हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) में दैहिक उत्परिवर्तन को ईमानदारी से मॉडल करने के लिए नई रणनीतियां हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल जीव विज्ञान और हेमेटोलॉजिकल विकृतियों का बेहतर अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं। यहां, CRISPR / Cas9 और दोहरे rAAV दाता पारगमन के उपयोग के संयोजन से HSPCs में विषम लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
अपने पूरे जीवनकाल में, हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) दैहिक उत्परिवर्तन प्राप्त करती हैं। इनमें से कुछ उत्परिवर्तन एचएसपीसी कार्यात्मक गुणों जैसे प्रसार और भेदभाव को बदलते हैं, जिससे हेमेटोलॉजिक विकृतियों के विकास को बढ़ावा मिलता है। आवर्तक दैहिक उत्परिवर्तन के कार्यात्मक परिणामों को मॉडल, चिह्नित और बेहतर ढंग से समझने के लिए एचएसपीसी के कुशल और सटीक आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता होती है। उत्परिवर्तन एक जीन पर हानिकारक प्रभाव डाल सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप हानि-ऑफ-फ़ंक्शन (एलओएफ) हो सकता है या, इसके विपरीत, फ़ंक्शन को बढ़ा सकता है या यहां तक कि किसी विशेष जीन की नई विशेषताओं को जन्म दे सकता है, जिसे गेन-ऑफ-फंक्शन (जीओएफ) कहा जाता है। एलओएफ उत्परिवर्तन के विपरीत, जीओएफ उत्परिवर्तन लगभग विशेष रूप से विषम फैशन में होते हैं। वर्तमान जीनोम-संपादन प्रोटोकॉल व्यक्तिगत एलील्स के चयनात्मक लक्ष्यीकरण की अनुमति नहीं देते हैं, जिससे विषम जीओएफ उत्परिवर्तन को मॉडल करने की क्षमता में बाधा आती है। यहां, हम कुशल डीएनए दाता टेम्पलेट स्थानांतरण के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत और पुनः संयोजक एएवी 6 तकनीक के संयोजन से मानव एचएसपीसी में विषम जीओएफ हॉटस्पॉट म्यूटेशन को इंजीनियर करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यह रणनीति एक दोहरे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करती है ताकि सफलतापूर्वक विषम रूप से संपादित एचएसपीसी की ट्रैकिंग और शुद्धिकरण की अनुमति मिल सके। इस रणनीति को सटीक रूप से जांचने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि जीओएफ उत्परिवर्तन एचएसपीसी फ़ंक्शन और हेमेटोलॉजिकल विकृतियों की ओर उनकी प्रगति को कैसे प्रभावित करते हैं।
नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस9 तकनीक के विकास के साथ, वैज्ञानिकों के टूलकिट में एक नया और बेहद शक्तिशाली उपकरण जोड़ा गया है। यह तकनीक जीनोम की सटीक इंजीनियरिंग के लिए अनुमति देती है और न केवल अनुसंधान उद्देश्यों के लिए खुद को बेहद उपयोगी साबित किया है (ह्सू एट अल 1 में समीक्षा की गई है) बल्कि हाल ही में नैदानिक सेटिंग 2,3,4 में भी सफलतापूर्वक अनुवाद किया गया है। CRISPR / Cas9 संपादन रणनीतियाँ Cas9 प्रोटीन और एकल-गाइड आरएनए (sgRNA) 5,6,7 की गतिविधि पर निर्भर करती हैं। मेजबान सेल में, कैस 9 प्रोटीन को डीएनए में एक विशिष्ट साइट पर निर्देशित किया जाता है जो एसजीआरएनए अनुक्रम का पूरक है और डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) पेश करेगा। एक बार डीएसबी उत्पन्न होने के बाद, दो मुख्य और प्रतिस्पर्धी मरम्मत तंत्र हो सकते हैं जो हो सकते हैं: गैर-समरूप अंत जुड़ने (एनएचईजे) और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)। एनएचईजे एक त्रुटि-प्रवण, मुख्य रूप से उपयोग किया जाने वाला मरम्मत तंत्र है जो सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) के लिए अग्रणी है, जबकि एचडीआर, मरम्मत टेम्पलेट के रूप में बहन क्रोमैटिड का उपयोग करके, बहुत सटीक है लेकिन सेल चक्र8 के एस या जी 2 चरण तक सीमित है। जीनोम इंजीनियरिंग में, एचडीआर का उपयोग एक दाता टेम्पलेट प्रदान करके डीएनए के लक्षित संशोधन के लिए किया जा सकता है जो कैस 9-प्रेरित डीएसबी (चित्रा 1) के दोनों डीएनए सिरों के समान होमोलॉजी हथियारों से घिरा हुआ है। एचडीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले दाता टेम्पलेट का प्रकार संपादन दक्षता को बहुत प्रभावित कर सकता है। मानव एचएसपीसी में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए, एडेनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 6 (एएवी 6) को हाल ही में एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट 9,10 के वितरण के लिए एक उत्कृष्ट वाहन के रूप में वर्णित किया गया है।
CRISPR / Cas9 जीनोम इंजीनियरिंग को हानिकारक उत्परिवर्तन11 को ठीक करने के लिए चिकित्सीय रूप से नियोजित किया जा सकता है, लेकिन कैंसर के विकास को मॉडल करने के लिए डीएनए में रोगजनक उत्परिवर्तन पेश करने के लिए भी उपयोग किया जा सकताहै। रक्त कैंसर, जैसे ल्यूकेमिया, स्वस्थ एचएसपीसी13,14 में दैहिक उत्परिवर्तन के अनुक्रमिक अधिग्रहण के माध्यम से विकसित होता है। प्रारंभिक आनुवंशिक घटनाओं से क्लोनल प्रोलिफेरेटिव लाभ होता है, जिसके परिणामस्वरूप अनिश्चित क्षमता (CHIP) 15,16 के क्लोनल हेमटोपोइजिस होते हैं। उत्परिवर्तन के आगे अधिग्रहण से अंततः ल्यूकेमिक परिवर्तन और रोग का विकास होगा। दैहिक उत्परिवर्तन आत्म-नवीकरण, अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले जीन में पाए जासकते हैं।
स्वस्थ एचएसपीसी में जीनोम इंजीनियरिंग के माध्यम से व्यक्तिगत उत्परिवर्तन पेश करने से इस चरणबद्ध ल्यूकेमोजेनिक प्रक्रिया को सटीक रूप से मॉडलिंग करने की अनुमति मिलती है। माइलॉयड नियोप्लाज्म जैसे तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) 18,19 में पाए जाने वाले आवर्तक उत्परिवर्तनों की सीमित संख्या इस बीमारी को विशेष रूप से जीनोम इंजीनियरिंग उपकरणों का उपयोग करके पुन: प्राप्त करने योग्य बनाती है।
दैहिक उत्परिवर्तन केवल एक एलील (मोनोएलील / विषम उत्परिवर्तन) या दोनों एलील (बाइएलील / होमोजीगस उत्परिवर्तन) पर उभर सकते हैं और जीन के कार्य पर गहरा प्रभाव डाल सकते हैं, जो हानि-ऑफ-फ़ंक्शन (एलओएफ) या गेन-ऑफ-फंक्शन (जीओएफ) का कारण बन सकता है। एलओएफ उत्परिवर्तन जीन के कम (यदि एक एलील प्रभावित होता है) या पूर्ण (यदि दोनों एलील प्रभावित होते हैं) एलओएफ का कारण बनते हैं, जबकि जीओएफ उत्परिवर्तन जीन के सक्रियण या नए कार्य को बढ़ाते हैं। जीओएफ उत्परिवर्तन आमतौर पर विषम20 होते हैं।
महत्वपूर्ण रूप से, युग्मनजता (हेटेरो- बनाम होमोजीगोस) में उत्परिवर्तन को ईमानदारी से मॉडल करने के प्रयास के लिए प्रमुख निहितार्थ हैं; इसलिए, एक जीन के केवल एक एलील का लक्षित हेरफेर विषम हॉटस्पॉट जीओएफ उत्परिवर्तन को इंजीनियर करने के लिए आवश्यक है। त्रुटि-प्रवण एनएचईजे विभिन्न लंबाई21 के इंडेल की ओर जाता है जो अलग-अलग, अप्रत्याशित जैविक परिणामों का कारण बन सकता है। हालांकि, चूंकि एनएचईजे डीएसबी की शुरुआत के बाद कोशिकाओं द्वारा नियोजित प्रमुख मरम्मत कार्यक्रम है, इसलिए वर्तमान में एचएसपीसी में हेरफेर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्लेटफॉर्म आनुवंशिक परिणाम22,23 की सटीक भविष्यवाणी करने की अनुमति नहीं देते हैं। इसके विपरीत, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) की शुरूआत, HDR के माध्यम से जीनोम इंजीनियरिंग के लिए पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस (rAAV) वेक्टर-आधारित डीएनए दाता टेम्पलेट्स के उपयोग के साथ मिलकर, मानव HSPCs11,24 में उत्परिवर्तन के एलील-विशिष्ट सम्मिलन की अनुमति देता है। अलग-अलग एलील्स पर अलग-अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ युग्मित एक उत्परिवर्ती और एक जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) अनुक्रम का एक साथ एकीकरण एक विषम जीनोटाइप (चित्रा 2) के लिए चयन करने के लिए किया जा सकता है। एचएसपीसी फ़ंक्शन, रोग दीक्षा और प्रगति पर आवर्तक, ल्यूकेमिक, विषम जीओएफ हॉटस्पॉट म्यूटेशन के प्रभावों को सटीक रूप से चिह्नित करने के लिए इस रणनीति का लाभ उठाया जा सकता है।
इस लेख में, प्राथमिक मानव एचएसपीसी में वर्तमान में उत्परिवर्तित विषम जीओएफ उत्परिवर्तन की कुशल इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह रणनीति विषम जीओएफ उत्परिवर्तन की संभावित पीढ़ी के लिए डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डीएनए दाता टेम्पलेट प्रदान करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 और दोहरे एएवी 6 ट्रांसडक्शन के उपयोग को जोड़ती है। एक उदाहरण के रूप में, कैलरेटिकुलिन (सीएएलआर) जीन में आवर्तक टाइप 1 उत्परिवर्तन (52 बीपी विलोपन) की इंजीनियरिंग25 दिखाई जाएगी। सीएएलआर के एक्सॉन 9 में विषम जीओएफ उत्परिवर्तन वर्तमान में आवश्यक थ्रोम्बोसिथेमिया (ईटी) और प्राथमिक मायलोफाइब्रोसिस (पीएमएफ) 26 जैसे मायलोप्रोलिफेरेटिव विकारों में पाया जाता है। सीएएलआर एक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम निवासी प्रोटीन है जिसमें मुख्य रूप से नए संश्लेषित प्रोटीन की तह प्रक्रिया में गुणवत्ता नियंत्रण कार्य होता है। इसकी संरचना को तीन मुख्य डोमेन में विभाजित किया जा सकता है: एक एमिनो (एन)-टर्मिनल डोमेन और एक प्रोलाइन-समृद्ध पी डोमेन, जो प्रोटीन के चैपरोन फ़ंक्शन में शामिल हैं, और एक सी-डोमेन, जो कैल्शियम भंडारण और विनियमन27,28 में शामिल है। सीएएलआर उत्परिवर्तन +1 फ्रेमशिफ्ट का कारण बनता है, जिससे एक उपन्यास विस्तारित सी-टर्मिनल अंत का प्रतिलेखन होता है और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) -प्रतिधारण संकेत (केडीईएल) का नुकसान होता है। उत्परिवर्ती सीएएलआर को थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) रिसेप्टर को बांधने के लिए दिखाया गया है, जिससे प्रसार में वृद्धि के साथ टीपीओ-स्वतंत्र सिग्नलिंगहोती है।
चित्रा 1: एनएचईजे और एचडीआर मरम्मत। डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक की शुरूआत के बाद एनएचईजे और एचडीआर मरम्मत तंत्र का सरलीकृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: बाइएलील एचडीआर संपादन रणनीति का योजनाबद्ध अवलोकन। योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व लक्षित एलील्स में दाता टेम्पलेट्स के एकीकरण को दर्शाता है, जिसके बाद कार्यशील एमआरएनए में उनका अनुवाद होता है। नारंगी डॉटेड बॉक्स बाएं होमोलॉजी आर्म (एलएचए) और राइट होमोलॉजी आर्म (आरएचए) के अनुरूप क्षेत्रों को इंगित करते हैं। एचए का आदर्श आकार प्रत्येक 400 बीपी है। हरे रंग का बिंदीदार बॉक्स एसए अनुक्रम के अनुरूप क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। SA का आकार 150 bp है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मानव प्राथमिक एचएसपीसी का कुशल और सटीक आनुवंशिक हेरफेर सामान्य हेमटोपोइजिस को प्रभावित करने वाली प्रक्रियाओं का पता लगाने और समझने का एक शानदार अवसर का प्रतिनिधित्व करता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का ल्यूकेमिक परिवर्तन।
इस प्रोटोकॉल में, आवर्तक विषम जीओएफ उत्परिवर्तन को व्यक्त करने के लिए मानव एचएसपीसी को इंजीनियर करने के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन किया गया था। इस प्रक्रिया ने CRISPR / Cas9 तकनीक और rAAV6 वैक्टर का डीएनए टेम्पलेट्स के लिए दाताओं के रूप में लाभ उठाया ताकि डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डीएनए अनुक्रमों को उनके अंतर्जात जीन लोकी में सटीक रूप से सम्मिलित किया जा सके। अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ इंजीनियर सीडीएनए (डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती) को युग्मित करने से कोशिकाओं के संवर्धन और ट्रैकिंग के लिए एक निश्चित विषम अवस्था के साथ अनुमति मिलती है।
यह रणनीति अक्सर उपयोग किए जाने वाले लेंटिवायरल (एलवी) -आधारित तरीकों की तुलना में कई फायदे प्रस्तुत करती है। एक मुख्य लाभ यह है कि CRISPR / Cas9-आधारित प्रणाली अंतर्जात लोकी में सटीक संपादन की अनुमति देती है, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्जात प्रमोटरों और नियामक तत्वों का संरक्षण होता है। यह कोशिकाओं में संपादित जीन की अभिव्यक्ति में एकरूपता की ओर जाता है, एक लक्ष्य जो एलवी-आधारित विधि का उपयोग करते समय शायद ही प्राप्त किया जा सकता है। एलवी वैक्टर के साथ जीन स्थानांतरण ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय साइटों के लिए वरीयता के साथ जीन के अर्ध-यादृच्छिक एकीकरण की ओर जाताहै। यह संपादित कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित जीन और विषमता के अतिवृद्धि में अनुवाद कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः उत्परिवर्तन और जीन इंटरैक्शन की भूमिका की जांच और विश्लेषण करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। एक दूसरा लाभ यह है कि वर्णित प्रणाली, एक साइट-विशिष्ट संपादन प्रणाली होने के नाते, सम्मिलन म्यूटेनेसिस35 के जोखिमों को समाप्त करती है।
दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर रणनीति उन कोशिकाओं के सटीक संवर्धन और ट्रैकिंग की अनुमति देती है जिन्हें दोनों एलील पर सफलतापूर्वक संपादित किया गया था, जिसमें एक एलील डब्ल्यूटी सीडीएनए को एकीकृत करता है और दूसरा एलील उत्परिवर्तित सीडीएनए अनुक्रमों को एकीकृत करता है। केवल एक रिपोर्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं या तो केवल मोनोएलील एकीकरण या एक ही फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ एचडीआर टेम्प्लेट के बाइएलील एकीकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। दोनों परिदृश्यों को केवल तभी सटीक रूप से अलग किया जा सकता है जब एकल सेल-व्युत्पन्न क्लोन का उत्पादन और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जाता है। हालांकि, एचएसपीसी के पास विट्रो में केवल सीमित प्रोलिफेरेटिव क्षमता होती है, और जब विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में रखा जाता है, तो एचएसपीसी अधिक परिपक्व संतान में अंतर करना शुरू कर देते हैं और अपनी आत्म-नवीकरण और एनग्राफमेंट क्षमता खो देते हैं। यह वांछित विषम उत्परिवर्तन को आश्रय देने वाले एकल-कोशिका क्लोनों का चयन और विस्तार करना असंभव बनाता है। विषम उत्परिवर्तन वाले कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रणनीति और संवर्धन का अनुप्रयोग विस्तारित इन विट्रो संस्कृति द्वारा प्रेरित समस्याओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है।
इस विशिष्ट उदाहरण में, यह सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया था कि एचएसपीसी को कुशलतापूर्वक इंजीनियर और क्रमबद्ध किया जा सकता है ताकि विषम सीएएलआरडीईएल / डब्ल्यूटी उत्परिवर्तन वाले एचएसपीसी की शुद्ध आबादी प्राप्त की जा सके।
हालांकि, यह प्रणाली इंजीनियरिंग विषम फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन तक सीमित नहीं है, बल्कि इसे अन्य उत्परिवर्तन प्रकारों को बनाने के लिए भी आसानी से अपनाया जा सकता है, जिसमें गलत समझ और बकवास उत्परिवर्तन शामिल हैं। विभिन्न फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ डब्ल्यूटी या उत्परिवर्तित अनुक्रमों वाले एएवी के विभिन्न संयोजनों को लागू करके, इस प्रणाली का उपयोग होमोजीगोस म्यूटेशन (दो आरएएवी के साथ एक साथ पारगमन दोनों उत्परिवर्ती सीडीएनए लेकिन अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) या यहां तक कि उत्परिवर्तन के सुधार के लिए भी किया जा सकता है (दो एएवी के साथ एक साथ पारगमन दोनों डब्ल्यूटी सीडीएनए लेकिन अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ले जाते हैं)। इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि यह रणनीति ऑन्कोजेनिक जीओएफ उत्परिवर्तन की शुरूआत तक सीमित नहीं है। वास्तव में, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग जीन नॉक-आउट, जीन रिप्लेसमेंट36,37, ट्रांसजेन्स के लक्षित नॉक-इन (यानी, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स) 38 और यहां तक कि रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन11,39 के सुधार सहित कई वैकल्पिक रणनीतियों के लिए किया जा सकता है।
कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ CRISPR / Cas9 और AAV6 के संयोजन की रणनीति को कई अन्य सेल प्रकारों में भी लागू दिखाया गया है जिसमें टी-सेल, प्लास्मोसाइटोइड डेंड्राइटिक कोशिकाएं, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, न्यूरोनल स्टेम सेल और वायुमार्ग स्टेम सेल 24,38,40,41,42,43,44 शामिल हैं। . इस रणनीति को बेहतर चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में प्रकाशित किया गया था कि सीएआर टी कोशिकाओं में टीजीएफबीआर 2 जीन का सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता नॉक-आउट दमनकारी टीजीएफ -β समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट45 में उनके कार्य को बहुत बढ़ाता है। इस तरह का दृष्टिकोण सीएआर को व्यक्त करने के लिए टी कोशिकाओं को इंजीनियर करने और टीजीएफबीआर 2 जीन को विशेष रूप से टीजीएफबीआर 2 जीन के दोनों एलील में सीएआर डालने के लिए टीजीएफबीआर 2 जीन को नॉक आउट करने के लिए एक-चरण प्रोटोकॉल प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण टी सेल रिसेप्टर अल्फा कॉन्स्टेंट (टीआरएसी) जीन46,47 में सीएआर को एकीकृत करके सार्वभौमिक सीएआर टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है।
प्रजनन क्षमता बढ़ाने और कोशिकाओं के कुशल संपादन की गारंटी देने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण विचारों का ध्यान रखा जाना चाहिए। कोशिकाओं के सफल संपादन को सुनिश्चित करने के लिए मुख्य महत्वपूर्ण बिंदु (i) एसजीआरएनए का चयन, (ii) एचडीआर टेम्पलेट का डिजाइन, और (iii) आरएएवी 6 उत्पादन में रहते हैं।
एक अच्छा प्रदर्शन करने वाले एसजीआरएनए का चयन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एलील्स की अधिकतम संख्या निर्धारित करेगा जिसमें एचडीआर टेम्पलेट को एकीकृत किया जा सकता है। कई सॉफ्टवेयर के कारण जो अब उपलब्ध हैं, उम्मीदवार एसजीआरएनए की खोज को सरल बनाया गया है। रुचि के क्षेत्र का चयन करके, सॉफ्टवेयर ऑन-टारगेट स्कोर और एक ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ एसजीआरएनए की एक श्रृंखला का प्रस्ताव कर सकता है जो क्रमशः वांछित स्थान और अवांछित लोकी पर संपादन की संभावनाओं को इंगित करता है। इन स्कोर की गणना पहले प्रकाशित स्कोरिंग मॉडल48,49 के आधार पर की जाती है। यद्यपि यह एक अच्छे प्रदर्शन वाले एसजीआरएनए का चयन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, एसजीआरएनए के प्रदर्शन की पुष्टि करने की आवश्यकता है क्योंकि सिलिको में इसका अनुमानित प्रदर्शन हमेशा विट्रो में एक कुशल एसजीआरएनए के अनुरूप नहीं होता है। इसलिए, सबसे अच्छा एसजीआरएनए खोजने की संभावना बढ़ाने के लिए कम से कम तीन एसजीआरएनए को डिजाइन और परीक्षण करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। एक बार जब एक सच्चे अच्छे प्रदर्शन वाले एसजीआरएनए की पहचान की जाती है, तो एचडीआर टेम्पलेट के डिजाइन के साथ आगे बढ़ने का सुझाव दिया जाता है।
एचडीआर टेम्पलेट डिजाइन करते समय सावधानियों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। बाएं और दाएं होमोलॉजी आर्म्स (एलएचए और आरएचए, क्रमशः) को क्रमशः एसजीआरएनए कट साइट के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में 400 बीपी का विस्तार करना चाहिए, क्योंकि छोटे एचए के परिणामस्वरूप एचडीआर आवृत्तियों में कमी आ सकती है। सीडीएनए का आकार जिसे एचडीआर के माध्यम से पेश किया जा सकता है, एएवी की पैकेजिंग क्षमताओं पर निर्भर है, जो लगभग 4.7 केबी है। एचडीआर टेम्पलेट (एलएचए, आरएचए, एसए, पॉलीए, प्रमोटर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अनुक्रम) के भीतर अनिवार्य कई तत्वों के कारण, उत्परिवर्तित या डब्ल्यूटी सीडीएनए के लिए शेष स्थान सीमित है। यह समस्याग्रस्त नहीं है यदि वांछित उत्परिवर्तन जीन के 3 ‘छोर के पास या समग्र लघु सीडीएस वाले जीन में स्थित है। हालांकि, ऐसे मामलों में जहां उत्परिवर्तन एक लंबे सीडीएस (एएवी के शेष पैकिंग स्थान से अधिक) के साथ जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइड (टीएसएस) के पास स्थित है, यह वर्णित दृष्टिकोण संभव नहीं हो सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, एक रणनीति जो एचडीआर टेम्पलेट को दो एएवी में विभाजित करने पर निर्भर करती है, हाल ही में बाक और सहयोगियों द्वारा विकसित की गई है। यह रणनीति एक बड़े जीन50 के अंतिम निर्बाध एकीकरण को प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग एचडीआर-मध्यस्थता एकीकरण पर निर्भर करती है।
वायरस की गुणवत्ता और इसके टिटर अतिरिक्त कारक हैं जो कोशिकाओं की सफल जीनोम इंजीनियरिंग को बना या तोड़ सकते हैं। इष्टतम उपज के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति में बनाए रखते हुए एचईके 293 टी को पूर्ण सामंजस्य तक न पहुंचने दें। आदर्श रूप से, एचईके 293 टी कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए जब 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाता है। इसके अतिरिक्त, एचईके 293 टी को लंबे समय तक सुसंस्कृत नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे वायरस का उत्पादन करने की उनकी क्षमता कम हो सकती है। नई एचईके 293 टी कोशिकाओं को 20 मार्गों के बाद पिघलाने की आवश्यकता होती है। प्रयोगों की दक्षता और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए उच्च वायरस टिटर्स प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। कम वायरल टिटर्स एचएसपीसी के पारगमन के लिए आवश्यक आरएएवी समाधान की बड़ी मात्रा में अनुवाद करेंगे। एक सामान्य नियम के रूप में, न्यूक्लियो संक्रमित कोशिकाओं में जोड़ा गया आरएएवी समाधान एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम की कुल मात्रा के 20% से अधिक नहीं होना चाहिए। एएवी समाधान की उच्च मात्रा से कोशिका मृत्यु, कम प्रसार और बिगड़ा हुआ पारगमन क्षमता बढ़ सकती है। कम वायरस टिटर्स के मामले में, इसलिए, वायरस को और अधिक केंद्रित करने की सिफारिश की जाती है।
सारांश में, यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त दोहरे फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ CRIPSR / Cas9 और rAAV6 दाता टेम्पलेट्स के एक साथ उपयोग के माध्यम से मानव एचएसपीसी को सटीक और कुशलता से हेरफेर करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण सामान्य हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल जीव विज्ञान और ल्यूकेमोजेनेसिस में उत्परिवर्तन के योगदान का अध्ययन करने में एक महान उपकरण साबित हुआ है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान निधि (एफडब्ल्यूएफ; संख्या पी 32783 और आई 5021) से एआर को अनुदान द्वारा समर्थित है, एआर को अतिरिक्त धन ऑस्ट्रियाई सोसाइटी ऑफ इंटरनल मेडिसिन (जोसेफ स्कोडा फैलोशिप), ऑस्ट्रियाई सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी एंड ऑन्कोलॉजी (ओईजीएचओ) द्वारा भी प्रदान किया जाता है; नैदानिक अनुसंधान अनुदान), और एमईएफओग्राज़। टीके ल्यूकेमिया एंड लिम्फोमा सोसाइटी के एक विशेष फेलो हैं।
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |