Nya strategier för att troget modellera somatiska mutationer i hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) är nödvändiga för att bättre studera hematopoetisk stamcellsbiologi och hematologiska maligniteter. Här beskrivs ett protokoll för att modellera heterozygota gain-of-function-mutationer i HSPCs genom att kombinera användningen av CRISPR/Cas9 och dubbel rAAV-givartransduktion.
Under hela sin livstid förvärvar hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) somatiska mutationer. Några av dessa mutationer förändrar HSPC-funktionella egenskaper såsom proliferation och differentiering, vilket främjar utvecklingen av hematologiska maligniteter. Effektiv och exakt genetisk manipulation av HSPCs krävs för att modellera, karakterisera och bättre förstå de funktionella konsekvenserna av återkommande somatiska mutationer. Mutationer kan ha en skadlig effekt på en gen och resultera i funktionsförlust (LOF) eller, i skarp kontrast, kan förbättra funktionen eller till och med leda till nya egenskaper hos en viss gen, kallad gain-of-function (GOF). Till skillnad från LOF-mutationer förekommer GOF-mutationer nästan uteslutande på ett heterozygot sätt. Nuvarande genomredigeringsprotokoll tillåter inte selektiv inriktning av enskilda alleler, vilket hindrar förmågan att modellera heterozygota GOF-mutationer. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll om hur man konstruerar heterozygota GOF-hotspot-mutationer i humana HSPCs genom att kombinera CRISPR / Cas9-medierad homologistyrd reparation och rekombinant AAV6-teknik för effektiv DNA-donatormallöverföring. Det är viktigt att denna strategi använder ett dubbelt fluorescerande reportersystem för att möjliggöra spårning och rening av framgångsrikt heterozygiskt redigerade HSPC: er. Denna strategi kan användas för att exakt undersöka hur GOF-mutationer påverkar HSPC-funktionen och deras progression mot hematologiska maligniteter.
Med utvecklingen av den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR) / Cas9-tekniken har ett nytt och extremt kraftfullt instrument lagts till i forskarnas verktygslåda. Denna teknik möjliggör exakt konstruktion av genomet och har visat sig vara extremt användbar inte bara för forskningsändamål (granskad i Hsu et al.1) utan har nyligen också framgångsrikt översatts till den kliniska miljön 2,3,4. CRISPR/Cas9-redigeringsstrategier förlitar sig på aktiviteten hos ett Cas9-protein och ett enguide-RNA (sgRNA)5,6,7. I värdcellen styrs Cas9-proteinet till en specifik plats i DNA som är komplementär till sgRNA-sekvensen och kommer att införa en DNA-dubbelsträngsbrytning (DSB). När en DSB har genererats finns det två huvudsakliga och konkurrerande reparationsmekanismer som kan uppstå: icke-homolog ändfogning (NHEJ) och homologistyrd reparation (HDR). NHEJ är en felbenägen, övervägande använd reparationsmekanism som leder till insättningar och raderingar (indels), medan HDR, genom att använda systerkromatiden som en reparationsmall, är mycket exakt men begränsad till S- eller G2-fasen i cellcykeln8. Inom genomteknik kan HDR användas för riktad modifiering av DNA genom att tillhandahålla en donatormall som flankeras av homologiarmar som är identiska med båda DNA-ändarna av den Cas9-inducerade DSB (figur 1). Den typ av givarmall som används för HDR kan i hög grad påverka redigeringseffektiviteten. För genteknik i humana HSPC: er har adenoassocierat virus serotyp 6 (AAV6) nyligen beskrivits som ett utmärkt medel för leverans av enkelsträngade DNA-mallar 9,10.
CRISPR/Cas9 genomteknik kan användas terapeutiskt för att korrigera skadliga mutationer11 men kan också användas för att införa patogena mutationer i DNA för att modellera cancerutveckling12. Blodcancer, såsom leukemi, utvecklas via sekventiell förvärv av somatiska mutationer i friska HSPCs13,14. Tidiga genetiska händelser leder till en klonal proliferativ fördel, vilket resulterar i klonal hematopoies med obestämd potential (CHIP)15,16. Ytterligare förvärv av mutationer kommer så småningom att leda till leukemisk omvandling och utveckling av sjukdomen. Somatiska mutationer finns i gener som styr självförnyelse, överlevnad, spridning och differentiering17.
Att introducera individuella mutationer via genomteknik i friska HSPCs möjliggör exakt modellering av denna stegvisa leukemogena process. Det begränsade antalet återkommande mutationer som finns i myeloida neoplasmer såsom akut myeloisk leukemi (AML)18,19 gör denna sjukdom särskilt mottaglig för att rekapituleras med hjälp av genomtekniska verktyg.
Somatiska mutationer kan uppstå på endast en allel (monoalleliska/heterozygota mutationer) eller på båda allelerna (bialleliska/homozygota mutationer) och kan ha djupgående effekter på genens funktion, vilket kan orsaka en funktionsförlust (LOF) eller en funktionsförstärkning (GOF). LOF-mutationer leder till en reducerad (om en allel påverkas) eller fullständig (om båda allelerna påverkas) LOF av genen, medan GOF-mutationer leder till en ökad aktivering eller ny funktion av genen. GOF-mutationer är vanligtvis heterozygota20.
Viktigt är att zygositeten (hetero- vs. homozygot) har stora konsekvenser för försöket att troget modellera en mutation; därför är den riktade manipulationen av endast en allel av en gen nödvändig för att konstruera heterozygota hotspot GOF-mutationer. Felbenägen NHEJ leder till indels av olika längder21 som kan leda till varierande, oförutsägbara biologiska konsekvenser. Men eftersom NHEJ är det dominerande reparationsprogrammet som används av celler efter introduktionen av en DSB, tillåter de flesta CRISPR / Cas9-plattformar som för närvarande används för att manipulera HSPC: er inte exakt att förutsäga det genetiska resultatet22,23. Däremot möjliggör införandet av en CRISPR/Cas9-medierad dubbelsträngsbrytning (DSB), i kombination med användning av rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) vektorbaserade DNA-givarmallar för genomteknik via HDR, den allelspecifika införandet av mutationer i humana HSPCs11,24. Samtidig integration av en mutant och en vildtypssekvens (WT) i kombination med distinkta fluorescerande reportrar på de enskilda allelerna kan utföras för att välja för en heterozygot genotyp (figur 2). Denna strategi kan utnyttjas som ett kraftfullt verktyg för att exakt karakterisera effekterna av återkommande, leukemiska, heterozygota GOF-hotspot-mutationer på HSPC-funktion, sjukdomsinitiering och progression.
I den här artikeln tillhandahålls ett detaljerat protokoll för effektiv konstruktion av återkommande muterade heterozygota GOF-mutationer i primära humana HSPC. Denna strategi kombinerar användningen av CRISPR/Cas9 och en dubbel AAV6-transduktion för att tillhandahålla WT- och mutant-DNA-donatormallar för den prospektiva genereringen av den heterozygota GOF-mutationen. Som ett exempel kommer konstruktion av de återkommande typ 1-mutationerna (52 bp-deletion) i calreticulin (CALR) -genen att visas25. Den heterozygota GOF-mutationen i exon 9 av CALR finns återkommande i myeloproliferativa störningar såsom essentiell trombocytemi (ET) och primär myelofibros (PMF)26. CALR är ett endoplasmatiskt retikulumboende protein som främst har en kvalitetskontrollfunktion i vikningsprocessen av nyligen syntetiserade proteiner. Dess struktur kan delas in i tre huvuddomäner: en amino (N) -terminal domän och en prolinrik P-domän, som är involverade i proteinets chaperonfunktion, och en C-domän, som är involverad i kalciumlagring och reglering27,28. CARR-mutationer orsakar en +1 frameshift, vilket leder till transkription av en ny förlängd C-terminal ände och förlust av endoplasmatisk retikulum (ER)-retentionssignal (KDEL). Mutant CALR har visat sig binda trombopoietinreceptorn (TPO), vilket leder till TPO-oberoende signalering med ökad proliferation29.
Bild 1: NHEJ och HDR-reparation. Förenklad schematisk representation av NHEJ- och HDR-reparationsmekanismer efter införandet av ett dubbelsträngat brott i DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk översikt över biallelic HDR-redigeringsstrategi. Schematisk representation som visar integrationen av givarmallarna i de riktade allelerna följt av deras översättning till fungerande mRNA. De orange prickade rutorna anger de regioner som motsvarar den vänstra homologiarmen (LHA) och den högra homologiarmen (RHA). Den ideala storleken på HAs är 400 bp vardera. Den gröna prickade rutan representerar den region som motsvarar SA-sekvensen. Storleken på SA är 150 bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den effektiva och exakta genetiska manipulationen av humana primära HSPC representerar ett utmärkt tillfälle att utforska och förstå de processer som påverkar normal hematopoies, och viktigast av allt, den leukemiska omvandlingen av hematopoetiska celler.
I detta protokoll beskrivs en effektiv strategi för att konstruera mänskliga HSPC för att uttrycka återkommande heterozygota GOF-mutationer. Denna procedur utnyttjade CRISPR / Cas9-tekniken och rAAV6-vektorer som givare för DNA-mallar för att exakt infoga WT- och mutanta DNA-sekvenser i deras endogena genloci. Genom att koppla de konstruerade cDNA:erna (WT och mutant) med separerade fluorescerande reporterproteiner möjliggörs anrikning och spårning av celler med ett definitivt heterozygot tillstånd.
Denna strategi har flera fördelar jämfört med de ofta använda lentivirala (LV)-baserade metoderna. En stor fördel är att det CRISPR/Cas9-baserade systemet möjliggör exakt redigering i de endogena loci, vilket resulterar i bevarande av de endogena promotorerna och regleringselementen. Detta leder till homogenitet i uttrycket av den redigerade genen i cellerna, ett mål som knappast kan uppnås när en LV-baserad metod används. Genöverföring med LV-vektorer leder till semi-slumpmässig integration av genen med preferens för transkriptionellt aktiva platser34. Detta kan översättas till överuttryck av den överförda genen och heterogenitet mellan de redigerade cellerna, vilket så småningom resulterar i svårigheter att undersöka och analysera rollen av mutationer och geninteraktioner. En andra fördel är att det beskrivna systemet, som är ett platsspecifikt redigeringssystem, eliminerar riskerna för införande av mutagenes35.
Den dubbla fluorescerande reporterstrategin möjliggör exakt anrikning och spårning av celler som framgångsrikt redigerades på båda allelerna, med en allel som integrerar WT cDNA och den andra allelen som integrerar de muterade cDNA-sekvenserna. Celler som bara uttrycker en enda reporter representerar antingen endast monoallelisk integration eller biallelisk integration av HDR-mallar med samma fluorescerande reporter. Båda scenarierna kan endast särskiljas exakt om kloner med en cell produceras och analyseras individuellt. HSPC har dock endast begränsad spridningskapacitet in vitro, och när de hålls i odling under längre perioder börjar HSPC: er differentiera sig till mer mogen avkomma och förlorar sin självförnyelse- och engraftmentkapacitet. Detta gör det omöjligt att välja och expandera encelliga kloner som hyser den önskade heterozygota mutationen. Tillämpningen av den dubbla fluorescerande proteinstrategin och anrikning genom flödescytometri för celler som bär den heterozygota mutationen möjliggör att kringgå de problem som induceras av utökad in vitro-odling .
I detta specifika exempel visades det framgångsrikt att HSPC: er effektivt kunde konstrueras och sorteras för att erhålla rena populationer av HSPC: er som bär den heterozygota CALRDEL / WT-mutationen.
Detta system är dock inte begränsat till att konstruera heterozygota ramförskjutningsmutationer utan kan också lätt antas för att skapa andra mutationstyper, inklusive missense och nonsensmutationer. Genom att tillämpa olika kombinationer av AAV som innehåller WT eller muterade sekvenser med olika fluorescerande reporterproteiner kan detta system också användas för införande av homozygota mutationer (samtidig transduktion med två rAAV som båda bär mutant cDNA men olika fluorescerande reportrar) eller till och med korrigering av mutationer (samtidig transduktion med två AAV som båda bär WT cDNA men olika fluorescerande reportrar). Dessutom är det viktigt att nämna att denna strategi inte är begränsad till införandet av onkogena GOF-mutationer. Faktum är att det beskrivna protokollet kan användas för flera alternativa strategier inklusive genutslag, genersättning 36,37, riktad knock-in av transgener (dvs. chimära antigenreceptorer)38 och till och med för korrigering av sjukdomsframkallande mutationer 11,39.
Strategin att kombinera CRISPR/Cas9 och AAV6 med flera fluorescerande rapportörer har också visat sig vara tillämplig i många andra celltyper inklusive T-celler, plasmacytoiddendritiska celler, inducerade pluripotenta stamceller, neuronala stamceller och luftvägsstamceller 24,38,40,41,42,43,44 . Denna strategi kan implementeras för produktion av överlägsna chimära antigenreceptorer (CAR) T-celler. Till exempel publicerades det nyligen att CRISPR/Cas9-medierad knock-out av TGFBR2-genen i CAR T-celler kraftigt ökar deras funktion i den suppressiva TGF-β rika tumörmikromiljön45. Ett sådant tillvägagångssätt skulle kunna ge ett enstegsprotokoll för att både konstruera T-cellerna för att uttrycka CAR och för att slå ut TGFBR2-genen per plats som specifikt sätter in CAR i båda allelerna i TGFBR2-genen. Dessutom kan detta tillvägagångssätt också vara användbart för att generera universella CAR T-celler genom att integrera CAR i T-cellreceptorns alfakonstanta (TRAC) gen46,47.
För att öka reproducerbarheten och för att garantera effektiv redigering av cellerna måste några viktiga överväganden tas om hand. De viktigaste kritiska punkterna för att säkerställa framgångsrik redigering av cellerna ligger i (i) valet av sgRNA, (ii) utformningen av HDR-mallen och (iii) rAAV6-produktionen.
Valet av ett högpresterande sgRNA är avgörande eftersom det kommer att avgöra det maximala antalet alleler där HDR-mallen kan integreras. På grund av många program som nu finns tillgängliga har sökandet efter kandidat-sgRNA förenklats. Genom att välja den intressanta regionen kan programvaran föreslå en serie sgRNA med en målpoäng och en off-target-poäng som indikerar chanserna för redigering vid önskad locus respektive oönskade loci. Dessa poäng beräknas baserat på tidigare publicerade poängmodeller48,49. Även om detta är en bra utgångspunkt för att välja ett högpresterande sgRNA, måste sgRNA: s prestanda bekräftas eftersom dess förutsagda prestanda i silico inte alltid motsvarar ett effektivt sgRNA in vitro. Därför rekommenderas det starkt att designa och testa minst tre sgRNA för att öka chanserna att hitta det bästa sgRNA. När ett riktigt bra presterande sgRNA har identifierats föreslås det att du fortsätter med utformningen av HDR-mallen.
Försiktighetsåtgärder bör beaktas vid utformningen av HDR-mallen. De vänstra och högra homologiarmarna (LHA respektive RHA) bör var och en sträcka sig 400 bp uppströms respektive nedströms om sgRNA-skärplatsen, eftersom kortare HA kan resultera i minskade HDR-frekvenser. Storleken på cDNA som kan introduceras via HDR är beroende av förpackningskapaciteten hos AAV: er, vilket är ungefär 4,7 kb. På grund av de många element som är obligatoriska i HDR-mallen (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor och fluorescerande reportersekvens) är det återstående utrymmet för det muterade eller WT cDNA begränsat. Detta är oproblematiskt om den önskade mutationen ligger nära 3′-änden av en gen eller i gener med en övergripande kort CDS. I de fall där mutationen ligger nära den transkriptionella startsidan (TSS) för generna med en lång CDS (som överskrider det återstående förpackningsutrymmet för AAV), kanske detta beskrivna tillvägagångssätt inte är genomförbart. För att kringgå detta problem har en strategi som bygger på att dela upp HDR-mallen i två AAV: er nyligen utvecklats av Bak och kollegor. Denna strategi bygger på två separata HDR-medierade integrationer för att få den slutliga sömlösa integrationen av en stor gen50.
Kvaliteten på viruset och dess titer är ytterligare faktorer som kan göra eller bryta cellernas framgångsrika genomteknik. För ett optimalt utbyte är det viktigt att inte låta HEK293T nå full sammanflöde samtidigt som den bibehålls i kulturen. Helst bör HEK293T-cellerna delas när 70%-80% sammanflöde uppnås. Dessutom bör HEK293T inte odlas under långa perioder eftersom detta kan minska deras förmåga att producera virus. Nya HEK293T-celler måste tinas efter 20 passager. Att erhålla höga virustitrar är viktigt för att öka experimentens effektivitet och reproducerbarhet. Låga virala titrar kommer att översättas till stora volymer rAAV-lösning som krävs för transduktion av HSPC: erna. Som en allmän regel bör rAAV-lösningen som tillsätts till de nukleofekterade cellerna inte överstiga 20% av den totala volymen av HSPC-retentionsmediet. Högre volymer av AAV-lösning kan leda till ökad celldöd, lägre spridning och nedsatt transduktionseffektivitet. När det gäller låga virustitrar rekommenderas det därför att ytterligare koncentrera viruset.
Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll ett reproducerbart tillvägagångssätt för att manipulera mänskliga HSPC: er exakt och effektivt genom samtidig användning av CRIPSR / Cas9- och rAAV6-givarmallar med ytterligare dubbla fluorescerande reportrar. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara ett bra verktyg för att studera normal hematopoetisk stamcellsbiologi och de bidrag som mutationer ger till leukemogenes.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från den österrikiska vetenskapsfonden (FWF; nummer P32783 och I5021) till A.R. Ytterligare finansiering till A.R. tillhandahålls också av Austrian Society of Internal Medicine (Joseph Skoda Fellowship), Austrian Society of Hematology and Oncology (OeGHO; Clinical Research Grant) och MEFOgraz. T.K. är en särskild stipendiat i Leukemia & Lymphoma Society.
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |