 1 mM de butirato de sodio. Antes de continuar, compruebe que la confluencia de las células no es superior al 80%.
    9. Prepare dos tubos de 15 ml que contendrán las mezclas de transfección. Al tubo 1, agregue 5 ml de medio sérico reducido, 60 μg de plásmido HDR mutado rAAV6 y 220 μg de pDGM6 (plásmido auxiliar). Al tubo 2, agregue 5 ml de medio sérico reducido y 1120 μL de solución de polietilenimina de 1 mg/ml (PEI, reactivo de transfección).
    10. Agregue el contenido del tubo 2 al tubo 1 y el vórtice durante 30 s. Incubar durante 15 minutos en RT para asegurar la encapsulación adecuada del ADN en las micelas PEI.
      NOTA: No guarde la solución por más de 20 minutos.
    11. Agregue cuidadosamente 1.1 ml de la solución a gota a gota a cada plato y distribúyala girando suavemente. Colocar los platos en la incubadora a 37 °C/5%CO2 durante 48 h.
    12. Después de 48 h, agregue 250 μL de EDTA 0.5 M a cada plato y coloque los platos en la incubadora durante 10 min. Coseche las células lavándolas del plato y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 500 ml o a varios tubos de 50 ml.
    13. Centrifugar a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Para garantizar la eliminación completa del sobrenadante, centrifugar de nuevo a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C.
    14. Deseche cualquier sobrenadante restante. Cualquier sobrenadante residual podría perjudicar la purificación del virus.
    15. Afloje el pellet mediante vórtice y extraiga el virus utilizando un kit de purificación AAV (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Alternativamente, realizar la extracción por ultracentrifugación por gradiente de iodixanol30,31.
    16. Alícuota el virus purificado y almacenar a −80 °C. Valorar funcionalmente el VAO o cuantificar el título de VAA mediante PCR digital de gotitas (ddPCR)32 para determinar las condiciones óptimas de transducción.
    17. Repita este proceso para la preparación del plásmido rAAV6 WT HDR.
  3. Titulación de AAV por ddPCR
    1. Antes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C.
    2. Extraiga el ADN viral agregando 15 μL de solución de extracción de ADN a 5 μL del virus. Vórtice durante 15 s.
    3. Incubar durante 6 min a 65 °C. Vórtice durante 15 s. Incubar durante 2 min a 98 °C.
    4. Utilice el ADN extraído (que es una dilución 1:4 del ADN viral) para preparar diluciones seriadas (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) conH2Olibre de nucleasa (nf) para la ddPCR.
      NOTA: Las diluciones pueden almacenarse a -20 °C si la ddPCR no se realiza inmediatamente.
    5. Seleccione tres de las diluciones para la ddPCR. La elección de la dilución a utilizar depende de la concentración del virus. Preferiblemente, use tres diluciones diferentes (por ejemplo, 1:40,000, 1:160,000 y 1:640,000) para encontrar la mejor dilución que esté dentro del límite de detección de la máquina.
    6. Mantenga los reactivos en hielo mientras trabaja. Prepare una mezcla maestra (todas las muestras se medirán por duplicado). Para cada reacción, prepare lo siguiente: 12,5 μL de ddPCR Supermix para sondas, sin dUTP, 1,25 μL de PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (consulte la Tabla de materiales) y 6,25 μL nf-H2O.
    7. Mezclar 5 μL de ADN con 20 μL de la mezcla maestra. Realice esto para las diluciones 1:40.000, 1:160.000 y 1:640.000.
    8. Coloque un cartucho en el portacartuchos. Agregue 70 μL de aceite de generación de gotas a las sondas en la fila denominadas Aceite. Tenga cuidado de no generar burbujas.
    9. Añadir 20 μL del volumen de muestra en la fila denominada Muestra. Tenga cuidado de no generar burbujas.
    10. Selle el cartucho con la junta y colóquelo en el generador de gotas. Genere las gotas presionando el botón de inicio de la máquina, retire la junta y transfiera cuidadosamente, con una pipeta multicanal, 40 μL de las gotas generadas a una placa de 96 pocillos. Trabaje lentamente para evitar la destrucción de las gotitas y las burbujas de aire.
    11. Selle la placa de 96 pocillos con una lámina perforada (la franja roja hacia arriba) utilizando el sellador de placas de PCR. Coloque la placa en un termociclador.
    12. Ajuste el volumen a 40 μL, la temperatura de la tapa a 105 °C y las velocidades de rampa a 2 °C/s. Ejecute el programa de PCR como se describe en la Tabla 2.
    13. Encienda el lector de gotas 30 minutos antes de usarlo. Abra el software en el escritorio.
    14. Introduzca el diseño de la placa y seleccione ABS en la pestaña experimento y ddPCR Supermix en la pestaña Supermix. Luego, primero presione PRIME, luego haga clic en FLUSH SYSTEM en el software para iniciar el sistema.
    15. Introduzca la placa en el lector. Inicie la ejecución y, cuando haya terminado, exporte los datos como un archivo CSV para su posterior análisis como una hoja de cálculo.
      NOTA: Los números generados por el software son copias del genoma (GC) por μL. Estos deben multiplicarse por los factores de dilución: GC / μL x 5 (dilución del ADN en la mezcla maestra) x dilución inicial (es decir, 40,000 o 160,000).

Figure 3
Figura 3: Descripción esquemática de la orientación intrónica y exónica durante el knock-in CRISPR/Cas9 HDR. Comparación esquemática entre estrategias de orientación intrónica y exónica para CRISPR / Cas9 HDR knock-in. (A) Durante la orientación intrónica, se introduce una ruptura de doble cadena en un intrón del ADN. La plantilla HDR se compone de LHA, secuencia de ADNc y RHA. La focalización intrónica requiere, además, la presencia de un aceptor de rebanadas que contenga el sitio de empalme 3', el punto de ramificación y el tracto de polipirimidina. Esto permite un empalme correcto. El cuadro punteado verde representa la región correspondiente a la secuencia SA. El tamaño del SA es de 150 pb. (B) La orientación exónica se basa en la producción de una ruptura de doble cadena directamente en el exón. La plantilla HDR se compone de LHA, secuencia de ADNc y RHA. Los recuadros punteados de color naranja indican las regiones correspondientes a la LHA y la RHA. El tamaño ideal de las HA es de 400 pb cada una. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Promotores
Nombre Largura Descripción
SFFV 492 pb Promotor del virus formador de foco de bazo. Fuerte promotor de mamíferos. Expresado constitutivamente
UBC 400 pb Promotor derivado del gen de la ubiquitina C humana. Expresado constitutivamente.
CMV 508 pb Promotor derivado del citomegalovirus. Puede contener una región potenciadora. Expresado constitutivamente. Fuerte promotor de mamíferos. Puede ser silenciado.
EF-1a 1182 pb Promotor alfa del factor de elongación de la traducción eucariota humana 1. Expresado constitutivamente. Fuerte promotor de mamíferos.
EFS 200-300 pb EF-1 alfa forma corta sin intrón
CAG 584 pb Promotor híbrido de mamíferos que contiene el potenciador temprano del CMV (C), el promotor de la beta actina del pollo (A) y el aceptor de empalme para el gen de la beta-globina del conejo (G). Expresado constitutivamente.
Señales de poliadenilación (PolyA)
Abreviatura Largura Descripción
SV40 PolyA 82-122 pb Señal de poliadenilación del virus 40 de los simios
bGH PolyA 224 pb Señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino
rbGlob PolyA 56 pb Señal de poliadenilación de globina beta de conejo

Tabla 1: Promotores y señales de poliadenilación.

Paso Temperatura Hora Ciclos
Activación enzimática 95°C 10 minutos 1x
Desnaturalización 94°C 30 segundos 42x
Recocido 60°C 1 minuto
Extensión 72°C 30 segundos
Desactivación enzimática 98°C 10 minutos 1x
Sostener 4°C ∞

Tabla 2: Programa de PCR de gotitas digitales.

3. Edición de HSPC

  1. Transfección y transducción de HSPCs
    1. Descongele las HSPC CD34+ y transfiera las células a 10 ml de RPMI precalentado suplementado con 1% P/S. Centrifugadora a 350 x g a RT durante 10 min.
    2. Suspender las células en medio de retención de HSPC hasta una concentración de 2,5 x 10 5 células/ml e incubar a 37 °C/5 % de CO2 durante 48 h -72 h.
    3. Cosechar las células en un tubo de 15 ml. Contar las celdas y comprobar la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripano. Entre 2 x 10 5 y5 x 106 células pueden ser nucleofecadas en una sola cubeta. Prepare el número apropiado de cubetas dependiendo de su número de celda calculado.
    4. Preparar el complejo RNP. En un tubo de 1,5 ml, añadir 15 μg de Cas9 y 8 μg de sgRNA (relación molar 1:2,5) e incubar a 25 °C durante 10 min en un bloque de calentamiento.
    5. Mientras el complejo RNP está incubando, centrifugar las células a 350 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    6. Suspender las células en 100 μL de solución de nucleofección. Mezclar las células con el complejo RNP y transferir a la cubeta.
    7. Golpee suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire residual que pueda haberse formado durante la transferencia.
    8. Inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células como se describió anteriormente en la sección de diseño de sgRNA.
    9. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 μL de medio de retención de HSPC precalentado sin P/S y transferir las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo tisular que contenga 500 μL de medio de retención de HSPC precalentado sin P/S. Dependiendo del número de células, utilice una placa de cultivo adecuada (placa de 24, 12 o 6 pocillos) para alcanzar una densidad entre 0,25 x 10 6 y 1 x 106 células/ml. Transfiera la placa a la incubadora a 37 °C/5% deCO2.
    10. Descongele los viales que contienen los rAAV congelados en hielo. Transducir las células pipeteando la cantidad óptima de cada rAAV6 a la suspensión celular. Realice la transducción dentro de los 20-30 minutos posteriores a la electroporación para obtener altas eficiencias de transducción.
      NOTA: La concentración óptima de cada virus (un virus para la plantilla WT HDR y otro virus separado para la plantilla HDR mutada) debe determinarse experimentalmente. Por lo general, 5,000-10,000 GC / célula (por ejemplo, 5 x 109 GC para 1 x 106 células) dan como resultado una alta transducción.
    11. Mezclar suavemente la suspensión celular con la pipeta. Incubar las células transducidas durante 6-8 h a 37 °C/5% deCO2. Después de 6-8 h, recoger las células en un tubo y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min.
    12. Deseche el medio viejo y reemplácelo con un medio de retención de HSPC fresco precalentado complementado con P/S.
    13. Suspender las células a una concentración entre 2,5 x 10 5-5 x 105 células/ml y transferirlas a una placa de cultivo celular tratada con tejido (placa de 24, 12 o 6 pocillos). Incubar las células durante 48 h a 37 °C/5% deCO2 antes de proceder a la clasificación.
  2. Clasificación de flujo de las HSPC diseñadas portadoras de la mutación GOF heterocigótica
    1. Cosechar las células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min. Retire el sobrenadante, suspenda las células en 1 ml de DPBS que contenga 0,1% de BSA y centrifugar nuevamente a 350 x g a RT durante 5 min.
    2. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en un volumen apropiado de DPBS + 0,1% BSA dependiendo del número de células.
      NOTA: Se recomienda suspender las celdas a un volumen mínimo de 200 μL y no exceder 1 x 107 células/ml para reducir el riesgo de obstrucción del clasificador.
    3. Transfiera las células a un tubo FACS estéril equipado con una tapa. Agregue 7-AAD u otro colorante de viabilidad (dependiendo de su compatibilidad con las proteínas fluorescentes) a la suspensión celular para la exclusión de células vivas / muertas.
    4. Clasificar las células vivas que son doblemente positivas para las proteínas reporteras fluorescentes en un tubo de recolección que contenga 200 μL de medio de retención HSPC.
      NOTA: Se deben agregar controles apropiados que consistan en celdas que solo se transducen con AAV para garantizar la activación adecuada durante el procedimiento de clasificación.
    5. Centrifugar las células clasificadas a 350 x g a RT durante 5 min y suspender las células en medio de retención HSPC a una concentración de 2,5 x 105 células/ml para una mayor expansión en cultivo o utilizar las células directamente para ensayos funcionales.

4. Confirmación de la edición exitosa de genes

  1. Extracción de ADN genómico
    1. Antes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C. Cosechar 2 x 10 5 células editadas y clasificadas por el genoma y centrifugar a 350 x g durante5 min.
    2. Extraiga el ADNg como se describió anteriormente. Utilice la solución de ADN directamente para PCR o guárdela a -20 °C.
  2. In-Out PCR
    1. Diseñar dos cebadores para amplificar el sitio de inserción 5' (Figura 4A): el cebador hacia adelante 1 se dirige al locus genómico fuera del brazo de homología izquierdo; El cebador inverso 2 se dirige a la secuencia integrada.
    2. Para la PCR de entrada-salida, prepare la siguiente mezcla de PCR por reacción:
      10 μL de PCR Master Mix (2x; ver Tabla de materiales)
      1 μL de cebador hacia adelante 1 (material de 10 μM)
      1 μL de imprimación inversa 2 (material de 10 μM)
      0.5-1.0 μL de ADN extraído
      H2Olibre de nucleasa hasta un volumen final de 20 μL
      NOTA: Para más de una reacción, es aconsejable preparar una mezcla maestra que contenga una reacción adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Es importante incluir un control no plantilla y un ADN de plantilla de una muestra tratada simulada.
    3. Ejecute las reacciones de PCR con el programa de ciclo térmico adecuado (consulte las instrucciones del fabricante).
      NOTA: Es aconsejable probar primero el par de cebadores para la temperatura óptima de recocido. Esto se puede hacer calculando el Tm y luego ejecutando la PCR con un termociclador que puede realizar un gradiente de temperatura.
    4. Ejecute los productos de PCR con una escalera de ADN en un gel de agarosa al 1,5% a 100 V durante 45-60 min (Figura 4B). Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul o UV. Extirpar las bandas del gel.
    5. Extraiga el ADN de las bandas utilizando un kit de extracción de gel de ADN. Enviar las muestras de PCR extraídas con los cebadores apropiados para la secuenciación de Sanger para confirmar la integración correcta y perfecta del ADNc deseado en el locus del gen endógeno.

Figure 4
Figura 4: Validación de la integración genómica por PCR in-out. (A) Representación esquemática de la estrategia de PCR in-out. En la estrategia descrita, se diseñaron dos imprimaciones. El cebador hacia adelante 1 se dirige al locus genómico fuera de la LHA, y el cebador inverso 2 se dirige a la secuencia optimizada para codón. (B) Representación esquemática de una electroforesis en gel de agarosa. Solo las células editadas con éxito (RNP + AAV) generarán un producto de PCR durante la PCR de entrada-salida, mientras que las muestras no editadas (solo AAV) no generarán un producto de PCR. Abreviatura: NTC = control sin plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Al aplicar el protocolo descrito anteriormente, las mutaciones heterocigotas tipo 1 de CALR se introdujeron de forma reproducible en HSPC derivadas de la sangre del cordón umbilical. Esta mutación consiste en una deleción de 52 pb en el exón 9 (el último exón de CALR), que resulta en un desplazamiento de fotograma +1, lo que lleva a la traducción de un nuevo dominio C-terminal cargado positivamente26,33. Para introducir la mutación CALR en el locus del gen endógeno, se adoptó una estrategia de orientación intrónica aguas arriba del exón 9, ya que esto evitaría cualquier cambio no deseado en la secuencia de codificación en los casos en que el DSB inducido por Cas9 no se reparó a través del mecanismo HDR. En este caso específico, se diseñó un sgRNA para el intrón 7 debido a la disponibilidad de secuencias altas en el objetivo y bajas fuera del objetivo en combinación con brazos de homología favorables (falta de repeticiones de secuencia; Figura 5A).

Luego se diseñaron dos plantillas de donantes y se empaquetaron en vectores AAV6. Para permitir el empalme correcto de los exones endógenos al ADNc integrado, las plantillas de donantes contienen (i) una secuencia SA que incluye el sitio de empalme 3', el punto de ramificación y el tracto de polipirimidina, (ii) la secuencia de ADNc optimizada para codones de los exones 8-9, ya sea que contenga el WT (CALR WT) o la secuencia mutada (CALRDEL) ) que incluye un codón de parada, iii) una señal poliA del virus simio 40 (SV40), iv) una secuencia que codifica una proteína fluorescente bajo el control del promotor interno separado, el promotor del virus formador del foco del bazo (SFFV), seguida de v) una señal poliA de la hormona del crecimiento bovino (bGH). La plantilla de donante que contiene el ADNc de CALR WT se diseñó para contener un casete GFP, mientras que la plantilla de donante que contiene la secuencia de ADNc de CALRDEL se diseñó para contener un casete de BFP. Todo el constructo estaba flanqueado por un HA izquierdo y derecho (Figura 5A).

Dos días después de la transfección con el complejo RNP y la transducción con los virus rAAV6, las células fueron analizadas por citometría de flujo. Se pudieron detectar cuatro poblaciones principales: (i) células que no expresan ni GFP ni BFP, que representan células sin edición genómica basada en HDR, (ii) células positivas solo para GFP, que representan aquellas que habían integrado solo la construcción WT, (iii) células positivas solo para BFP, que representan aquellas que habían integrado solo la construcción mutada, y (iv) células GFP y BFP doblemente positivas, representando las células que habían integrado tanto el WT como las secuencias mutadas (Figura 5B). Para obtener poblaciones puras de HSPC portadoras de la mutación heterocigótica tipo 1 CALR , las células doble positivas se clasificaron por citometría de flujo. Las HSPC en las que se eliminaron dos secuencias WT se utilizaron como células de control (GFP+ mCherry+; Figura 5B). Una alternativa válida para usar como células de control serían las HSPC con una integración bialélica de las proteínas fluorescentes en un locus de puerto seguro (es decir, AAVS1; no se muestra). El recuento de células por exclusión de azul de tripano realizado en las HSPC clasificadas indicó que más del 90% de las células eran viables.

La integración perfecta de los constructos en el objetivo se confirmó mediante la aplicación de la estrategia de PCR in-out (Figura 6A). En este caso específico, realizamos dos PCR de entrada y salida separadas, una para la secuencia CALRWT knocked-in (carril 1 de la electroforesis en gel en la Figura 6A) y otra para la secuencia CALR DEL golpeada (carril 2 de la electroforesis en gel de la Figura 6A). La secuenciación de Sanger realizada sobre el ADN extraído de las bandas de gel confirmó la correcta inserción de las secuencias WT y mutadas en las CALRDEL/WT HCP (Figura 6B).

Figure 5
Figura 5: Generación de HSPCs portadoras de la mutación heterocigótica CALR . (A) Esquema representativo que representa la estrategia de edición para la inserción de la mutación CALR heterocigótica. El complejo RNP se dirige al intrón entre el exón 7 y el exón 8 del gen CALR . Dos AAV, uno que contiene los exones mutados 8-9 y un BFP y el otro que contiene los exones WT 8-9 y un GFP, servirán como plantillas de reparación del donante y promoverán la integración de la secuencia mutada en un alelo y la integración de la secuencia WT en el alelo restante. (B) Gráficos de citometría de flujo representativos que representan la expresión de GFP y BFP o GFP y mCherry 48 h después de la transfección y transducción de HSPC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Validación de la mutación CALR heterocigótica exitosa en HSPCs . (A) Electroforesis en gel de los productos de la PCR in-out realizada en ADN genómico extraído de controles AAV, CALR WT/WT y CALRDEL/WT. Se utilizó una escalera de ADN de 100 pb. Abreviatura: NTC = control sin plantilla. (B) Resultados de secuenciación de Sanger obtenidos de las PCR in-out realizadas en CALRDEL/WT confirmando la integración exitosa del WT y secuencias mutadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La manipulación genética eficiente y precisa de las HSPC primarias humanas representa una gran oportunidad para explorar y comprender los procesos que influyen en la hematopoyesis normal y, lo que es más importante, en la transformación leucémica de las células hematopoyéticas.

En este protocolo, se describió una estrategia eficiente para diseñar HSPC humanas para expresar mutaciones GOF heterocigotas recurrentes. Este procedimiento aprovechó la tecnología CRISPR / Cas9 y los vectores rAAV6 como donantes para plantillas de ADN para insertar con precisión secuencias de ADN WT y mutantes en sus loci genéticos endógenos. El acoplamiento de los ADNc diseñados (WT y mutante) con proteínas reporteras fluorescentes separadas permite el enriquecimiento y el seguimiento de células con un estado heterocigoto definitivo.

Esta estrategia presenta varias ventajas en comparación con los métodos basados en lentivirus (VI) utilizados con frecuencia. Una ventaja principal es que el sistema basado en CRISPR / Cas9 permite una edición precisa en los loci endógenos, lo que resulta en la preservación de los promotores endógenos y los elementos reguladores. Esto conduce a la homogeneidad en la expresión del gen editado en las células, un objetivo difícilmente alcanzable cuando se utiliza un método basado en VI. La transferencia génica con vectores del VI conduce a la integración semialeatoria del gen con preferencia por sitios transcripcionalmente activos34. Esto puede traducirse en la sobreexpresión del gen transferido y la heterogeneidad entre las células editadas, lo que eventualmente resulta en dificultades para investigar y analizar el papel de las mutaciones y las interacciones génicas. Una segunda ventaja es que el sistema descrito, al ser un sistema de edición específico del sitio, elimina los riesgos de mutagénesis insercional35.

La estrategia del reportero fluorescente dual permite el enriquecimiento preciso y el seguimiento de las células que se editaron con éxito en ambos alelos, con un alelo que integra el ADNc WT y el otro alelo que integra las secuencias de ADNc mutadas. Las celdas que solo expresan un solo reportero representan solo la integración monoalélica o la integración bialélica de plantillas HDR con el mismo reportero fluorescente. Ambos escenarios solo pueden distinguirse con precisión si se producen clones derivados de células individuales y se analizan individualmente. Sin embargo, las HSPC solo tienen una capacidad proliferativa limitada in vitro, y cuando se mantienen en cultivo durante largos períodos de tiempo, las HSPC comienzan a diferenciarse en progenie más madura y pierden su capacidad de autorrenovación e injerto. Esto hace que la selección y expansión de clones unicelulares que albergan la mutación heterocigótica deseada sea inviable. La aplicación de la estrategia de proteína fluorescente dual y el enriquecimiento por citometría de flujo para células portadoras de la mutación heterocigota permite evitar los problemas inducidos por el cultivo in vitro extendido.

En este ejemplo específico, se demostró con éxito que las HSPC podrían diseñarse y clasificarse de manera eficiente para obtener poblaciones puras de HSPC portadoras de la mutación heterocigótica CALRDEL/WT.

Sin embargo, este sistema no se limita a la ingeniería de mutaciones heterocigotas de cambio de marco, sino que también se puede adoptar fácilmente para crear otros tipos de mutaciones, incluidas las mutaciones sin sentido y sin sentido. Mediante la aplicación de diferentes combinaciones de AAVs que contienen WT o secuencias mutadas con diferentes proteínas reporteras fluorescentes, este sistema también se puede utilizar para la introducción de mutaciones homocigotas (transducción simultánea con dos rAAVs ambos portadores de ADNc mutante pero diferentes reporteros fluorescentes) o incluso la corrección de mutaciones (transducción simultánea con dos AAVs ambos portadores de ADNc WT pero diferentes reporteros fluorescentes). Además, es importante mencionar que esta estrategia no se limita a la introducción de mutaciones oncogénicas de GOF. De hecho, el protocolo descrito se puede utilizar para múltiples estrategias alternativas, incluyendo la eliminación de genes, el reemplazo de genes 36,37, el knock-in dirigido de transgenes (es decir, receptores de antígenos quiméricos)38, e incluso para la corrección de mutaciones causantes de enfermedades11,39.

La estrategia de combinar CRISPR/Cas9 y AAV6 con múltiples reporteros fluorescentes también ha demostrado ser aplicable en muchos otros tipos de células, incluidas las células T, las células dendríticas plasmocitoides, las células madre pluripotentes inducidas, las células madre neuronales y las células madre de las vías respiratorias 24,38,40,41,42,43,44 . Esta estrategia se puede implementar para la producción de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) superiores. Por ejemplo, recientemente se publicó que la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 del gen TGFBR2 en las células T con CAR aumenta en gran medida su función en el microambiente tumoral supresor rico en TGF-β45. Tal enfoque podría proporcionar un protocolo de un solo paso tanto para diseñar las células T para expresar el CAR como para eliminar el gen TGFBR2 por sitio insertando específicamente el CAR en ambos alelos del gen TGFBR2. Además, este enfoque también podría ser útil para generar células T CAR universales mediante la integración de la CAR en el gen de la constante alfa del receptor de células T (TRAC)46,47.

Para aumentar la reproducibilidad y garantizar una edición eficiente de las células, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes. Los principales puntos críticos para garantizar la edición exitosa de las células residen en (i) la selección del sgRNA, (ii) el diseño de la plantilla HDR y (iii) la producción de rAAV6.

La selección de un sgRNA de buen rendimiento es crucial, ya que determinará el número máximo de alelos en los que se puede integrar la plantilla HDR. Debido a los numerosos programas que ahora están disponibles, la búsqueda de sgRNAs candidatos se ha simplificado. Al seleccionar la región de interés, el software puede proponer una serie de sgRNAs con una puntuación en el objetivo y una puntuación fuera del objetivo que indican las posibilidades de edición en el locus deseado y loci no deseados, respectivamente. Estas puntuaciones se calculan en base a modelos de puntuación publicados anteriormente48,49. Aunque este es un buen punto de partida para seleccionar un sgRNA de buen rendimiento, el rendimiento del sgRNA debe confirmarse ya que su rendimiento previsto in silico no siempre corresponde a un sgRNA eficiente in vitro. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente diseñar y probar al menos tres sgRNAs para aumentar las posibilidades de encontrar el mejor sgRNA. Una vez que se ha identificado un verdadero sgRNA de buen rendimiento, se sugiere continuar con el diseño de la plantilla HDR.

Se deben tener en cuenta las precauciones al diseñar la plantilla HDR. Los brazos de homología izquierda y derecha (LHA y RHA, respectivamente) deben abarcar 400 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio de corte de sgRNA, respectivamente, ya que las HA más cortas podrían resultar en frecuencias HDR reducidas. El tamaño del ADNc que se puede introducir a través de HDR depende de las capacidades de empaquetado de los AAV, que es de aproximadamente 4,7 kb. Debido a los numerosos elementos obligatorios dentro de la plantilla HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor y secuencia de reportero fluorescente), el espacio restante para el ADNc mutado o WT es limitado. Esto no es problemático si la mutación deseada se encuentra cerca del extremo 3' de un gen o en genes con un CDS corto general. Sin embargo, en los casos en que la mutación se localiza cerca del lado de inicio transcripcional (TSS) de los genes con un CDS largo (que excede el espacio de empaquetamiento restante del AAV), este enfoque descrito puede no ser factible. Para evitar este problema, Bak y sus colegas han desarrollado recientemente una estrategia que se basa en dividir la plantilla HDR en dos AAV. Esta estrategia se basa en dos integraciones separadas mediadas por HDR para obtener la integración final perfecta de un gen grande50.

La calidad del virus y su título son factores adicionales que pueden hacer o deshacer la ingeniería genómica exitosa de las células. Para un rendimiento óptimo, es importante no dejar que el HEK293T alcance la confluencia completa mientras se mantiene en cultivo. Idealmente, las células HEK293T deben dividirse cuando se alcanza una confluencia del 70% -80%. Además, el HEK293T no debe cultivarse durante largos períodos de tiempo, ya que esto puede disminuir su capacidad para producir virus. Las nuevas células HEK293T deben descongelarse después de 20 pasajes. La obtención de altos títulos de virus es importante para aumentar la eficiencia y la reproducibilidad de los experimentos. Los títulos virales bajos se traducirán en grandes volúmenes de solución de rAAV necesarios para la transducción de las HSPC. Como regla general, la solución de rAAV añadida a las células nucleofectadas no debe exceder el 20% del volumen total del medio de retención de HSPC. Los volúmenes más altos de solución AAV pueden conducir a una mayor muerte celular, menor proliferación y eficiencias de transducción deterioradas. En el caso de títulos bajos del virus, se recomienda, por lo tanto, concentrar aún más el virus.

En resumen, este protocolo ofrece un enfoque reproducible para manipular HSPC humanos de manera precisa y eficiente mediante el uso simultáneo de plantillas de donantes CRIPSR / Cas9 y rAAV6 con reporteros fluorescentes duales adicionales. Este enfoque ha demostrado ser una gran herramienta para estudiar la biología normal de las células madre hematopoyéticas y las contribuciones que las mutaciones hacen a la leucemogénesis.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF; número P32783 e I5021) a A.R. La Sociedad Austriaca de Medicina Interna (Joseph Skoda Fellowship), la Sociedad Austriaca de Hematología y Oncología (OeGHO; Beca de Investigación Clínica), y MEFOgraz. T.K. es miembro especial de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated Corning 431080
150 mm x 25 mm dishes Corning 430599
293T DSMZ ACC 635 https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit Lonza - For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit Lonza -
500 ml Centrifuge Tube Corning 431123
7-AAD BD Biosciences 559925
AAVpro Purification Kit Takara 6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies (IDT) 1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge Beckman Coulter -
Benchling sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad -
Chemically modified synthetic sgRNA Synthego Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526
CRISPick sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific K1081
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
FACSAria Fusion BD Biosciences -
Falcon 5 mL Round Bottom Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml Pan Biotech P40-47500
FlowJo 10.8.0 BD Biosciences  -
GenAgarose L.E. Inno-train GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs Inc. (NEB) E2611L
HEK293T
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887-100ML
ICE Synthego https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7533-1KG
Midori Green Advance Nippon Genetics MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit NEB T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml Ambion AM9939
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml Gibco 31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L Lonza V4XP-3024 The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2 Addgene 46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable Bio-Rad 1814040
pDGM6 Addgene 110660
Penicillin-Streptomycin (P/S) Gibco 15140122
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966 Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers  Eurofins - Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay IDT - PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
QuantaSoft Software Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 1864002
QX200 Droplet Reader Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand Peprotech 300-19
Recombinant human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human SCF Peprotech 300-07
Recombinant Human TPO Peprotech 300-18
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758-6X500ML
SnapGene Dotmatics Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium NEB B9020S
Sodium-butyrate Sigma-Aldrich B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1) Biogems 1224999
StemSpan SFEM II STEMCELL Technologies 9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X Thermo Scientific  B49
TIDE http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml Thermo Scientific 16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml Thermo Scientific 15575-038
UM171 STEMCELL Technologies 72914
Vector Builder codon optimization tool Vector Builder https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

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References

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Investigación del cáncer Número 193 CRISPR/Cas9 ingeniería genómica leucemogénesis células madre hematopoyéticas AAV mutación recombinación homóloga mutaciones de ganancia de función
Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas
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Sconocchia, T., Foßelteder, J., … More

Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).

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