Summary
Nye strategier til trofast modellering af somatiske mutationer i hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) er nødvendige for bedre at studere hæmatopoietisk stamcellebiologi og hæmatologiske maligniteter. Her beskrives en protokol til modellering af heterozygote gain-of-function-mutationer i HSPC'er ved at kombinere brugen af CRISPR/Cas9 og dual rAAV donortransduktion.
Abstract
Gennem hele deres levetid erhverver hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC'er) somatiske mutationer. Nogle af disse mutationer ændrer HSPC's funktionelle egenskaber såsom proliferation og differentiering og fremmer derved udviklingen af hæmatologiske maligniteter. Effektiv og præcis genetisk manipulation af HSPC'er er nødvendig for at modellere, karakterisere og bedre forstå de funktionelle konsekvenser af tilbagevendende somatiske mutationer. Mutationer kan have en skadelig virkning på et gen og resultere i tab af funktion (LOF) eller, i skarp kontrast, kan forbedre funktionen eller endda føre til nye egenskaber ved et bestemt gen, kaldet gain-of-function (GOF). I modsætning til LOF-mutationer forekommer GOF-mutationer næsten udelukkende på en heterozygot måde. Nuværende genomredigeringsprotokoller tillader ikke selektiv målretning af individuelle alleler, hvilket hæmmer evnen til at modellere heterozygote GOF-mutationer. Her giver vi en detaljeret protokol om, hvordan man konstruerer heterozygote GOF hotspotmutationer i humane HSPC'er ved at kombinere CRISPR / Cas9-medieret homologi-rettet reparation og rekombinant AAV6-teknologi til effektiv DNA-donorskabelonoverførsel. Det er vigtigt, at denne strategi gør brug af et dobbelt fluorescerende reportersystem for at muliggøre sporing og oprensning af succesfuldt heterozygt redigerede HSPC'er. Denne strategi kan anvendes til præcist at undersøge, hvordan GOF-mutationer påvirker HSPC-funktionen og deres progression mod hæmatologiske maligniteter.
Introduction
Med udviklingen af den klyngede regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-teknologi er et nyt og ekstremt kraftfuldt instrument blevet tilføjet til forskernes værktøjskasse. Denne teknologi giver mulighed for præcis konstruktion af genomet og har vist sig at være yderst nyttig ikke kun til forskningsformål (gennemgået i Hsu et al.1), men for nylig er også blevet oversat med succes til den kliniske indstilling 2,3,4. CRISPR/Cas9-redigeringsstrategier er afhængige af aktiviteten af et Cas9-protein og et enkeltguide-RNA (sgRNA)5,6,7. I værtscellen ledes Cas9-proteinet til et specifikt sted i DNA'et, der er komplementært til sgRNA-sekvensen og vil introducere et DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB). Når en DSB er genereret, er der to primære og konkurrerende reparationsmekanismer, der kan forekomme: ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) og homologistyret reparation (HDR). NHEJ er en fejlbehæftet, overvejende anvendt reparationsmekanisme, der fører til indsættelser og sletninger (indels), mens HDR ved at bruge søsterkromatid som reparationsskabelon er meget præcis, men begrænset til S- eller G2-fasen af cellecyklussen8. I genomteknik kan HDR bruges til målrettet modifikation af DNA ved at tilvejebringe en donorskabelon, der flankeres af homologiarme, der er identiske med begge DNA-ender af Cas9-induceret DSB (figur 1). Den type donorskabelon, der bruges til HDR, kan i høj grad påvirke redigeringseffektiviteten. For genteknologi i humane HSPC'er er adeno-associeret virus serotype 6 (AAV6) for nylig blevet beskrevet som et fremragende middel til levering af enkeltstrengede DNA-skabeloner 9,10.
CRISPR/Cas9 genomteknik kan anvendes terapeutisk til at korrigere skadelige mutationer11, men kan også bruges til at introducere patogene mutationer i DNA'et for at modellere kræftudvikling12. Blodkræft, såsom leukæmi, udvikler sig via sekventiel erhvervelse af somatiske mutationer i raske HSPC'er13,14. Tidlige genetiske hændelser fører til en klonal proliferativ fordel, hvilket resulterer i klonal hæmatopoiesis af ubestemt potentiale (CHIP)15,16. Yderligere erhvervelse af mutationer vil i sidste ende føre til leukæmisk transformation og udvikling af sygdommen. Somatiske mutationer kan findes i gener, der styrer selvfornyelse, overlevelse, spredning og differentiering17.
Introduktion af individuelle mutationer via genomteknik i sunde HSPC'er giver mulighed for præcist modellering af denne trinvise leukemogene proces. Det begrænsede antal tilbagevendende mutationer, der findes i myeloide neoplasmer, såsom akut myeloid leukæmi (AML)18,19, gør denne sygdom særlig modtagelig for at blive rekapituleret ved hjælp af genomtekniske værktøjer.
Somatiske mutationer kan kun opstå på en allel (monoalleliske / heterozygote mutationer) eller på begge alleler (bialleliske / homozygote mutationer) og kan have dybe virkninger på genets funktion, hvilket kan forårsage et funktionstab (LOF) eller en gain-of-function (GOF). LOF-mutationer fører til en reduceret (hvis en allel påvirkes) eller komplet (hvis begge alleler påvirkes) LOF af genet, mens GOF-mutationer fører til en øget aktivering eller ny funktion af genet. GOF-mutationer er typisk heterozygote20.
Det er vigtigt, at zygositeten (hetero- vs. homozygot) har store konsekvenser for forsøget på trofast modellering af en mutation; derfor er den målrettede manipulation af kun en allel af et gen nødvendig for at konstruere heterozygote hotspot GOF-mutationer. Fejlbehæftet NHEJ fører til indels af forskellig længde21, der kan føre til varierende, uforudsigelige biologiske konsekvenser. Men da NHEJ er det dominerende reparationsprogram, der anvendes af celler efter introduktionen af en DSB, tillader de fleste CRISPR / Cas9-platforme, der i øjeblikket bruges til at manipulere HSPC'er, ikke præcist at forudsige det genetiske resultat22,23. I modsætning hertil muliggør introduktionen af et CRISPR/Cas9-medieret dobbeltstrengsbrud (DSB'er) kombineret med brugen af rekombinante adenoassocierede virus (rAAV) vektorbaserede DNA-donorskabeloner til genomteknik via HDR allelspecifik indsættelse af mutationer i humane HSPC'er11,24. Den samtidige integration af en mutant og en vildtypesekvens (WT) kombineret med forskellige fluorescerende reportere på de enkelte alleler kan udføres for at vælge en heterozygot genotype (figur 2). Denne strategi kan udnyttes som et kraftfuldt værktøj til præcist at karakterisere virkningerne af tilbagevendende, leukæmiske, heterozygote GOF hotspot-mutationer på HSPC-funktion, sygdomsinitiering og progression.
I denne artikel gives en detaljeret protokol for effektiv konstruktion af tilbagevendende muterede heterozygote GOF-mutationer i primære humane HSPC'er. Denne strategi kombinerer brugen af CRISPR/Cas9 og en dobbelt AAV6-transduktion for at tilvejebringe WT- og mutante DNA-donorskabeloner til den potentielle generering af den heterozygote GOF-mutation. Som et eksempel vil engineering af de tilbagevendende type 1-mutationer (52 bp-deletion) i calreticulin (CALR) -genet blive vist25. Den heterozygote GOF-mutation i exon 9 af CALR findes gentagne gange i myeloproliferative lidelser såsom essentiel trombocytæmi (ET) og primær myelofibrose (PMF)26. CALR er et endoplasmatisk retikulum-beboerprotein, der primært har en kvalitetskontrolfunktion i foldeprocessen af nyligt syntetiserede proteiner. Dens struktur kan opdeles i tre hoveddomæner: et amino-(N)-terminalt domæne og et prolinrigt P-domæne, som er involveret i proteinets chaperonfunktion, og et C-domæne, som er involveret i calciumlagring og regulering27,28. CALR-mutationer forårsager en +1 frameshift, hvilket fører til transkription af en ny udvidet C-terminal ende og tabet af det endoplasmatiske retikulum (ER) -retentionssignal (KDEL). Mutant CALR har vist sig at binde trombopoietin (TPO) receptoren, hvilket fører til TPO-uafhængig signalering med øget proliferation29.
Figur 1: NHEJ og HDR reparation. Forenklet skematisk repræsentation af NHEJ- og HDR-reparationsmekanismer efter introduktionen af et dobbeltstrenget brud i DNA'et. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over biallelisk HDR-redigeringsstrategi. Skematisk repræsentation, der viser integrationen af donorskabelonerne i de målrettede alleler efterfulgt af deres oversættelse til fungerende mRNA'er. De orange stiplede felter angiver de områder, der svarer til venstre homologiarm (LHA) og højre homologiarm (RHA). Den ideelle størrelse af HA'erne er 400 bp hver. Den grønne stiplede boks repræsenterer det område, der svarer til SA-sekvensen. SA's størrelse er 150 bp. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Denne protokol kræver brug af sunde donorafledte CD34+ HSPC'er og kræver etisk godkendelse fra de lokale institutionelle review boards (IRB) og underskrevet informeret samtykke. CD34+ HSPC'erne, der blev anvendt i denne protokol, blev isoleret fra navlesnorsblodet (UCB) ved terminsleverancer (>34 ugers svangerskab). Der blev indhentet informeret samtykke fra mødrene inden fødslen, og der blev opnået etisk godkendelse til indsamling af UCB (IRB-godkendelse: 31-322 ex 18/19) fra Medical University of Graz. En komplet liste over materialer, der anvendes i denne protokol, findes i materialetabellen.
1. sgRNA-design og evaluering af skæreeffektivitet
- Søg efter placeringen af den ønskede mutation og den korrekte udskrift på et online databaseværktøj (f.eks. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
- Vælg et sgRNA ved siden af mutationen (exonic targeting) eller i den forrige intron (intronic targeting) ved hjælp af et sgRNA-designværktøj. I denne protokol bruges onlineværktøjet fra Benchling. Se materialetabellen for en liste over mulige onlineværktøjer til sgRNA-design.
- Vælg indstillingen + (opret) > DNA-sekvens > importer DNA-sekvenser > importer fra databaser. Indtast det ønskede gen, f.eks. CALR, og vælg menneske som den art, > Søg > Vælg den korrekte transkription (f.eks. CALR-201 -ENST00000316448) > Importer. Vælg det interesseområde, hvor DS-pausen skal introduceres (f.eks. intron 7).
- Vælg CRISPR-indstillingen i højre side af skærmen, og vælg Design og analyser guider. Vælg enkelt guide, hold guidelængden til 20 bp og PAM-sekvensen til redigering med SpCas9 (NGG).
- Vælg en guide med en høj score på målet (stor chance for redigering på det ønskede sted) og en høj score uden for målet (lav chance for redigering på uønskede loci). Vælg mindst tre guider, der skal testes for at finde det bedst ydende sgRNA. Bestil sgRNA'et som et kemisk modificeret syntetisk sgRNA fra en kommerciel leverandør.
BEMÆRK: Det tilrådes på dette tidspunkt at bestille en lille mængde af de syntetiske sgRNA'er til startskærmen. Når et godt fungerende sgRNA er blevet identificeret, skal du fortsætte med en større rækkefølge af det valgte sgRNA. - Optø 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPC'er. Overfør cellerne til 10 ml forvarmet RPMI1640 suppleret med 1% antibiotika (f.eks. penicillin/streptomycin).
BEMÆRK: CD34+ HSPC'er med en renhed >90% bør bruges til at opnå de bedste og mest reproducerbare resultater. - Centrifuge ved 350 x g ved stuetemperatur (RT) i 10 min. Tæl cellerne med et hæmocytometer og suspender cellerne i SFEM II-medium suppleret med 0,2% penicillin/streptomycin (P/S), 100 ng/ml thrombopoietin (TPO), 100 ng/ml stamcellefaktor (SCF), 100 ng/ml FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (FLT3L), 100 ng/ml interleukin-6 (IL-6), 35 nM UM171 og 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) til en koncentration på 2,5 x 105 celler/ml. Der inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 48 timer - 72 timer.
BEMÆRK: Det komplette medie vil fremover blive omtalt som HSPC-retentionsmediet. - Saml cellerne i et 15 ml rør og tæl cellerne. Kontroller cellelevedygtigheden ved trypanblå udelukkelse.
- Før du starter, skal du tænde for transfektionssystemet og vælge indstillingen for kuvetterne. Vælg det relevante program og nukleofektionsopløsning til HSPC'er (se Materialetabel). Mellem 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en 100 μL kuvette. Afsæt et lille antal celler (f.eks. 1 x 10 5-2 x 105) til at holde i kultur i 48 timer, der skal bruges som WT-kontrol.
- Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml glas tilsættes 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molært forhold 1:2,5) og inkuberes ved 25 °C i 10 minutter i en varmeblok.
- Mens RNP-komplekset inkuberer, centrifugeres cellerne ved 350 x g ved RT i 5 minutter, og supernatanten kasseres ved hjælp af en pipette. Cellerne suspenderes i 100 μL nukleofektionsopløsning.
- Bland cellerne med RNP-komplekset og overfør til kuvetten. Bank let på kuvetten for at fjerne eventuelle luftbobler, der måtte være dannet under overførslen.
- Indsæt kuvetten i holderen af transfektionssystemet og elektroporat cellerne med DZ-100-programmet.
- Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 400 μL forvarmet HSPC-retentionsmedium uden P/S.
- Overfør cellerne med en fin overførselspipette til en dyrkningsplade, der indeholder forvarmet HSPC-retentionsmedium uden P/S. Afhængigt af cellenummeret skal du bruge en passende dyrkningsplade (24-, 12- eller 6-brøndplade) for at nå en densitet mellem 0,25 x 10 6 og 1 x 106 celler/ml.
- Pladen overføres til inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Inkuber de nukleofysiske celler i 6-8 timer.
- Efter 6-8 timer fjernes det gamle medium og erstattes med frisk forvarmet HSPC-retentionsmedium suppleret med P/S. Cellerne suspenderes i en koncentration mellem 2,5 x 10 5 og 5 x 105 og overføres til en cellekulturplade (24-, 12- eller 6-brøndsplade). Cellerne inkuberes i 48 timer ved 37 °C/5 % CO2.
- Høst 2 x 10 5 celler og centrifuge ved 350 x g ved RT i5 min. Inden opvarmningsblokkene startes ved 65 °C og 98 °C.
- Kassér supernatanten og suspender cellerne i 1 ml 1x DPBS i et 1,5 ml rør. Centrifuge ved 350 x g ved RT i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og cellerne suspenderes i 50 μL DNA-ekstraktionsopløsning. Vortex i 15 s.
- Der inkuberes i 6 minutter ved 65 °C. Hvirvel i 15 s og inkuberes i 2 minutter ved 98 °C.
- Forstærk DSB-området ved hjælp af PCR ved hjælp af primere, der genererer en amplicon på ca. 400-600 bp med DSB i midten. Brug 0,5-1 μL ekstraheret DNA til PCR-reaktionen.
BEMÆRK: På grund af sammensætningen af DNA-ekstraktionsopløsningen kan DNA-koncentrationerne ikke kvantificeres nøjagtigt ved spektrofotometri. - Kør PCR-produktet med en DNA-stige på en 1,5 % agarosegel ved 100 V i 45-60 min. Placer gelen på et blåt lys eller UV-transilluminator.
- Ekstrahers DNA-båndet af den korrekte størrelse fra gelen ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
- Sekvenser prøverne ved hjælp af Sanger-sekventering ved hjælp af den fremadgående primer eller omvendte primer fra PCR. For PCR-produkter med en længde på 400-600 bp kræves 75 ng DNA til sekventering med en koncentration på 5 ng/ml i et samlet volumen på 15 μL.
- Analyser redigeringseffektiviteten af sgRNA'erne ved at uploade sekventeringsfilerne til et program designet til at beregne redigeringseffektiviteten ved at identificere indsættelsen og sletningerne produceret af sgRNA'et. Vælg det bedst ydende sgRNA at fortsætte med.
BEMÆRK: Dedikerede onlineværktøjer er angivet i materialetabellen. Denne analyse kræver .ab1-filerne for de transfekterede HSPC'er og WT HSPC'er, sgRNA-sekvensen og PAM-sekvensen.
2. Homologi-rettet reparation (HDR) vektorkonstruktion
- HDR-skabelon design
BEMÆRK: Der skal designes to HDR-skabeloner: en skabelon til WT-sekvensen og en skabelon til den muterede sekvens.- Importer den genomiske sekvens og den kodende sekvens (CDS) af det ønskede gen til en passende software til molekylær kloning (dedikerede værktøjer kan findes anført i materialetabellen). Fra den genomiske sekvensfil skal du designe venstre homologiarm (HA) ved at vælge ideelt 400 bp på 5'-enden af DSB. Indsæt denne sekvens i en ny fil.
- Hvis en intron er målrettet med sgRNA'et, skal en splejsningsacceptor (SA) sekvens inkluderes. Vælg de sidste 150 bp af den målrettede intron, og indsæt den efter den venstre HA. Hvis exonen er direkte målrettet, er denne sekvens ikke nødvendig (figur 3).
- Fra CDS-filen skal du vælge cDNA af interesse. Hvis en exonisk sekvens er målrettet, skal du sikre dig, at cDNA'et starter umiddelbart nedstrøms for DSB-stedet og inkluderer alle følgende exoner af genet af interesse samt stopkodonet. Hvis en intron er målrettet, skal du sikre dig, at cDNA'et starter med det første codon af den følgende exon. Codon-optimer cDNA'et og indsæt det efter SA-sekvensen. Brug dedikerede onlineværktøjer til dette formål (materialefortegnelse).
- Indsæt et 3' polyadenyleringssignal (PolyA) efter det interesserede cDNA (f.eks. SV40 eller bGH) (tabel 1). Efter PolyA indsættes en promotorsekvens (f.eks. miltfokusdannende virus [SFFV] eller polyubiquitin C [UBC], tabel 1) for det fluorescerende protein.
- Indsæt sekvensen for det fluorescerende protein (dvs. enten GFP, BFP eller mCherry). Indsæt et andet, men anderledes PolyA-signal.
BEMÆRK: Indsættelse af en anden PolyA-sekvens vil undgå problemer såsom bakteriel rekombination af plasmidet eller problemer med sekvensjustering på grund af to identiske sekvenser i skabelonen. - Fra den genomiske sekvensfil skal du designe den rigtige HA ved at vælge ideelt 400 bp på 3'-enden af DSB. Indsæt denne sekvens efter den anden PolyA.
- Opret en kopi af hele skabelonen og rediger cDNA af interesse, så den indeholder sekvensen af den ønskede mutation.
- Udskift det fluorescerende protein med et andet fluorescerende protein. For eksempel, hvis GFP blev brugt til WT-skabelonen, skal du bytte den med BFP eller mCherry til mutantskabelonen. Konstruer og klon HDR-skabelonerne i pAAV-MCS-plasmidet (eller andre egnede rygrad).
BEMÆRK: De fragmenter, der kræves til samlingen, kan produceres enten ved PCR eller bestilles kommercielt og skal indeholde overlappende sekvenser med deres nabofragmenter. Hvis mutationen af interesse er en punktmutation, en lille indsættelse eller en lille deletion, kan det muterede cDNA produceres ved PCR ved at udføre en stedrettet mutagenese på HDR-skabelonen, der indeholder WT cDNA. - Transformer kompetent Escherichia coli med det samlede produkt ved hjælp af varmechokmetoden. Før du starter, skal du placere bakterierne til optøning på is i 10 minutter.
- Tilsæt 2 μL af de samlede produkter til 50 μL bakterier. Bland indholdet ved blidt svirp.
- Anbring prøverne på is i 30 min. Prøverne overføres til en termoblok indstillet til 42 °C i 30 sekunder.
- Overfør prøverne på is i 5 min. Der tilsættes 450 μL SOC-medium ved stuetemperatur, og prøverne inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Spred prøverne på LB-agarplader indeholdende ampicillin. For hver prøve spredes 100 μL af tre forskellige fortyndinger af bakterieopløsningen (ufortyndet, 1:5 og 1:10) for at opnå LB-agarplader med enkeltkolonier, der kan plukkes. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
- Den næste dag skal du vælge tre kolonier pr. Prøve. Kolonierne overføres til 15 ml rør med hætter indeholdende 4 ml LB-medium suppleret med ampicillin og inkuberes natten over i en ryster ved 37 °C.
- Der afprøves 500 μL bakterieopløsning fra hver koloni og opbevares i køleskab til senere brug. Udfør en mini-prep for at ekstrahere plasmid-DNA i henhold til producentens anvisninger.
- Send prøverne til Sanger-sekventering for at bekræfte den korrekte samling af plasmiderne. Brug nok primere fordelt over plasmidet for at sikre uafbrudt sekvensbekræftelse, ideelt set dækker hver region to gange med fremadgående og omvendt læsning.
- Der tilsættes 200 μL af bakterieopløsningen indeholdende det korrekt monterede plasmid til 200 ml LB-medier suppleret med ampicillin og inkuberes i en ryster natten over ved 37 °C.
- Udfør en midi- eller maxi-prep for at ekstrahere plasmid-DNA'et i henhold til producentens anvisninger. Opbevar plasmid-DNA'et ved -20 °C.
- Rekombinant AAV6 præparat
BEMÆRK: Der skal udføres to separate AAV6-præparater: et til rAAV6 med WT HDR-skabelonen og et til rAAV6 med den muterede HDR-skabelon. I dette afsnit beskrives de trin, der er nødvendige for at forberede kun én virus.- Optø HEK293T-celler, overfør cellerne til 10 ml forvarmet DMEM suppleret med 10% FBS, 1% P/S og 25 mM HEPES og centrifuge ved 350 x g ved RT i 5 min.
- Cellerne opslæmmes i en koncentration på 1 x 105 celler/ml og overføres til en passende kolbe (f.eks. en 175 cm2 kolbe). Kolben overføres til en inkubator ved 37 °C/5 % CO2.
BEMÆRK: HEK293T-celler skal optøs på forhånd for at give cellerne mulighed for at komme sig fuldstændigt og opnå et tilstrækkeligt antal celler (11 x 107 celler er nødvendige for produktion af en virus). Det anbefales at bruge cellerne efter mindst tre passager og holde cellerne under 20 passager. HEK293T-celler skal opdeles tre gange om ugen. Mens cellerne opretholdes, bør disse ikke overstige 70% -80% sammenløb. Den DMEM, der anvendes i AAV-præparatet, bør også allerede suppleres med L-glutamin og natriumpyruvat. - Opsamling cellerne i et 50 ml rør og centrifuge ved 350 x g ved RT i 5 min.
- Suspender cellerne i 20 ml DMEM suppleret med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES og tæl med et hæmocytometer. Brug trypanblå til udelukkelse af døde celler.
- Seed 3 x 106 celler i 20 ml DMEM suppleret med 10% FBS, 1% P/S og 25 mM HEPES i en 175 cm2 kolbe. Til fremstilling af en virus skal du forberede mindst fire 175 cm2 kolber. Cellerne inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 3 dage.
BEMÆRK: Dette trin udføres bedst på en fredag, da det giver cellerne mulighed for at udvide sig i weekenden. - Høst og tæl HEK293T-cellerne.
- Til fremstilling af en af virusserne tilberedes ti 150 mm skåle, der hver indeholder 11 x 106 HEK293T i 20 ml DMEM suppleret med 10% FBS, 1% P/S og 25 mM HEPES.
- Opvasken anbringes i inkubatoren ved 37 °C/5% CO2 i 24 timer. Kassér forsigtigt det gamle medium og erstat med 20 ml antibiotikafri DMEM suppleret med 10% FBS, 25 mM HEPES og 1 mM natriumbutyrat. Før du fortsætter, skal du kontrollere, at cellernes sammenflugt ikke er over 80%.
- Forbered to 15 ml rør, der indeholder transfektionsblandingerne. Til rør 1 tilsættes 5 ml reduceret serummedium, 60 μg rAAV6-muteret HDR-plasmid og 220 μg pDGM6 (hjælperplasmid). Til Tube 2 tilsættes 5 ml reduceret serummedium og 1120 μL 1 mg / ml polyethyleniminopløsning (PEI, transfektionsreagens).
- Tilsæt indholdet af Tube 2 til Tube 1 og vortex i 30 s. Inkuber i 15 minutter ved RT for at sikre korrekt indkapsling af DNA'et i PEI-micellerne.
BEMÆRK: Opbevar ikke opløsningen i mere end 20 min. - Tilsæt forsigtigt dråbevis 1,1 ml af opløsningen til hver skål og fordel ved at hvirvle forsigtigt. Opvasken anbringes i inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer.
- Efter 48 timer tilsættes 250 μL 0,5 M EDTA til hver skål og anbringes i inkubatoren i 10 min. Høst cellerne ved at vaske dem af fadet og overfør dem til et 500 ml centrifugerør eller flere 50 ml rør.
- Der centrifugeres ved 2.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten. For at sikre, at supernatanten fjernes fuldstændigt, centrifuges igen ved 2.000 x g i 1 minut ved 4 °C.
- Eventuel resterende supernatant kasseres. Enhver restsupernatant kan hæmme virusrensningen.
- Løsn pelleten ved hvirveldannelse og ekstraher virussen ved hjælp af et AAV-rensningssæt (se Materialetabel) i henhold til producentens anvisninger. Alternativt kan ekstraktion med iodixanolgradient ultracentrifugering 30,31.
- Aliquot den rensede virus og opbevares ved -80 °C. AAV'en titreres funktionelt, eller AAV-titeren ved hjælp af digital dråbe-PCR (ddPCR)32 for at bestemme de optimale transduktionsbetingelser.
- Gentag denne proces til fremstilling af rAAV6 WT HDR-plasmid.
- AAV-titrering ved ddPCR
- Før du starter, indstilles varmeblokkene til 65 °C og 98 °C.
- Uddrag viralt DNA ved at tilsætte 15 μL DNA-ekstraktionsopløsning til 5 μL af virussen. Vortex i 15 s.
- Der inkuberes i 6 minutter ved 65 °C. Vortex til 15 s. Inkuberes i 2 minutter ved 98 °C.
- Brug det ekstraherede DNA (som er en 1:4 fortynding af det virale DNA) til at forberede serielle fortyndinger (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) med nukleasefri (nf)H2Otil ddPCR.
BEMÆRK: Fortyndingerne kan opbevares ved -20 °C, hvis ddPCR ikke udføres straks. - Vælg tre af fortyndingerne for ddPCR. Valget af fortynding til brug afhænger af koncentrationen af virussen. Brug fortrinsvis tre forskellige fortyndinger (f.eks. 1:40.000, 1:160.000 og 1:640.000) til at finde den bedste fortynding, der ligger inden for maskinens detektionsgrænse.
- Opbevar reagenserne på is, mens du arbejder. Forbered en masterblanding (alle prøverne måles i duplikater). For hver reaktion fremstilles følgende: 12,5 μL ddPCR Supermix til sonder, ingen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR-assay, AAV-ITR (se materialetabel) og 6,25 μL nf-H2O.
- Bland 5 μL DNA med 20 μL af masterblandingen. Udfør dette for fortyndingerne 1:40.000, 1:160.000 og 1:640.000.
- Anbring en cylinderampul i patronholderen. Tilsæt 70 μL dråbegenereringsolie til sonderne i rækken denomineret som olie. Pas på ikke at generere bobler.
- Der tilsættes 20 μL af prøvevolumen i rækken denomineret som prøve. Pas på ikke at generere bobler.
- Forsegl patronen med pakningen og læg den i dråbegeneratoren. Generer dråberne ved at trykke på startknappen på maskinen, fjern pakningen, og overfør forsigtigt 40 μL af de genererede dråber til en 96-brøndsplade med en flerkanalspipette. Arbejd langsomt for at undgå ødelæggelse af dråber og luftbobler.
- Forsegl 96-brøndspladen med pierce folie (den røde stribe opad) ved hjælp af PCR-pladeforsegleren. Placer pladen i en termocyklist.
- Indstil lydstyrken til 40 μL, lågtemperaturen til 105 °C og rampehastighederne til 2 °C/s. Kør PCR-programmet som beskrevet i tabel 2.
- Tænd dråbelæseren 30 min før brug. Åbn softwaren på skrivebordet.
- Indtast pladelayoutet, og vælg ABS på eksperimentfanen og ddPCR Supermix på fanen Supermix. Tryk derefter først på PRIME, efterfulgt af at klikke på FLUSH SYSTEM på softwaren for at starte systemet.
- Indtast pladen i læseren. Start kørslen, og eksporter dataene som en CSV-fil til efterfølgende analyse som et regneark, når du er færdig.
BEMÆRK: De tal, der genereres af softwaren, er genomkopier (GC) pr. μL. Disse skal ganges med fortyndingsfaktorerne: GC/μL x 5 (fortynding af DNA'et i masterblandingen) x initial fortynding (dvs. 40.000 eller 160.000).
Figur 3: Skematisk oversigt over intronic og exonic targeting under CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Skematisk sammenligning mellem intronic og exonic målretningsstrategier for CRISPR / Cas9 HDR knock-in. (A) Under intronisk målretning indføres et dobbeltstrenget brud i en intron af DNA'et. HDR-skabelonen består af en LHA, cDNA-sekvens og RHA. Den introniske målretning kræver desuden tilstedeværelsen af en skiveacceptor, der indeholder 3'-splejsningsstedet, grenpunktet og polypyrimidinkanalen. Dette giver mulighed for korrekt splejsning. Den grønne stiplede boks repræsenterer det område, der svarer til SA-sekvensen. SA's størrelse er 150 bp. (B) Exonic målretning er afhængig af produktionen af et dobbeltstrenget brud direkte i exon. HDR-skabelonen består af en LHA, cDNA-sekvens og RHA. De orange stiplede felter angiver de regioner, der svarer til LHA og RHA. Den ideelle størrelse af HA'erne er 400 bp hver. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Initiativtagere | ||||
| Navn | Længde | Beskrivelse: __________ | ||
| SFFV | 492 bp | Miltfokusdannende viruspromotor. Stærk pattedyrpromotor. Konstitutivt udtrykt | ||
| UBC | 400 bp | Promotor afledt af det humane ubiquitin C-gen. Konstitutivt udtrykt. | ||
| Cmv | 508 bp | Promotor afledt af cytomegalovirus. Det kan indeholde en forstærkerregion. Konstitutivt udtrykt. Stærk pattedyr promotor. Kan bringes til tavshed. | ||
| EF-1a | 1182 bp | Human eukaryot translation forlængelsesfaktor 1 alfapromotor. Konstitutivt udtrykt. Stærk pattedyr promotor. | ||
| EFS | 200-300 bp | EF-1 alpha intron-less kort form | ||
| CAG | 584 bp | Hybrid pattedyrpromotor indeholdende CMV early enhancer (C), chicken beta actin promoter (A) og splejsningsacceptoren for kaninens beta-globin gen (G). Konstitutivt udtrykt. | ||
| Polyadenyleringssignaler (PolyA) | ||||
| Forkortelse | Længde | Beskrivelse: __________ | ||
| SV40 PolyA | 82-122 bp | Simian virus 40 polyadenyleringssignal | ||
| bGH PolyA | 224 bp | Bovin væksthormon polyadenylering signal | ||
| rbGlob PolyA | 56 bp | Kanin beta globin polyadenyleringssignal | ||
Tabel 1: Promotorer og polyadenyleringssignaler.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| Enzym aktivering | 95°C | 10 minutter | 1x |
| Denaturering | 94°C | 30 sekunder | 42x |
| Udglødning | 60°C | 1 minut | |
| Forlængelse | 72°C | 30 sekunder | |
| Deaktivering af enzymer | 98°C | 10 minutter | 1x |
| Holde | 4°C | ∞ |
Tabel 2: Digital dråbe PCR-program.
3. Redigering af HSPC'er
- Transfektion og transduktion af HSPC'er
- CD34+ HSPC'er optøs og overfør cellerne til 10 ml forvarmet RPMI suppleret med 1% P/S. Centrifuger ved 350 x g ved RT i 10 min.
- Cellerne i HSPC-retentionsmedium suspenderes til en koncentration på 2,5 x 105 celler/ml og inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i 48 timer - 72 timer.
- Høst cellerne i et 15 ml rør. Tæl cellerne, og kontroller cellens levedygtighed ved at trypan blå udelukkelse. Mellem 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en enkelt kuvette. Forbered det passende antal kuvetter afhængigt af dit beregnede cellenummer.
- Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml glas tilsættes 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molært forhold 1:2,5) og inkuberes ved 25 °C i 10 minutter i en varmeblok.
- Mens RNP-komplekset inkuberer, centrifugeres cellerne ved 350 x g i 5 minutter, og supernatanten kasseres.
- Cellerne suspenderes i 100 μL nukleofektionsopløsning. Bland cellerne med RNP-komplekset og overfør til kuvetten.
- Bank forsigtigt på kuvetten for at fjerne eventuelle resterende luftbobler, der måtte være dannet under overførslen.
- Indsæt kuvetten i holderen af transfektionssystemet, og elektroporer cellerne som tidligere beskrevet i sgRNA-designafsnittet.
- Umiddelbart efter elektroporation tilsættes 400 μL forvarmet HSPC-retentionsmedium uden P/S og cellerne overføres med en fin overførselspipette til en vævskulturplade indeholdende 500 μL forvarmet HSPC-retentionsmedium uden P/S. Afhængigt af cellenummeret skal du bruge en passende dyrkningsplade (24-, 12- eller 6-brøndsplade) for at nå en densitet mellem 0,25 x 10 6 og 1 x 106 celler / ml. Pladen overføres til inkubatoren ved 37 °C/5% CO2.
- Optø hætteglassene med de frosne rAAV'er på is. Transducer cellerne ved at pipettere den optimale mængde af hver rAAV6 til cellesuspensionen. Udfør transduktionen inden for 20-30 minutter efter elektroporationen for at opnå høj transduktionseffektivitet.
BEMÆRK: Den optimale koncentration af hver virus (en virus til WT HDR-skabelonen og en anden separat virus til den muterede HDR-skabelon) skal bestemmes eksperimentelt. Normalt resulterer 5.000-10.000 GC / celle (f.eks. 5 x 109 GC for 1 x 106 celler) i høj transduktion. - Bland forsigtigt cellesuspensionen med pipetten. De transducerede celler inkuberes i 6-8 timer ved 37 °C/5% CO2. Efter 6-8 timer opsamles cellerne i et rør og centrifugeres ved 350 x g ved RT i 5 minutter.
- Kassér det gamle medie og udskift det med friskt forvarmet HSPC-retentionsmedium suppleret med P/S.
- Suspender cellerne i en koncentration mellem 2,5 x 105-5 x 105 celler / ml og overfør til en vævsbehandlet cellekulturplade (24-, 12- eller 6-brøndplade). Cellerne inkuberes i 48 timer ved 37 °C/5% CO2, inden sorteringen fortsættes.
- Flowsortering af de konstruerede HSPC'er, der bærer den heterozygote GOF-mutation
- Høst cellerne i et 15 ml rør og centrifuger ved 350 x g ved RT i 5 min. Supernatanten fjernes, cellerne suspenderes i 1 ml DPBS indeholdende 0,1% BSA, og centrifuge igen ved 350 x g ved RT i 5 min.
- Kassér supernatanten og suspender cellerne i et passende volumen DPBS + 0,1% BSA afhængigt af cellenummeret.
BEMÆRK: Det anbefales at suspendere cellerne med et minimumsvolumen på 200 μL og ikke overstige 1 x 107 celler / ml for at reducere risikoen for tilstopning af sortereren. - Overfør cellerne til et sterilt FACS-rør udstyret med en hætte. Tilsæt 7-AAD eller andet levedygtighedsfarvestof (afhængigt af deres kompatibilitet med de fluorescerende proteiner) til cellesuspensionen for udelukkelse af levende / døde celler.
- Sorter de levende celler, der er dobbelt positive for de fluorescerende reporterproteiner, i et opsamlingsrør indeholdende 200 μL HSPC-retentionsmedium.
BEMÆRK: Der bør tilføjes passende kontroller bestående af celler, der kun transduceres med AAV'er, for at sikre korrekt gating under sorteringsproceduren. - De sorterede celler centrifugeres ved 350 x g ved RT i 5 minutter, og cellerne suspenderes i HSPC-retentionsmedium i en koncentration på 2,5 x 105 celler/ml til yderligere ekspansion i kulturen, eller cellerne anvendes direkte til funktionelle assays.
4. Bekræftelse af vellykket genredigering
- Genomisk DNA-ekstraktion
- Inden opvarmningsblokkene startes ved 65 °C og 98 °C. Høst 2 x 10 5 genom-redigerede og sort-rensede celler og centrifuge ved 350 x g i5 min.
- Uddrag gDNA'et som tidligere beskrevet. Brug enten DNA-opløsningen direkte til PCR eller opbevar ved -20 °C.
- PCR ud
- Design to primere til at forstærke 5'-indsættelsesstedet (figur 4A): primer fremad 1 er rettet mod det genomiske sted uden for venstre homologiarm; Primer omvendt 2 er rettet mod den integrerede sekvens.
- For in-out PCR skal du forberede følgende PCR-blanding pr. reaktion:
10 μL PCR Master Mix (2x; se materialetabel)
1 μL primer fremad 1 (10 μM lager)
1 μL primer omvendt 2 (10 μM lager)
0,5-1,0 μL ekstraheret DNA
Nukleasefri H2O til et slutvolumen på 20 μL
BEMÆRK: For mere end én reaktion anbefales det at forberede en masterblanding, der indeholder en ekstra reaktion for at tage højde for pipetteringsfejl. Det er vigtigt at inkludere en ikke-skabelon kontrol og skabelon DNA fra en mock-behandlet prøve. - Kør PCR-reaktionerne med det relevante termiske cykelprogram (se producentens instruktioner).
BEMÆRK: Det tilrådes først at teste primerparret for den optimale udglødningstemperatur. Dette kan gøres ved at beregne Tm og derefter ved at køre PCR med en termocykler, der kan udføre en gradienttemperatur. - PCR-produkterne køres med en DNA-stige på en 1,5% agarosegel ved 100 V i 45-60 min (figur 4B). Placer gelen på et blåt lys eller UV-transilluminator. Punktafgifter båndene fra gelen.
- Uddrag DNA'et fra båndene ved hjælp af et DNA-gelekstraktionssæt. Send de ekstraherede PCR-prøver med passende primere til Sanger-sekventering for at bekræfte den korrekte og sømløse integration af det ønskede cDNA på det endogene genlocus.
Figur 4: Validering af genomisk integration ved ind-ud-PCR. (A) Skematisk gengivelse af ind-ud-PCR-strategien. I den afbildede strategi blev der designet to primere. Primeren fremad 1 er rettet mod det genomiske locus uden for LHA, og primerens omvendte 2 er målrettet mod den kodonoptimerede sekvens. (B) Skematisk repræsentation af en agarosegelelektroforese. Kun korrekt redigerede celler (RNP + AAV) genererer et PCR-produkt under PCR ind-ud, mens de uredigerede prøver (kun AAV) ikke genererer et PCR-produkt. Forkortelse: NTC = ikke-skabelon kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Ved at anvende den ovenfor beskrevne protokol blev heterozygote type 1 CALAR-mutationer reproducerbart introduceret i navlestrengsblodafledte HSPC'er. Denne mutation består af en 52 bp deletion i exon 9 (den sidste exon af CALR), hvilket resulterer i en +1 frameshift, hvilket fører til oversættelsen af et nyt positivt ladet C-terminaldomæne26,33. For at introducere CARAL-mutationen på det endogene gen-locus blev der vedtaget en intronisk målretningsstrategi opstrøms for exon 9, da dette ville omgå uønskede ændringer i kodningssekvensen i tilfælde, hvor den Cas9-inducerede DSB ikke blev repareret via HDR-mekanismen. I dette specifikke tilfælde blev et sgRNA for intron 7 designet på grund af tilgængeligheden af høje on-target og lave off-target sekvenser i kombination med gunstige homologiarme (mangel på sekvensgentagelser; Figur 5A).
To donorskabeloner blev derefter designet og pakket i AAV6-vektorer. For at muliggøre korrekt splejsning fra de endogene exoner til det integrerede cDNA indeholder donorskabelonerne (i) en SA-sekvens, herunder 3'-splejsningsstedet, grenpunktet og polypyrimidinkanalen, (ii) den codonoptimerede cDNA-sekvens af exons 8-9, der enten indeholder WT (CALR WT) eller den muterede sekvens (CALRDEL ), herunder et stopkodon, iii) et simianvirus 40 (SV40) polyA-signal, iv) en sekvens, der koder for et fluorescerende protein under kontrol af den separate interne promotor, promotoren til miltfokusdannende virus (SFFV), efterfulgt af v) et polyA-signal fra kvægvæksthormon (bGH). Donorskabelonen, der indeholdt CALR WT cDNA, var designet til at indeholde en GFP-kassette, mens donorskabelonen, der indeholdt CALRDEL cDNA-sekvensen, var designet til at indeholde en BFP-kassette. Hele konstruktionen var flankeret af en venstre og højre HA (figur 5A).
To dage efter transfektion med RNP-komplekset og transduktion med rAAV6-viraerne blev cellerne analyseret ved flowcytometri. Fire hovedpopulationer kunne påvises: i) celler, der hverken udtrykte GFP eller BFP, og som repræsenterede celler uden HDR-baseret genomredigering, ii) celler, der kun var positive for GFP, og som repræsenterede dem, der kun havde integreret WT-konstruktionen, iii) celler, der kun var positive for BFP, og som repræsenterede dem, der kun havde integreret den muterede konstruktion, og iv) dobbeltpositive GFP- og BFP-celler repræsenterer de celler, der havde integreret både WT og muterede sekvenser (figur 5B). For at opnå rene populationer af HSPC'er, der bærer den heterozygote type 1 CARR-mutation , blev de dobbeltpositive celler sorteret efter flowcytometri. HSPC'er, hvor to WT-sekvenser blev slået ind, blev brugt som kontrolceller (GFP+ mCherry+; Figur 5B). Et gyldigt alternativ til brug som kontrolceller ville være HSPC'er med en biallelisk integration af de fluorescerende proteiner i et safe harbor-locus (dvs. AAVS1; ikke vist). Celletælling ved trypanblå udelukkelse udført på de sorterede HSPC'er indikerede, at mere end 90% af cellerne var levedygtige.
Problemfri integration af konstruktionerne på målet blev bekræftet ved at anvende in-out PCR-strategien (figur 6A). I dette specifikke tilfælde udførte vi to separate ind-ud-PCR'er, en for den indbankede CALR WT-sekvens (bane 1 i gelelektroforesen i figur 6A) og en for den indbankede CALRDEL-sekvens (bane 2 i gelelektroforesen i figur 6A). Sanger-sekventering udført på DNA ekstraheret fra gelbåndene bekræftede den korrekte indsættelse af WT og muterede sekvenser i CALRDEL/WT HSPC'erne (figur 6B).
Figur 5: Generering af HSPC'er med den heterozygote CALAR-mutation. (A) Repræsentativt skema, der viser redigeringsstrategien for indsættelse af den heterozygote CALAR-mutation. RNP-komplekset er rettet mod intron mellem exon 7 og exon 8 i CALAR-genet. To AAV'er, den ene indeholdende de muterede exoner 8-9 og en BFP og den anden indeholdende WT exons 8-9 og en GFP, vil tjene som donorreparationsskabeloner og vil fremme integrationen af den muterede sekvens i en allel og integrationen af WT-sekvensen i den resterende allel. (B) Repræsentative flowcytometriplots, der viser ekspressionen af GFP og BFP eller GFP og mCherry 48 timer efter transfektion og transduktion af HSPC'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Validering af vellykket heterozygot CALR-mutation i HSPC'er. (A) Gelelektroforese fra produkterne fra den in-out PCR udført på genomisk DNA ekstraheret fra AAV-kontroller, CALR WT /WT og CALRDEL / WT. En 100 bp DNA-stige blev brugt. Forkortelse: NTC = ikke-skabelon kontrol. (B) Sanger-sekventeringsresultater opnået fra de in-out PCR'er, der blev udført på CALRDEL/WT, hvilket bekræfter en vellykket integration af WT og muterede sekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den effektive og præcise genetiske manipulation af humane primære HSPC'er repræsenterer en fantastisk mulighed for at udforske og forstå de processer, der påvirker normal hæmatopoiese, og vigtigst af alt, leukæmisk transformation af hæmatopoietiske celler.
I denne protokol blev der beskrevet en effektiv strategi til at konstruere humane HSPC'er til at udtrykke tilbagevendende heterozygote GOF-mutationer. Denne procedure udnyttede CRISPR/Cas9-teknologi og rAAV6-vektorer som donorer til DNA-skabeloner til præcist at indsætte WT- og mutante DNA-sekvenser i deres endogene gen-loci. Kobling af de konstruerede cDNA'er (WT og mutant) med separerede fluorescerende reporterproteiner muliggør berigelse og sporing af celler med en endelig heterozygot tilstand.
Denne strategi giver flere fordele i forhold til de ofte anvendte lentivirale (LV) -baserede metoder. En af de største fordele er, at det CRISPR/Cas9-baserede system giver mulighed for præcis redigering i de endogene loci, hvilket resulterer i bevarelse af de endogene promotorer og reguleringselementer. Dette fører til homogenitet i ekspressionen af det redigerede gen i cellerne, et mål, der næppe kan opnås, når en LV-baseret metode anvendes. Genoverførsel med LV-vektorer fører til semi-tilfældig integration af genet med præference for transkriptionelt aktive steder34. Dette kan oversættes til overekspression af det overførte gen og heterogenitet mellem de redigerede celler, hvilket i sidste ende resulterer i vanskeligheder med at undersøge og analysere mutationers og geninteraktioners rolle. En anden fordel er, at det beskrevne system, som er et stedspecifikt redigeringssystem, eliminerer risikoen for mutagenese35.
Den dobbelte fluorescerende reporterstrategi giver mulighed for præcis berigelse og sporing af celler, der med succes blev redigeret på begge alleler, hvor den ene allel integrerer WT cDNA og den anden allel integrerer de muterede cDNA-sekvenser. Celler, der kun udtrykker en enkelt reporter, repræsenterer enten kun monoallelisk integration eller biallelisk integration af HDR-skabeloner med den samme fluorescerende reporter. Begge scenarier kan kun skelnes præcist, hvis enkeltcelleafledte kloner produceres og analyseres individuelt. HSPC'er har imidlertid kun begrænset proliferativ kapacitet in vitro, og når HSPC'er holdes i kultur i længere perioder, begynder HSPC'er at differentiere sig til mere modne afkom og mister deres selvfornyelses- og indkapslingskapacitet. Dette gør udvælgelse og udvidelse af enkeltcellekloner, der huser den ønskede heterozygote mutation, umulig. Anvendelsen af strategien med dobbelt fluorescerende protein og berigelse ved flowcytometri for celler, der bærer den heterozygote mutation, gør det muligt at omgå de problemer, der induceres af udvidet in vitro-kultur .
I dette specifikke eksempel blev det med succes demonstreret, at HSPC'er effektivt kunne konstrueres og sorteres for at opnå rene populationer af HSPC'er, der bærer den heterozygote CALRDEL / WT-mutation.
Dette system er imidlertid ikke begrænset til at konstruere heterozygote frameshift-mutationer, men kan også let vedtages for at skabe andre mutationstyper, herunder missense og nonsensmutationer. Ved at anvende forskellige kombinationer af AAV'er, der indeholder WT eller muterede sekvenser med forskellige fluorescerende reporterproteiner, kan dette system også bruges til introduktion af homozygote mutationer (samtidig transduktion med to rAAV'er, der begge bærer mutant cDNA, men forskellige fluorescerende reportere) eller endda korrektion af mutationer (samtidig transduktion med to AAV'er, der begge bærer WT cDNA, men forskellige fluorescerende reportere). Derudover er det vigtigt at nævne, at denne strategi ikke er begrænset til introduktion af onkogene GOF-mutationer. Faktisk kan den beskrevne protokol bruges til flere alternative strategier, herunder gen-knock-out, genudskiftning 36,37, målrettet knock-in af transgener (dvs. kimære antigenreceptorer)38 og endda til korrektion af sygdomsfremkaldende mutationer 11,39.
Strategien med at kombinere CRISPR / Cas9 og AAV6 med flere fluorescerende reportere har også vist sig at være anvendelig i mange andre celletyper, herunder T-celler, plasmacytoid dendritiske celler, inducerede pluripotente stamceller, neuronale stamceller og luftvejsstamceller 24,38,40,41,42,43,44 . Denne strategi kan implementeres til produktion af overlegne kimære antigenreceptor (CAR) T-celler. For eksempel blev det for nylig offentliggjort, at CRISPR / Cas9-medieret knock-out af TGFBR2-genet i CAR T-celler i høj grad øger deres funktion i det suppressive TGF-β rige tumormikromiljø45. En sådan tilgang kunne give en et-trins protokol til både at konstruere T-cellerne til at udtrykke CAR og til at slå TGFBR2-genet ud efter sted, der specifikt indsætter CAR i begge alleler af TGFBR2-genet. Desuden kan denne tilgang også være nyttig til at generere universelle CAR T-celler ved at integrere CAR i T-cellereceptorens alfakonstantgen (TRAC)46,47.
For at øge reproducerbarheden og garantere effektiv redigering af cellerne skal der tages nogle vigtige overvejelser. De vigtigste kritiske punkter for at sikre vellykket redigering af cellerne ligger i (i) udvælgelsen af sgRNA'et, (ii) designet af HDR-skabelonen og (iii) rAAV6-produktionen.
Valget af et velfungerende sgRNA er afgørende, da det vil bestemme det maksimale antal alleler, hvori HDR-skabelonen kan integreres. På grund af adskillige software, der nu er tilgængelige, er søgningen efter kandidat-sgRNA'er blevet forenklet. Ved at vælge det interessante område kan softwaren foreslå en række sgRNA'er med en on-target score og en off-target score, der angiver chancerne for redigering på henholdsvis det ønskede locus og uønskede loci. Disse scorer er beregnet ud fra tidligere offentliggjorte scoringsmodeller48,49. Selvom dette er et godt udgangspunkt for at vælge et godt fungerende sgRNA, skal sgRNA'ets ydeevne bekræftes, da dets forudsagte ydeevne i silico ikke altid svarer til et effektivt sgRNA in vitro. Derfor anbefales det stærkt at designe og teste mindst tre sgRNA'er for at øge chancerne for at finde det bedste sgRNA. Når et ægte godt fungerende sgRNA er blevet identificeret, foreslås det at fortsætte med designet af HDR-skabelonen.
Der skal tages forholdsregler ved design af HDR-skabelonen. Venstre og højre homologiarm (henholdsvis LHA og RHA) skal hver spænde over henholdsvis 400 bp opstrøms og nedstrøms for sgRNA-snitstedet, da kortere HA'er kan resultere i reducerede HDR-frekvenser. Størrelsen af cDNA, der kan introduceres via HDR, afhænger af AAV'ernes emballeringsevne, som er ca. 4,7 kb. På grund af de mange elementer, der er obligatoriske i HDR-skabelonen (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor og fluorescerende reportersekvens), er den resterende plads til det muterede eller WT cDNA begrænset. Dette er uproblematisk, hvis den ønskede mutation er placeret nær 3'-enden af et gen eller i gener med en samlet kort CDS. I tilfælde, hvor mutationen er placeret nær transkriptionel startside (TSS) af generne med en lang CDS (overstiger den resterende pakningsplads i AAV), er denne beskrevne fremgangsmåde muligvis ikke mulig. For at omgå dette problem er en strategi, der er afhængig af at opdele HDR-skabelonen i to AAV'er, for nylig blevet udviklet af Bak og kolleger. Denne strategi er afhængig af to separate HDR-medierede integrationer for at opnå den endelige sømløse integration af et stort gen50.
Kvaliteten af virussen og dens titer er yderligere faktorer, der kan gøre eller bryde den vellykkede genomteknik af cellerne. For et optimalt udbytte er det vigtigt ikke at lade HEK293T nå fuld sammenløb, mens den opretholdes i kultur. Ideelt set bør HEK293T-cellerne opdeles, når 70% -80% sammenløb er nået. Derudover bør HEK293T ikke dyrkes i lange perioder, da dette kan nedsætte deres evne til at producere virus. Nye HEK293T-celler skal optøes efter 20 passager. Det er vigtigt at opnå høje virustitre for at øge eksperimenternes effektivitet og reproducerbarhed. Lave virale titere vil oversætte til store mængder rAAV-opløsning, der kræves til transduktion af HSPC'erne. Som hovedregel bør rAAV-opløsningen, der tilsættes til de nukleofekterede celler, ikke overstige 20% af det samlede volumen af HSPC-retentionsmediet. Højere volumener af AAV-opløsning kan føre til øget celledød, lavere proliferation og nedsat transduktionseffektivitet. I tilfælde af lave virustitre anbefales det derfor at koncentrere virussen yderligere.
Sammenfattende tilbyder denne protokol en reproducerbar tilgang til at manipulere humane HSPC'er præcist og effektivt gennem samtidig brug af CRIPSR / Cas9 og rAAV6 donorskabeloner med yderligere dobbelt fluorescerende reportere. Denne tilgang har vist sig at være et godt værktøj til at studere normal hæmatopoietisk stamcellebiologi og de bidrag, som mutationer yder til leukemogenese.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af tilskud fra den østrigske videnskabsfond (FWF; nummer P32783 og I5021) til A.R. Yderligere finansiering til A.R. ydes også af det østrigske samfund for intern medicin (Joseph Skoda Fellowship), det østrigske samfund for hæmatologi og onkologi (OeGHO; Klinisk forskningsbevilling), og MEFOgraz. T.K. er en særlig stipendiat af Leukæmi & Lymfom Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
| 150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
| 293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
| 4D Nucleofector Core Unit | Lonza | - | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
| 4D Nucleofector X Unit | Lonza | - | |
| 500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
| Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | - | |
| Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | - | |
| Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
| CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
| Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
| CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| FACSAria Fusion | BD Biosciences | - | |
| Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
| FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | - | |
| GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
| HEK293T | |||
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
| IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
| IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
| LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
| LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
| Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
| Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
| pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
| PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| pDGM6 | Addgene | 110660 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
| Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
| Primers | Eurofins | - | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
| PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | - | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
| Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
| Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
| SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
| Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
| Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
| Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
| StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
| TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
| UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
| UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
| Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |
References
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
- Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757 (2013).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
- Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
- Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
- Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
- Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
- Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
- Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
- Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
- Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
- Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
- Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371 (2021).
- How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
- Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
- Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
- Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
- Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
- Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873 (2017).
- Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
- Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
- Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977 (2020).
- Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
