Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64558
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,3
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Summary

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

Abstract

במהלך חייהם, תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) רוכשים מוטציות סומטיות. חלק ממוטציות אלה משנות תכונות תפקודיות של HSPC כגון התפשטות והתמיינות, ובכך מקדמות התפתחות של ממאירויות המטולוגיות. נדרשת מניפולציה גנטית יעילה ומדויקת של HSPCs כדי למדל, לאפיין ולהבין טוב יותר את ההשלכות התפקודיות של מוטציות סומטיות חוזרות. מוטציות יכולות להשפיע לרעה על גן ולגרום לאובדן תפקוד (LOF) או, בניגוד מוחלט, עשויות לשפר את התפקוד או אפילו להוביל למאפיינים חדשים של גן מסוים, המכונים רווח-תפקוד (GOF). בניגוד למוטציות LOF, מוטציות GOF מתרחשות כמעט אך ורק באופן הטרוזיגוטי. הפרוטוקולים הנוכחיים לעריכת גנום אינם מאפשרים מיקוד סלקטיבי של אללים בודדים, מה שפוגע ביכולת ליצור מודלים של מוטציות GOF הטרוזיגוטיות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כיצד להנדס מוטציות של נקודות חמות הטרוזיגוטיות GOF ב-HSPCs אנושיים על ידי שילוב של תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך CRISPR/Cas9 וטכנולוגיית AAV6 רקומביננטית להעברה יעילה של תבנית תורם DNA. חשוב לציין שאסטרטגיה זו עושה שימוש במערכת דיווח פלואורסצנטית כפולה כדי לאפשר מעקב וטיהור של HSPCs שעברו עריכה הטרוזיגית מוצלחת. ניתן להשתמש באסטרטגיה זו כדי לחקור במדויק כיצד מוטציות GOF משפיעות על תפקוד HSPC והתקדמותן לעבר ממאירויות המטולוגיות.

Introduction

עם התפתחותה של טכנולוגיית החזרות הפלינדרומיות הקצרות (CRISPR)/Cas9, נוסף מכשיר חדש וחזק במיוחד לארגז הכלים של מדענים. טכנולוגיה זו מאפשרת הנדסה מדויקת של הגנום והוכיחה את עצמה כשימושית ביותר לא רק למטרות מחקר (שנסקרו ב- Hsu et al.1) אלא לאחרונה גם תורגמה בהצלחה לסביבה הקלינית 2,3,4. אסטרטגיות העריכה של CRISPR/Cas9 מסתמכות על הפעילות של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNA)5,6,7. בתא המארח, החלבון Cas9 מונחה לאתר מסוים בדנ"א המשלים את רצף ה-sgRNA ויציג שבירת דנ"א דו-גדילית (DSB). ברגע שנוצר DSB, ישנם שני מנגנוני תיקון עיקריים ומתחרים שיכולים להתרחש: צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מנגנון תיקון מועד לשגיאות, המשמש בעיקר להחדרות ומחיקות (indels), ואילו HDR, על ידי שימוש בכרומטיד האחות כתבנית תיקון, הוא מדויק מאוד אך מוגבל לשלב S או G2 של מחזור התא8. בהנדסת גנום, HDR יכול לשמש לשינוי ממוקד של דנ"א על-ידי מתן תבנית תורם שלצדה זרועות הומולוגיות זהות לשני קצוות הדנ"א של ה-DSB המושרה על-ידי Cas9 (איור 1). סוג התבנית התורם המשמשת ל-HDR יכול להשפיע מאוד על יעילות העריכה. עבור הנדסה גנטית ב-HSPCs אנושיים, סרוטיפ 6 (AAV6) הקשור לאדנו תואר לאחרונה ככלי מצוין להעברת תבניות דנ"א חד-גדיליות 9,10.

ניתן להשתמש בהנדסת גנום של CRISPR/Cas9 באופן טיפולי כדי לתקן מוטציות מחיקה11, אך ניתן להשתמש בה גם כדי להכניס מוטציות פתוגניות לדנ"א כדי ליצור מודל להתפתחות סרטן12. סרטן הדם, כגון לוקמיה, מתפתח באמצעות רכישה רציפה של מוטציות סומטיות ב- HSPCsבריאים 13,14. אירועים גנטיים מוקדמים מובילים ליתרון שגשוג קלונלי, וכתוצאה מכך להמטופוזיס קלונלי של פוטנציאל לא מוגדר (CHIP)15,16. רכישה נוספת של מוטציות תוביל בסופו של דבר לשינוי לוקמי ולהתפתחות המחלה. מוטציות סומטיות יכולות להימצא בגנים השולטים בהתחדשות עצמית, הישרדות, שגשוג והתמיינות17.

החדרת מוטציות בודדות באמצעות הנדסת גנום לתוך HSPCs בריאים מאפשרת מידול מדויק של התהליך הלוקמוגני הזה. המספר המוגבל של מוטציות חוזרות שנמצאו בגידולים מיאלואידים כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)18,19 הופך את המחלה לנוחה במיוחד לשחזור באמצעות כלים הנדסיים גנומיים.

מוטציות סומטיות יכולות להופיע על אלל אחד בלבד (מוטציות מונואליות/הטרוזיגוטיות) או על שני האללים (מוטציות ביאליות/הומוזיגוטיות) ויכולות להיות להן השפעות עמוקות על תפקוד הגן, מה שעלול לגרום לאובדן תפקוד (LOF) או לרווח תפקוד (GOF). מוטציות LOF מובילות ל-LOF מופחת (אם אלל אחד מושפע) או שלם (אם שני האללים מושפעים) LOF של הגן, בעוד שמוטציות GOF מובילות להפעלה מוגברת או לתפקוד חדש של הגן. מוטציות GOF הן בדרך כלל הטרוזיגוטיות20.

חשוב לציין כי לזיגוסיות (הטרו- לעומת הומוזיגוטית) יש השלכות משמעותיות על הניסיון ליצור מודל נאמן למוטציה; לכן, המניפולציה הממוקדת של אלל אחד בלבד של גן נחוצה כדי להנדס מוטציות GOF של נקודה חמה הטרוזיגוטית. NHEJ מועד לשגיאות מוביל לאינדלים באורכים שונים21 שיכולים להוביל לתוצאות ביולוגיות משתנות ובלתי צפויות. עם זאת, מכיוון ש-NHEJ היא תוכנית התיקון השלטת בה משתמשים תאים לאחר הצגת DSB, רוב פלטפורמות הקריספר/Cas9 המשמשות כיום למניפולציה של HSPCs אינן מאפשרות לחזות במדויק את התוצאה הגנטית22,23. לעומת זאת, ההקדמה של שבר דו-גדילי בתיווך CRISPR/Cas9 (DSBs), בשילוב עם שימוש בתבניות של תורמי דנ"א מבוססי דנ"א רקומביננטי הקשור לאדנו (rAAV) להנדסת גנום באמצעות HDR, מאפשרת החדרה ספציפית לאלל של מוטציות ב-HSPCs אנושיים11,24. ניתן לבצע אינטגרציה סימולטנית של מוטציה ורצף מסוג פראי (WT) בשילוב עם כתבים פלואורסצנטיים נפרדים על האללים הבודדים כדי לבחור גנוטיפ הטרוזיגוטי (איור 2). ניתן למנף אסטרטגיה זו ככלי רב עוצמה כדי לאפיין במדויק את ההשפעות של מוטציות חוזרות ונשנות, לוקמיות והטרוזיגוטיות של נקודה חמה GOF על תפקוד HSPC, התחלת מחלות והתקדמותן.

במאמר זה, פרוטוקול מפורט להנדסה יעילה של מוטציות GOF הטרוזיגוטיות שעברו מוטציה חוזרת ונשנית ב- HSPCs אנושיים ראשוניים מסופק. אסטרטגיה זו משלבת את השימוש ב-CRISPR/Cas9 ובהתמרת AAV6 כפולה כדי לספק תבניות של תורמי WT ו-DNA מוטנטיים ליצירה פוטנציאלית של מוטציית GOF הטרוזיגוטית. לדוגמה, הנדסה של מוטציות חוזרות מסוג 1 (מחיקה של 52 bp) בגן calreticulin (CALR) תוצג25. מוטציית GOF הטרוזיגוטית באקסון 9 של CALR נמצאת שוב ושוב בהפרעות מיאלופרוליפרטיביות כגון תרומבוציטמיה חיונית (ET) ומיאלופיברוזיס ראשונית (PMF)26. CALR הוא חלבון תושב רשתית אנדופלסמית שיש לו בעיקר פונקציית בקרת איכות בתהליך הקיפול של חלבונים מסונתזים חדשים. ניתן לחלק את המבנה שלו לשלושה תחומים עיקריים: תחום אמינו (N) ותחום P עשיר בפרולין, המעורבים בתפקוד המלווה של החלבון, ותחום C, המעורב באחסון סידן ובוויסות27,28. מוטציות CALR גורמות להסטת מסגרת של +1, מה שמוביל לתעתוק של קצה C-terminal מורחב חדש ולאובדן אות שימור הרשתית האנדופלסמית (ER) (KDEL). הודגם כי CALR מוטנטי קושר את קולטן הטרומבופואטין (TPO), ובכך מוביל לאיתות שאינו תלוי ב-TPO עם שגשוג מוגבר29.

Figure 1
איור 1: תיקון NHEJ ו-HDR. ייצוג סכמטי פשוט יותר של מנגנוני תיקון NHEJ ו- HDR לאחר הכנסת שבר דו-גדילי בדנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סקירה סכמטית של אסטרטגיית עריכת HDR ביאלית. ייצוג סכמטי המציג את האינטגרציה של תבניות התורמים באללים הממוקדים ולאחר מכן את תרגומם ל-mRNA מתפקד. התיבות המנוקדות הכתומות מציינות את האזורים המתאימים לזרוע ההומולוגיה השמאלית (LHA) ולזרוע ההומולוגיה הימנית (RHA). הגודל האידיאלי של HAs הוא 400 bp כל אחד. התיבה המנוקדת הירוקה מייצגת את האזור המתאים לרצף SA. הגודל של SA הוא 150 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

פרוטוקול זה דורש שימוש ב-CD34+ HSPCs בריאים שמקורם בתורמים ודורש אישור אתי מוועדות הביקורת המוסדיות המקומיות (IRB) והסכמה מדעת חתומה. CD34+ HSPCs המשמשים בפרוטוקול זה בודדו מדם טבורי (UCB) של לידות טווח (>34 שבועות של הריון). הסכמה מדעת התקבלה מהאימהות לפני הלידה, והתקבל אישור אתי לאיסוף UCB (אישור IRB: 31-322 ex 18/19) מהאוניברסיטה הרפואית של גראץ. רשימה מלאה של חומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. תכנון sgRNA והערכת יעילות החיתוך

  1. חפש את מיקום המוטציה הרצויה ואת התמליל הנכון בכלי מסד נתונים מקוון (למשל, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. בחר sgRNA הסמוך למוטציה (מיקוד אקסוני) או באינטרון הקודם (מיקוד אינטרוני) באמצעות כלי תכנון sgRNA. בפרוטוקול זה, הכלי המקוון של Benchling משמש. ראה את טבלת החומרים לקבלת רשימה של כלים מקוונים אפשריים לתכנון sgRNA.
  3. בחר באפשרות + (יצירה) > רצף DNA > ייבוא רצפי דנ"א > ייבוא ממסדי נתונים. הזן את הגן הרצוי, לדוגמה, CALR ובחר אדם כמין > חיפוש > בחר את התעתיק הנכון (לדוגמה, CALR-201 -ENST00000316448) > ייבוא. בחר את אזור העניין שבו יש להציג את הפסקת ה- DS (לדוגמה, intron 7).
  4. בחר באפשרות CRISPR בצד ימין של המסך ובחר עיצוב וניתוח של קווי עזר. בחר קו עזר יחיד, שמור על אורך מדריך של 20 סיביות לשנייה ורצף PAM לעריכה עם SpCas9 (NGG).
  5. בחר מדריך עם ניקוד גבוה על היעד (סיכוי גבוה לעריכה במקום הרצוי) וציון גבוה מחוץ למטרה (סיכוי נמוך לעריכה במיקום לא רצוי). בחר לפחות שלושה מדריכים לבדיקה על מנת למצוא את ה- sgRNA בעל הביצועים הטובים ביותר. הזמינו את ה-sgRNA כ-sgRNA סינתטי שעבר שינוי כימי מספק מסחרי.
    הערה: מומלץ בשלב זה להזמין כמות קטנה של sgRNAs סינתטיים עבור המסך הראשוני. לאחר שזוהה sgRNA בעל ביצועים טובים, המשך בסדר גדול יותר של ה- sgRNA שנבחר.
  6. הפשרה 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCs. העבירו את התאים ל-10 מ"ל של RPMI1640 שחומם מראש בתוספת 1% אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין/סטרפטומיצין).
    הערה: יש להשתמש בתקליטורי CD34+ HSPCs עם טוהר >90% כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר והניתנות לשחזור ביותר.
  7. צנטריפוגה ב-350 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. לספור את התאים עם המוציטומטר ולהשעות את התאים במדיום SFEM II בתוספת 0.2% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), 100 ng/mL גורם תאי גזע (SCF), 100 ng/mL דמוי FMS טירוזין קינאז 3 ליגנד (FLT3L), 100 ng/mL אינטרלוקין-6 (IL-6), 35 nM UM171, ו-0.75 μM StemRegenin1 (SR1) לריכוז של 2.5 x 105 תאים /מ"ל. דגירה ב 37 °C / 5% CO2 במשך 48 שעות - 72 שעות.
    הערה: המדיום השלם ייקרא מעתה והלאה מדיום השמירה של HSPC.
  8. לאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל ולספור את התאים. בדוק את כדאיות התא על-ידי אי-הכללה של טריפאן כחול.
    1. לפני שתתחיל, הפעל את מערכת ההעברה ובחר את האפשרות עבור cuvettes. בחר את התוכנית המתאימה ואת פתרון הגרעין עבור HSPCs (ראה טבלת חומרים). בין 2 x 105 ל 5 x 106 תאים ניתן nucleofected אחד 100 μL cuvette. הקדישו מספר קטן של תאים (לדוגמה, 1 x 10 5-2 x 105) כדי לשמור בתרבית במשך 48 שעות כדי לשמש כבקרת WT.
  9. הכן את קומפלקס RNP. בצינור של 1.5 מ"ל, הוסיפו 15 מיקרוגרם של Cas9 ו-8 מיקרוגרם של sgRNA (יחס טוחן 1:2.5) ודגרו ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חימום.
  10. בזמן שקומפלקס ה-RNP מדגר, סובבו את התאים ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות והשליכו את הסופר-נטנט באמצעות פיפטה. להשעות את התאים ב 100 μL של תמיסת נוקלאופקציה.
  11. מערבבים את התאים עם קומפלקס RNP ומעבירים לתוך הקובט. טפחו בעדינות על הקובט כדי להסיר את בועות האוויר שעלולות להיווצר במהלך ההעברה.
  12. הכנס את cuvette לתוך המחזיק של מערכת transfection ו electroporate את התאים עם תוכנית DZ-100.
  13. מיד לאחר האלקטרופורציה, יש להוסיף 400 μL של מדיום שימור HSPC שחומם מראש ללא P/S.
  14. העבר את התאים עם פיפטה העברה עדינה לצלחת תרבית המכילה אמצעי שימור HSPC מחומם מראש ללא P/S. בהתאם למספר התא, השתמש בצלחת תרבית מתאימה (צלחת 24, 12 או 6 בארות) כדי להגיע לצפיפות שבין 0.25 x 10 6 ו 1 x 106 תאים / מ"ל.
  15. מעבירים את הצלחת לחממה ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2. לדגור את התאים nucleofected במשך 6-8 שעות.
  16. לאחר 6-8 שעות, הסר את המדיום הישן והחלף במדיום שימור HSPC טרי שחומם מראש בתוספת P/S. השהה את התאים בריכוז שבין 2.5 x 10 5 ל- 5 x 105 והעבר לצלחת תרבית תאים (צלחת 24, 12 או 6 בארות). דגירה של התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37°C/5% CO2.
  17. קציר 2 x 105 תאים וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות. לפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F).
  18. השליכו את הסופר-נאטנט והשאילו את התאים ב-1 מ"ל של 1x DPBS בצינור של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-350 x גרם ב-RT למשך 5 דקות.
  19. השליכו את הסופר-נטנט והשעו את התאים בתמיסת מיצוי DNA בנפח 50 μL. וורטקס במשך 15 שניות.
  20. דגירה במשך 6 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. מערבולת במשך 15 שניות ודגירה במשך 2 דקות ב 98 מעלות צלזיוס.
  21. הגבר את האזור של DSB על ידי PCR באמצעות פריימרים המייצרים אמפליקון של כ 400-600 bp עם DSB במרכז. השתמש 0.5-1 μL של דנ"א שחולץ עבור תגובת PCR.
    הערה: בשל הרכב תמיסת מיצוי הדנ"א, לא ניתן לכמת במדויק את ריכוזי הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטריה.
  22. הפעל את מוצר ה- PCR עם סולם DNA על ג'ל אגרוז של 1.5% ב- 100 וולט למשך 45-60 דקות. הניחו את הג'ל על אור כחול או על טרנסילומינטור UV.
  23. חלצו את רצועת הדנ"א בגודל הנכון מהג'ל באמצעות ערכה מסחרית זמינה בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
  24. רצף את הדוגמאות על ידי ריצוף סנגר באמצעות פריימר קדימה או פריימר הפוך מה- PCR. עבור מוצרי PCR באורך של 400-600 bp, נדרשים 75 ננוגרם של דנ"א לריצוף בריכוז של 5 ננוגרם/מ"ל בנפח כולל של 15 μL.
  25. נתח את יעילות העריכה של sgRNAs על ידי העלאת קבצי הרצף לתוכנית שנועדה לחשב את יעילות העריכה על ידי זיהוי ההכנסה והמחיקות המיוצרות על ידי sgRNA. בחר את ה- sgRNA בעל הביצועים הטובים ביותר להמשך.
    הערה: כלים מקוונים ייעודיים מפורטים בטבלת החומרים. ניתוח זה דורש את קבצי .ab1 של HSPCs transfected ו- WT, רצף sgRNA ורצף PAM.

2. תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בנייה וקטורית

  1. עיצוב תבנית HDR
    הערה: יש לעצב שתי תבניות HDR: תבנית לרצף WT ותבנית לרצף שעבר מוטציה.
    1. ייבא את הרצף הגנומי ואת רצף הקידוד (CDS) של הגן הרצוי לתוכנה מתאימה לשיבוט מולקולרי (כלים ייעודיים ניתן למצוא בטבלת החומרים). מקובץ הרצף הגנומי, תכנן את זרוע ההומולוגיה השמאלית (HA) על ידי בחירה אידיאלית של 400 bp בקצה 5' של ה- DSB. הדבק רצף זה בקובץ חדש.
    2. אם אינטרון ממוקד עם sgRNA, יש לכלול רצף של מקבל שחבור (SA). בחר את 150 bp האחרונים של intron היעד ולהדביק אותו לאחר HA שמאלה. אם האקסון מכוון ישירות, רצף זה אינו הכרחי (איור 3).
    3. מקובץ ה- CDS, בחר את ה- cDNA המעניין. במקרה שרצף אקסוני ממוקד, ודא שה- cDNA מתחיל מיד במורד הזרם של אתר DSB וכולל את כל האקסונים הבאים של הגן המעניין, כמו גם את קודון העצירה. במקרה שאינטרון ממוקד, ודא שה-cDNA מתחיל בקודון הראשון של האקסון הבא. קודון-אופטימיזציה של ה-cDNA והכנסתו לאחר רצף ה-SA. השתמש בכלים מקוונים ייעודיים למטרה זו (טבלת חומרים).
    4. הכנס אות פוליאדנילציה 3' (PolyA) לאחר cDNA של עניין (למשל, SV40 או bGH) (טבלה 1). בעקבות הפוליA, הכנס רצף מקדם (למשל, מיקוד הטחול היוצר וירוס [SFFV] או פוליוביקוויטין C [UBC], טבלה 1) עבור החלבון הפלואורסצנטי.
    5. הכנס את הרצף עבור החלבון הפלואורסצנטי (כלומר, GFP, BFP או mCherry). הכנס אות PolyA שני אך שונה.
      הערה: הכנסת רצף PolyA שונה תמנע בעיות כגון רקומבינציה חיידקית של הפלסמיד או בעיות ביישור רצף בגלל שני רצפים זהים בתבנית.
    6. מקובץ הרצף הגנומי, עצב את ה-HA הנכון על-ידי בחירה אידיאלית של 400 bp בקצה 3' של ה-DSB. הכנס רצף זה לאחר ה- PolyA השני.
    7. צור עותק של התבנית כולה ושנה את ה- cDNA של העניין כך שיכיל את רצף המוטציה הרצויה.
    8. החליפו את החלבון הפלואורסצנטי בחלבון פלואורסצנטי אחר. לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-GFP עבור תבנית WT, החלף אותה ב-BFP או ב-mCherry עבור התבנית המוטנטית. בנה ושכפל את תבניות ה- HDR לפלסמיד pAAV-MCS (או לשדרות שדרה מתאימות אחרות).
      הערה: השברים הדרושים להרכבה יכולים להיות מיוצרים על ידי PCR או מסודרים באופן מסחרי ועליהם להכיל רצפים חופפים עם השברים השכנים להם. אם המוטציה המעניינת היא מוטציה נקודתית, הכנסה קטנה או מחיקה קטנה, ה-cDNA שעבר מוטציה יכול להיות מיוצר על ידי PCR על ידי ביצוע מוטגנזה מכוונת אתר בתבנית HDR המכילה את ה-WT cDNA.
    9. הפוך Escherichia coli מוכשר עם המוצר התאספו באמצעות שיטת הלם חום. לפני שמתחילים, מניחים את החיידקים להפשרה על הקרח למשך 10 דקות.
    10. הוסף 2 μL של המוצרים המורכבים ל 50 μL של חיידקים. מערבבים את התוכן על ידי הבהוב עדין.
    11. מניחים את הדוגמאות על קרח למשך 30 דקות. מעבירים את הדגימות לתרמובלוק שנקבע ל-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    12. מעבירים את הדגימות על הקרח למשך 5 דקות. הוסיפו 450 μL של SOC בינוני בטמפרטורת החדר ודגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    13. מורחים את הדגימות על צלחות אגר LB המכילות אמפיצילין. עבור כל דגימה, יש למרוח 100 μL של שלושה דילולים שונים של תמיסת החיידקים (לא מדולל, 1:5 ו-1:10) על מנת לקבל לוחות אגר LB עם מושבות בודדות שניתן לקטוף. דגירה של הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    14. למחרת, בחר שלוש מושבות לכל דגימה. מעבירים את המושבות לצינורות של 15 מ"ל עם פקקים המכילים 4 מ"ל של LB בינוני בתוספת אמפיצילין ודגירה למשך הלילה בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    15. Aliquot 500 μL של תמיסת החיידקים מכל מושבה ולאחסן אותה במקרר לשימוש מאוחר יותר. בצע מיני-הכנה כדי לחלץ DNA פלסמיד בהתאם להוראות היצרן.
    16. שלח את הדגימות לריצוף סנגר כדי לאשר את ההרכבה הנכונה של הפלסמידים. השתמש במספיק פריימרים המפוזרים ברחבי הפלסמיד כדי להבטיח אישור רצף ללא הפרעה, באופן אידיאלי לכסות כל אזור פעמיים בקריאות קדימה ואחורה.
    17. הוסיפו 200 מיקרון של תמיסת החיידקים המכילה את הפלסמיד שהורכב כהלכה ל-200 מ"ל של מצע LB בתוספת אמפיצילין ודגירה בשייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    18. בצעו הכנת מידי או מקסי כדי לחלץ את הדנ"א הפלסמיד בהתאם להוראות היצרן. אחסן את הדנ"א הפלסמיד ב- −20 °C.
  2. הכנת רקומביננטי AAV6
    הערה: יהיה צורך לבצע שתי הכנות נפרדות של AAV6: אחת עבור rAAV6 עם תבנית WT HDR ואחת עבור rAAV6 עם תבנית HDR שעברה מוטציה. סעיף זה מתאר את השלבים הדרושים להכנת וירוס אחד בלבד.
    1. הפשרת תאי HEK293T, מעבירים את התאים ל-10 מ"ל של DMEM מחומם מראש בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES, וצנטריפוגה ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות.
    2. להשעות את התאים בריכוז של 1 x 105 תאים / מ"ל ולהעביר בקבוקון מתאים (למשל, בקבוק 175 ס"מ2 ). מעבירים את הבקבוקון לחממה ב-37 מעלות צלזיוס / 5% CO2.
      הערה: יש להפשיר מראש תאי HEK293T על מנת לאפשר לתאים להתאושש באופן מלא ולקבל מספר מספיק של תאים (11 x 107 תאים נחוצים לייצור של וירוס אחד). מומלץ להשתמש בתאים לאחר מינימום של שלושה מעברים ולשמור על התאים מתחת ל-20 מעברים. יש לפצל תאי HEK293T שלוש פעמים בשבוע. תוך שמירה על התאים, אלה לא יעלה על 70%-80% מפגש. ה-DMEM המשמש להכנת AAV צריך גם להיות בתוספת L-גלוטמין ונתרן פירובט.
    3. לאסוף את התאים בצינור 50 מ"ל צנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
    4. להשעות את התאים ב-20 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES ולספור עם המוציטומטר. השתמש בכחול טריפאן להרחקת תאים מתים.
    5. זרעים של 3 x 106 תאים ב-20 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES בבקבוקבגודל 175 ס"מ 2. לייצור של וירוס אחד, להכין לפחות ארבעה 175 ס"מ2 צלוחיות. לדגור על התאים ב 37 °C / 5% CO2 במשך 3 ימים.
      הערה: שלב זה מבוצע בצורה הטובה ביותר ביום שישי מכיוון שהוא מאפשר לתאים להתרחב במהלך סוף השבוע.
    6. קציר וספירת תאי HEK293T.
    7. להכנת אחד הנגיפים, הכינו עשרה כלים בקוטר 150 מ"מ שכל אחד מהם מכיל 11 x 106 HEK293T ב-20 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES.
    8. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 למשך 24 שעות. יש להשליך בזהירות את המדיום הישן ולהחליף ב-20 מ"ל של DMEM נטול אנטיביוטיקה בתוספת 10% FBS, 25 mM HEPES ו-1 mM נתרן בוטיראט. לפני שתמשיך, בדוק כי מפגש התאים אינו מעל 80%.
    9. הכינו שני צינורות 15 מ"ל שיכילו את תערובות הטרנספקציה. לצינור 1, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיום מופחת בסרום, 60 מיקרוגרם של פלסמיד HDR שעבר מוטציה ב-rAAV6 ו-220 מיקרוגרם של pDGM6 (פלסמיד עוזר). לצינור 2, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיום מופחת בסרום ו-1,120 מיקרו-ליטר של תמיסת פוליאתילנימין במינון 1 מ"ג/מ"ל (PEI, מגיב טרנספקציה).
    10. הוסף את התוכן של Tube 2 ל- Tube 1 ומערבולת במשך 30 שניות. דגירה במשך 15 דקות ב-RT כדי להבטיח עטיפה נכונה של הדנ"א לתוך מיצלות PEI.
      הערה: אין לשמור את הפתרון למשך יותר מ-20 דקות.
    11. מוסיפים בזהירות 1.1 מ"ל של התמיסה לכל מנה ומפזרים על ידי מערבולת עדינה. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 במשך 48 שעות.
    12. לאחר 48 שעות, מוסיפים 250 μL של 0.5 M EDTA לכל מנה ומניחים את הכלים באינקובטור למשך 10 דקות. קציר התאים על ידי שטיפתם מהכלים והעברתם לצינור צנטריפוגה של 500 מ"ל או צינורות מרובים של 50 מ"ל.
    13. צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט. כדי להבטיח הסרה מלאה של supernatant, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס.
    14. השליכו את כל הסופרנאטים שנותרו. כל שארית של סופרנאטנט עלולה לפגוע בטיהור הנגיף.
    15. שחררו את הכדור על ידי מערבולות והוציאו את הנגיף באמצעות ערכת טיהור AAV (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. לחלופין, בצע מיצוי על ידי אולטרה-צנטריפוגציה של יודיקסנול30,31.
    16. Aliquot את הנגיף מטוהר ולאחסן ב -80 °C (80 °F). טיטרט ה-AAV באופן פונקציונלי או כימות של טיטר ה-AAV על-ידי טיפות דיגיטליות PCR (ddPCR)32 על מנת לקבוע את תנאי ההתמרות האופטימליים.
    17. חזור על תהליך זה להכנת פלסמיד rAAV6 WT HDR.
  3. טיטרציה AAV על ידי ddPCR
    1. לפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F).
    2. חלצו דנ"א נגיפי על ידי הוספת 15 μL של תמיסת מיצוי DNA ל-5 μL של הנגיף. וורטקס במשך 15 שניות.
    3. דגירה במשך 6 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. וורטקס במשך 15 שניות. דגירה במשך 2 דקות ב 98 מעלות צלזיוס.
    4. השתמש בדנ"א שחולץ (שהוא דילול 1:4 של הדנ"א הנגיפי) כדי להכין דילולים סדרתיים (1:400, 1:40,000, 1:160,000, 1:640,000) ללא נוקלאז (nf) H2O עבור ddPCR.
      הערה: ניתן לאחסן את הדילולים בטמפרטורה של −20 °C אם ה- ddPCR לא יבוצע באופן מיידי.
    5. בחר שלושה מהדילולים עבור ddPCR. בחירת הדילול לשימוש תלויה בריכוז הנגיף. רצוי, השתמש בשלושה דילולים שונים (לדוגמה, 1:40,000, 1:160,000 ו- 1:640,000) כדי למצוא את הדילול הטוב ביותר שנמצא בגבול הזיהוי של המכשיר.
    6. שמרו את הריאגנטים על הקרח בזמן העבודה. הכינו תערובת אב (כל הדוגמאות יימדדו בכפילויות). עבור כל תגובה, הכן את הדברים הבאים: 12.5 μL של ddPCR Supermix עבור בדיקות, ללא dUTP, 1.25 μL של בדיקת PrimeTime Std qPCR, AAV-ITR (ראה טבלת חומרים), ו- 6.25 μL nf-H2O.
    7. ערבבו 5 μL של דנ"א עם 20 μL של תערובת המאסטר. בצע זאת עבור דילולים של 1:40,000, 1:160,000 ו-1:640,000.
    8. הנח מחסנית במחזיק המחסנית. הוסף 70 μL של שמן ייצור טיפות לגשושיות בשורה הנקובה כ- Oil. היזהר לא ליצור בועות.
    9. הוסף 20 μL של נפח הדגימה בשורה הנקובה כדוגמה. היזהר לא ליצור בועות.
    10. אטמו את המחסנית עם האטם והניחו אותה במחולל הטיפות. צור את הטיפות על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה במכונה, הסר את האטם, והעבר בזהירות, עם פיפטה רב ערוצית, 40 μL של הטיפות שנוצרו לתוך צלחת 96 באר. עבדו לאט כדי למנוע הרס של הטיפות ובועות האוויר.
    11. אטמו את צלחת 96 הבארות עם רדיד אלומיניום נוקב (הפס האדום הפונה כלפי מעלה) באמצעות איטום צלחת PCR. מניחים את הצלחת בתרמו-ציקלר.
    12. הגדר את עוצמת הקול ל- 40 μL, את טמפרטורת המכסה ל- 105 °C ואת קצבי הרמפה ל- 2 °C / s. הפעל את תוכנית ה-PCR כמתואר בטבלה 2.
    13. הפעל את קורא הטיפות 30 דקות לפני השימוש. פתח את התוכנה בשולחן העבודה.
    14. הזן את פריסת הלוחות ובחר ABS בכרטיסיית הניסוי ו - ddPCR Supermix בכרטיסייה Supermix. לאחר מכן, תחילה לחץ על PRIME, ולאחר מכן לחיצה על FLUSH SYSTEM על התוכנה כדי ליזום את המערכת.
    15. הזן את הצלחת לתוך הקורא. התחל את הריצה ולאחר שתסיים, ייצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח הבא כגיליון אלקטרוני.
      הערה: המספרים המופקים על-ידי התוכנה הם עותקי גנום (GC) לכל μL. אלה צריכים להיות מוכפלים בגורמי הדילול: GC/μL x 5 (דילול הדנ"א בתערובת הראשית) x דילול ראשוני (כלומר, 40,000 או 160,000).

Figure 3
איור 3: סקירה סכמטית של מיקוד פנימי ואקסוני במהלך דפיקת HDR של CRISPR/Cas9 . השוואה סכמטית בין אסטרטגיות מיקוד אינטרוניות ואקסוניות עבור CRISPR/Cas9 HDR. (A) במהלך מיקוד אינטרוני, הפסקה דו-גדילית מוצגת באינטרון של הדנ"א. תבנית HDR מורכבת מרצף LHA, cDNA ו-RHA. המיקוד האינטרוני דורש, בנוסף, נוכחות של מקבל פרוסות המכיל את אתר השחבור 3', נקודת ההסתעפות ומערכת הפוליפירימידין. זה מאפשר שחבור נכון. התיבה המנוקדת הירוקה מייצגת את האזור המתאים לרצף SA. הגודל של SA הוא 150 bp. (B) מיקוד אקסוני מסתמך על ייצור של שבר דו-גדילי ישירות באקסון. תבנית HDR מורכבת מרצף LHA, cDNA ו-RHA. התיבות המנוקדות הכתומות מציינות את האזורים המתאימים ל-LHA ול-RHA. הגודל האידיאלי של HAs הוא 400 bp כל אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מקדמים
שם אורך תיאור: __________
SFFV 492 BP טחול להתמקד יוצר וירוס מקדם. מקדם יונקים חזק. ביטוי מכונן
UBC 400 bp מקדם נגזר מהגן האנושי יוביקוויטין C. מבוטא באופן מכונן.
CMV 508 BP מקדם נגזר Cytomegalovirus. הוא עשוי להכיל אזור משפר. מבוטא באופן מכונן. מקדם יונקים חזק. ניתן להשתיק.
EF-1a 1182 BP תרגום אאוקריוטי אנושי גורם התארכות 1 מקדם אלפא. מבוטא באופן מכונן. מקדם יונקים חזק.
EFS 200-300 כ"ס EF-1 אלפא אינטרון ללא צורה קצרה
קג"ג 584 BP מקדם יונקים היברידיים המכיל את משפר ה-CMV המוקדם (C), מקדם הבטא-אקטין של העוף (A), ומקבל השחבור של הגן בטא-גלובין ארנב (G). מבוטא באופן מכונן.
אותות פוליאדנילציה (PolyA)
קיצור אורך תיאור: __________
SV40 פוליה 82-122 כ"ס וירוס סימיאן 40 אות פוליאדנילציה
bGH פוליה 224 BP אות פוליאדנילציה של הורמון גדילה בקר
rbGlob PolyA 56 BP אות פוליאדנילציה של בטא גלובין ארנב

טבלה 1: מקדמים ואותות פוליאדנילציה.

צעד טמפרטורה זמן מחזורים
הפעלת אנזים 95°C 10 דקות פי 1
דנטורציה 94°C 30 שניות פי 42
חישול 60°C דקה 1
סיומת 72°C 30 שניות
השבתת אנזימים 98°C 10 דקות פי 1
אחז 4°C ∞

טבלה 2: תוכנית PCR טיפתית דיגיטלית.

3. עריכה של HSPCs

  1. טרנספקציה והתמרה של HSPCs
    1. הפשירו CD34+ HSPCs והעבירו את התאים ל-10 מ"ל של RPMI מחומם מראש בתוספת 1% P/S. צנטריפוגה ב-350 x גרם ב-RT למשך 10 דקות.
    2. להשעות את התאים במדיום שימור HSPC לריכוז של 2.5 x 105 תאים / מ"ל ולדגור ב 37 °C / 5% CO2 במשך 48 שעות - 72 שעות.
    3. לקצור את התאים בצינור 15 מ"ל. ספור את התאים ובדוק את כדאיות התאים על-ידי הרחקה של טריפאן כחול. בין 2 x 10 5 ו5 x 106 תאים ניתן nucleofected ב cuvette אחד. הכינו את המספר המתאים של cuvettes בהתאם למספר התא המחושב שלכם.
    4. הכן את קומפלקס RNP. בצינור של 1.5 מ"ל, הוסיפו 15 מיקרוגרם של Cas9 ו-8 מיקרוגרם של sgRNA (יחס טוחן 1:2.5) ודגרו ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חימום.
    5. בזמן שקומפלקס ה-RNP דוגר, סובבו את התאים בגודל של 350 x g למשך 5 דקות והשליכו את הסופר-נטנט.
    6. להשעות את התאים ב 100 μL של תמיסת נוקלאופקציה. מערבבים את התאים עם קומפלקס RNP ומעבירים לתוך הקובט.
    7. טפחו בעדינות על הקובט כדי להסיר שאריות של בועות אוויר שעשויות להיווצר במהלך ההעברה.
    8. הכנס את הקובט למחזיק של מערכת הטרנספקציה וחשמל את התאים כפי שתואר קודם לכן בסעיף תכנון sgRNA.
    9. מיד לאחר האלקטרופורציה, יש להוסיף 400 μL של מדיום שימור HSPC שחומם מראש ללא P/S ולהעביר את התאים עם פיפטה העברה עדינה לתוך צלחת תרבית רקמה המכילה 500 μL של מדיום שימור HSPC מחומם מראש ללא P/S. בהתאם למספר התא, השתמש בלוח תרבית מתאים (צלחת 24, 12 או 6 בארות) על מנת להגיע לצפיפות שבין 0.25 x 106 לבין 1 x 106 תאים / מ"ל. מעבירים את הצלחת לחממה ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2.
    10. הפשירו את הבקבוקונים המכילים את ה-rAAVs הקפואים על הקרח. התמר את התאים על ידי הזרמת הכמות האופטימלית של כל rAAV6 לתרחיף התא. בצע את ההתמרה תוך 20-30 דקות לאחר האלקטרופורציה כדי לקבל יעילות התמרה גבוהה.
      הערה: יש לקבוע בניסוי את הריכוז האופטימלי של כל וירוס (וירוס אחד עבור תבנית WT HDR ווירוס נפרד אחר עבור תבנית HDR שעברה מוטציה). בדרך כלל, 5,000-10,000 GC/תא (למשל, 5 x 109 GC עבור 1 x 106 תאים ) לגרום להתמרה גבוהה.
    11. מערבבים בעדינות את מתלה התא עם הפיפטה. דגירה של התאים המתמרים במשך 6-8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס / 5% CO2. לאחר 6-8 שעות, לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
    12. השליכו את המדיום הישן והחליפו במדיום שימור HSPC טרי שחומם מראש בתוספת P/S.
    13. להשעות את התאים בריכוז שבין 2.5 x 10 5-5x 10 5 תאים למ"ל ולהעביר לצלחת תרבית תאים שטופלה ברקמה (צלחת 24, 12 או6-well). דגירה של התאים במשך 48 שעות ב-37 °C/5% CO2 לפני שתמשיך במיון.
  2. מיון זרימה של HSPCs מהונדסים הנושאים את מוטציית GOF ההטרוזיגוטית
    1. קצירת התאים בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 350 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, השעה את התאים ב-1 מ"ל של DPBS המכיל 0.1% BSA, וצנטריפוגה שוב ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות.
    2. השליכו את הסופרנטנט והשעו את התאים בנפח מתאים של DPBS + 0.1% BSA בהתאם למספר התא.
      הערה: מומלץ להשעות את התאים בנפח מינימלי של 200 μL ולא יעלה על 1 x 107 תאים למ"ל על מנת להפחית את הסיכון לסתימת המיון.
    3. העבר את התאים לצינור FACS סטרילי המצויד בכובע. הוסיפו 7-AAD או צבע כדאיות אחר (בהתאם לתאימות שלהם לחלבונים הפלואורסצנטיים) לתרחיף התאים להרחקת תאים חיים/מתים.
    4. מיין את התאים החיים שהם חיוביים כפולים עבור חלבוני הכתב הפלואורסצנטי לצינור איסוף המכיל 200 μL של מדיום שימור HSPC.
      הערה: יש להוסיף פקדים מתאימים המורכבים מתאים מתאים המומרים באמצעות AAVs בלבד כדי להבטיח סידור תקין במהלך הליך המיון.
    5. צנטריפוגה של התאים הממוינים ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות והשהה את התאים במדיום שימור HSPC בריכוז של 2.5 x 105 תאים /מ"ל להרחבה נוספת בתרבית או השתמש בתאים ישירות לבדיקות פונקציונליות.

4. אישור על עריכת גנים מוצלחת

  1. מיצוי DNA גנומי
    1. לפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F). קציר 2 x 10 5 תאים ערוכים גנום ומטוהרים מיון וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך5 דקות.
    2. חלץ את ה- gDNA כפי שתואר קודם לכן. השתמש בתמיסת ה- DNA ישירות עבור PCR או אחסן ב- −20 °C.
  2. PCR פנימי
    1. תכננו שני פריימרים כדי להגביר את אתר ההחדרה 5' (איור 4A): פריימר קדימה 1 מכוון למוקד הגנומי מחוץ לזרוע ההומולוגיה השמאלית; פריימר הפוך 2 מכוון לרצף המשולב.
    2. עבור ה-PCR הנכנס, הכן את תערובת ה-PCR הבאה לכל תגובה:
      10 מיקרון של תערובת מאסטר PCR (2x; ראו טבלת חומרים)
      1 μL של פריימר קדימה 1 (10 μM מלאי)
      1 μL של פריימר הפוך 2 (מלאי של 10 μM)
      0.5-1.0 μL של דנ"א שחולץ
      נטול נוקלאז H2O עד לנפח סופי של 20 μL
      הערה: עבור יותר מתגובה אחת, מומלץ להכין תערובת אב המכילה תגובה אחת נוספת כדי להסביר שגיאות פיפטינג. חשוב לכלול בקרה שאינה תבנית ודנ"א של תבנית מדגימה שטופלה בלעג.
    3. הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות תוכנית המחזור התרמית המתאימה (עיין בהוראות היצרן).
      הערה: מומלץ לבדוק תחילה את זוג הפריימרים לקבלת טמפרטורת החישול האופטימלית. זה יכול להיעשות על ידי חישוב Tm ולאחר מכן על ידי הפעלת PCR עם thermocycler שיכול לבצע טמפרטורה הדרגתית.
    4. הפעל את מוצרי ה-PCR עם סולם דנ"א על ג'ל אגרוז של 1.5% ב-100 וולט למשך 45-60 דקות (איור 4B). הניחו את הג'ל על אור כחול או על טרנסילומינטור UV. הבלו את הרצועות מן הג'ל.
    5. חלצו את הדנ"א מהרצועות באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA. שלח את דגימות ה- PCR שחולצו עם פריימרים מתאימים לריצוף סנגר כדי לאשר את האינטגרציה הנכונה והחלקה של ה- cDNA הרצוי במוקד הגן האנדוגני.

Figure 4
איור 4: אימות של אינטגרציה גנומית על-ידי PCR in-out . (A) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית ה-PCR הנכנסת. באסטרטגיה המתוארת תוכננו שני פריימרים. הפריימר קדימה 1 מכוון ללוקוס הגנומי מחוץ ל-LHA, והפריימר הפוך 2 מכוון לרצף הממוטב לקודון. (B) ייצוג סכמטי של אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. רק תאים שעברו עריכה מוצלחת (RNP + AAV) ייצרו מוצר PCR במהלך ה-PCR הנכנס, בעוד שהדגימות הלא ערוכות (AAV בלבד) לא ייצרו מוצר PCR. קיצור: NTC = פקד שאינו תבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Representative Results

על ידי יישום הפרוטוקול המתואר לעיל, מוטציות CALR הטרוזיגוטיות מסוג 1 הוכנסו באופן משוחזר ב- HSPCs שמקורם בדם טבורי. מוטציה זו מורכבת ממחיקה של 52 bp באקסון 9 (האקסון האחרון של CALR), מה שמביא להחלפת מסגרת +1, מה שמוביל לתרגום של תחום C-terminalטעון חיובית 26,33. כדי להציג את מוטציית CALR במוקד הגן האנדוגני, אומצה אסטרטגיית מיקוד פנימית במעלה הזרם של אקסון 9, מכיוון שהדבר יעקוף כל שינוי לא רצוי ברצף הקידוד במקרים שבהם ה- DSB המושרה על ידי Cas9 לא תוקן באמצעות מנגנון HDR. במקרה ספציפי זה, sgRNA עבור intron 7 תוכנן בשל הזמינות של רצפים גבוהים על המטרה ונמוך מחוץ למטרה בשילוב עם זרועות הומולוגיות חיוביות (חוסר רצף; איור 5A).

לאחר מכן תוכננו ונארזו שתי תבניות תורמים בווקטורים של AAV6. על מנת לאפשר שחבור נכון מהאקסונים האנדוגניים ל-cDNA המשולב, תבניות התורם מכילות (i) רצף SA הכולל את אתר השחבור 3', נקודת ההסתעפות ומערכת הפוליפירימידין, (ii) רצף ה-cDNA המותאם לקודון של אקסונים 8-9, המכיל את ה-WT (CALR WT) או את הרצף שעבר מוטציה (CALRDEL ) כולל קודון עצירה, (iii) אות פוליA של נגיף סימיאן 40 (SV40), (iv) קידוד רצף לחלבון פלואורסצנטי תחת שליטתו של המקדם הפנימי הנפרד, מקדם הנגיף יוצר מיקוד הטחול (SFFV), ואחריו (v) אות פוליA של הורמון גדילה בקר (bGH). תבנית התורם המכילה את ה- CALR WT cDNA תוכננה להכיל קלטת GFP, ואילו תבנית התורם המכילה את רצף CALRDEL cDNA תוכננה להכיל קלטת BFP. כל המבנה היה מוקף ב-HA שמאלי וימני (איור 5A).

יומיים לאחר הטרנספקציה עם קומפלקס RNP והתמרה עם נגיפי rAAV6, התאים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. ניתן לזהות ארבע אוכלוסיות עיקריות: (i) תאים המבטאים לא את ה-GFP ולא את ה-BFP, המייצגים תאים ללא עריכת גנום מבוססת HDR, (ii) תאים חיוביים רק עבור GFP, המייצגים תאים ששילבו רק את מבנה ה-WT, (iii) תאים חיוביים רק עבור BFP, המייצגים את אלה ששילבו רק את המבנה שעבר מוטציה, ו-(iv) תאים חיוביים כפולים של GFP ו-BFP, המייצגים את התאים ששילבו גם את ה-WT וגם את הרצפים שעברו מוטציה (איור 5B). על מנת להשיג אוכלוסיות טהורות של HSPCs הנושאות את המוטציה CALR מסוג 1 הטרוזיגוטית, התאים החיוביים הכפולים מוינו לפי ציטומטריה של זרימה. HSPCs שבהם שני רצפי WT נדפקו שימשו כתאי בקרה (GFP+ mCherry+; איור 5B). חלופה תקפה לשימוש כתאי בקרה תהיה HSPCs עם אינטגרציה ביאלית של החלבונים הפלואורסצנטיים במוקד נמל מבטחים (כלומר, AAVS1; לא מוצג). ספירת תאים על ידי הרחקה כחולה של טריפאן שבוצעה ב-HSPCs הממוינים הצביעה על כך שיותר מ-90% מהתאים היו בני קיימא.

אינטגרציה חלקה ממוקד של המבנים אושרה על-ידי יישום אסטרטגיית ה-PCR הנכנס (איור 6A). במקרה הספציפי הזה, ביצענו שני PCR נכנסים נפרדים, אחד עבור רצף CALR WT שנדפק (נתיב 1 של אלקטרופורזה בג'ל באיור 6A) ואחד עבור רצף CALR DEL שנדפק (נתיב 2 של אלקטרופורזה בג'ל באיור 6A). ריצוף סנגר שבוצע על הדנ"א שחולץ מרצועות הג'ל אישר את ההחדרה הנכונה של רצפי WT ורצפים שעברו מוטציה ב-CALRDEL/WT HPCs (איור 6B).

Figure 5
איור 5: יצירת HSPCs הנושאים את מוטציית ה-CALR ההטרוזיגוטית. (A) סכימה מייצגת המתארת את אסטרטגיית העריכה להחדרת מוטציית CALR ההטרוזיגוטית. קומפלקס ה-RNP מכוון לאינטרון שבין אקסון 7 לאקסון 8 של הגן CALR. שני AAVs, אחד המכיל את האקסונים 8-9 שעברו מוטציה ו- BFP והשני המכיל את האקסונים WT 8-9 ו- GFP, ישמשו כתבניות תיקון תורמים ויקדמו את האינטגרציה של הרצף המוטנטי באלל אחד ואת האינטגרציה של רצף WT באלל הנותר. (B) חלקות ציטומטריה מייצגות של זרימה המתארות את הביטוי של GFP ו-BFP או GFP ו-mCherry 48 שעות לאחר ההעברה וההתמרות של HSPCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: אימות של מוטציית CALR הטרוזיגוטית מוצלחת ב-HSPCs . (A) אלקטרופורזה בג'ל מתוצרי ה-PCR הפנימיים המבוצעים על דנ"א גנומי המופק מבקרות AAV, CALR WT/WT ו-CALRDEL/WT. נעשה שימוש בסולם דנ"א של 100 bp. קיצור: NTC = פקד שאינו תבנית. (B) תוצאות ריצוף סנגר המתקבלות מה-PCR הנכנס שבוצעו ב-CALRDEL/WT המאשרות אינטגרציה מוצלחת של רצפי WT ורצפים שעברו מוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

המניפולציה הגנטית היעילה והמדויקת של HSPCs ראשוניים אנושיים מייצגת הזדמנות מצוינת לחקור ולהבין את התהליכים המשפיעים על המטופויאזיס נורמלי, והכי חשוב, הטרנספורמציה הלוקמית של תאים המטופויאטיים.

בפרוטוקול זה תוארה אסטרטגיה יעילה להנדס HSPCs אנושיים כדי לבטא מוטציות GOF הטרוזיגוטיות חוזרות ונשנות. הליך זה ניצל את טכנולוגיית CRISPR/Cas9 ואת וקטורי rAAV6 כתורמים לתבניות דנ"א כדי להחדיר במדויק רצפי WT ודנ"א מוטנטיים למוקדי הגנים האנדוגניים שלהם. צימוד ה-cDNAs המהונדסים (WT ומוטציה) עם חלבוני דיווח פלואורסצנטיים מופרדים מאפשר העשרה ומעקב אחר תאים במצב הטרוזיגוטי סופי.

אסטרטגיה זו מציגה מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הנפוצות המבוססות על לנטי-ויראליות (LV). אחד היתרונות העיקריים הוא שהמערכת מבוססת CRISPR/Cas9 מאפשרת עריכה מדויקת בלוקי האנדוגני, וכתוצאה מכך שימור המקדמים האנדוגניים והאלמנטים הרגולטוריים. זה מוביל להומוגניות בביטוי הגן הערוך בתאים, מטרה שכמעט ולא ניתנת להשגה כאשר משתמשים בשיטה מבוססת LV. העברת גנים עם וקטורים LV מובילה לאינטגרציה אקראית למחצה של הגן עם עדיפות לאתרים פעילים בתעתיק34. זה יכול להיות מתורגם לביטוי יתר של הגן המועבר וההטרוגניות בין התאים הערוכים, ובסופו של דבר לגרום לקשיים לחקור ולנתח את התפקיד של מוטציות ואינטראקציות בין גנים. יתרון שני הוא שהמערכת המתוארת, בהיותה מערכת עריכה ספציפית לאתר, מבטלת את הסיכונים של מוטגנזה35.

אסטרטגיית הדיווח הפלואורסצנטי הכפול מאפשרת העשרה ומעקב מדויקים אחר תאים שנערכו בהצלחה בשני האללים, כאשר אלל אחד משלב את ה-cDNA של WT והאלל השני משלב את רצפי ה-cDNA שעברו מוטציה. תאים המבטאים רק כתב יחיד מייצגים אינטגרציה מונואללית בלבד או אינטגרציה ביאלית של תבניות HDR עם אותו כתב פלואורסצנטי. ניתן להבחין במדויק בין שני התרחישים רק אם מיוצרים שיבוטים שמקורם בתא בודד ומנותחים בנפרד. עם זאת, ל-HSPCs יש יכולת התפשטות מוגבלת בלבד במבחנה, וכאשר הם נשמרים בתרבות לפרקי זמן ממושכים, HSPCs מתחילים להתבדל לצאצאים בוגרים יותר ומאבדים את יכולת ההתחדשות העצמית והחריטה שלהם. זה הופך את הבחירה וההרחבה של שיבוטים חד-תאיים הנושאים את המוטציה ההטרוזיגוטית הרצויה לבלתי אפשרית. היישום של אסטרטגיית החלבון הפלואורסצנטי הכפול והעשרתו על ידי ציטומטריה של זרימה עבור תאים הנושאים את המוטציה ההטרוזיגוטית מאפשר לעקוף את הבעיות הנגרמות על ידי תרבית חוץ גופית מורחבת.

בדוגמה ספציפית זו, הוכח בהצלחה כי ניתן להנדס ולמיין ביעילות HSPCs על מנת להשיג אוכלוסיות טהורות של HSPCs הנושאים את המוטציה CALR DEL/WT ההטרוזיגוטית.

עם זאת, מערכת זו אינה מוגבלת להנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות מסגרת, אלא ניתן לאמץ אותה בקלות כדי ליצור סוגי מוטציות אחרים, כולל מוטציות מיסנס ושטויות. על ידי יישום שילובים שונים של AAVs המכילים WT או רצפים שעברו מוטציה עם חלבונים מדווחים פלואורסצנטיים שונים, מערכת זו יכולה לשמש גם להכנסת מוטציות הומוזיגוטיות (התמרה סימולטנית עם שני rAAVs שניהם נושאים cDNA מוטנטי אך מדווחים פלואורסצנטיים שונים) או אפילו תיקון מוטציות (התמרה סימולטנית עם שני AAVs שניהם נושאים WT cDNA אך מדווחים פלואורסצנטיים שונים). בנוסף, חשוב להזכיר כי אסטרטגיה זו אינה מוגבלת להכנסת מוטציות GOF אונקוגניות. למעשה, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר למספר אסטרטגיות חלופיות, כולל נוק-אאוט של גנים, החלפת גנים 36,37, נוק-אין ממוקד של טרנסגנים (כלומר, קולטני אנטיגן כימריים)38, ואפילו לתיקון מוטציות הגורמות למחלות 11,39.

האסטרטגיה של שילוב CRISPR/Cas9 ו-AAV6 עם מספר רב של כתבים פלואורסצנטיים הוכחה גם כישימה בסוגי תאים רבים אחרים, כולל תאי T, תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, תאי גזע עצביים ותאי גזע של דרכי הנשימה 24,38,40,41,42,43,44 . אסטרטגיה זו יכולה להיות מיושמת לייצור תאי T של קולטן אנטיגן כימרי מעולה (CAR). לדוגמה, לאחרונה פורסם כי נוק-אאוט בתיווך CRISPR/Cas9 של הגן TGFBR2 בתאי CAR T מגביר מאוד את תפקודם במיקרו-סביבה העשירה ב-TGF-β45. גישה כזו יכולה לספק פרוטוקול של שלב אחד הן להנדס את תאי ה-T כדי לבטא את ה-CAR והן כדי להפיל את הגן TGFBR2 על ידי החדרה ספציפית של ה-CAR לשני האללים של הגן TGFBR2. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות שימושית גם ליצירת תאי CAR T אוניברסליים על ידי שילוב CAR בגן קולטן אלפא של תאי T (TRAC)46,47.

כדי להגדיל את יכולת השכפול ולהבטיח עריכה יעילה של התאים, יש לדאוג לכמה שיקולים חשובים. הנקודות הקריטיות העיקריות להבטחת עריכה מוצלחת של התאים שוכנות ב-(i) בחירת ה-sgRNA, (ii) העיצוב של תבנית HDR, ו-(iii) ייצור ה-rAAV6.

הבחירה של sgRNA בעל ביצועים טובים היא חיונית מכיוון שהיא תקבע את המספר המרבי של אללים שבהם ניתן לשלב את תבנית HDR. בשל תוכנות רבות הזמינות כעת, החיפוש אחר sgRNAs מועמדים היה פשוט יותר. על ידי בחירת אזור העניין, התוכנה יכולה להציע סדרה של sgRNAs עם ניקוד על המטרה וציון מחוץ למטרה המציינים את הסיכויים לעריכה בלוקוס הרצוי ובמקומות לא רצויים, בהתאמה. ציונים אלה מחושבים על סמך מודלים של ניקודשפורסמו בעבר 48,49. למרות שזוהי נקודת התחלה טובה לבחירת sgRNA בעל ביצועים טובים, יש לאשר את הביצועים של ה-sgRNA מכיוון שהביצועים החזויים שלו בסיליקו לא תמיד תואמים ל-sgRNA יעיל במבחנה. לכן, מומלץ מאוד לתכנן ולבדוק לפחות שלושה sgRNAs כדי להגדיל את הסיכויים למצוא את ה- sgRNA הטוב ביותר. לאחר שזוהה sgRNA אמיתי בעל ביצועים טובים, מוצע להמשיך עם העיצוב של תבנית HDR.

יש לקחת בחשבון אמצעי זהירות בעת עיצוב תבנית HDR. זרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית (LHA ו-RHA, בהתאמה) צריכות להשתרע כל אחת על פני 400 bp במעלה הזרם ובמורד הזרם של אתר חיתוך sgRNA, בהתאמה, מכיוון ש-HAs קצרים יותר עלולים לגרום לתדרי HDR מופחתים. גודל ה-cDNA שניתן להציג באמצעות HDR תלוי ביכולות האריזה של AAVs, שהם בערך 4.7 קילובייט. בשל האלמנטים הרבים הנדרשים בתבנית HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, מקדם ורצף כתבים פלואורסצנטי), השטח הנותר עבור ה-cDNA שעבר מוטציה או WT מוגבל. זה לא פרובלמטי אם המוטציה הרצויה ממוקמת בסמוך לקצה 3' של גן או בגנים עם CDS קצר כולל. עם זאת, במקרים שבהם המוטציה ממוקמת בסמוך לצד ההתחלה השעתוק (TSS) של הגנים עם CDS ארוך (העולה על שטח האריזה הנותר של AAV), גישה מתוארת זו עשויה שלא להיות אפשרית. כדי לעקוף בעיה זו, אסטרטגיה המסתמכת על פיצול תבנית HDR לשני AAVs פותחה לאחרונה על ידי Bak ועמיתיו. אסטרטגיה זו מסתמכת על שתי אינטגרציות נפרדות בתיווך HDR כדי להשיג את האינטגרציה הסופית החלקה של גןגדול 50.

איכות הנגיף והטיטר שלו הם גורמים נוספים שיכולים ליצור או לשבור את הנדסת הגנום המוצלחת של התאים. לקבלת תפוקה אופטימלית, חשוב לא לתת ל-HEK293T להגיע למפגש מלא תוך שמירה על תרבות. באופן אידיאלי, יש לפצל את תאי HEK293T כאשר מגיעים למפגש של 70%-80%. בנוסף, אין לתרבת את HEK293T לפרקי זמן ארוכים מכיוון שהדבר עלול להפחית את יכולתם לייצר וירוסים. תאי HEK293T חדשים צריכים להיות מופשרים לאחר 20 מעברים. השגת טיטרים גבוהים של וירוסים חשובה להגברת היעילות והשכפול של הניסויים. טיטרים נגיפיים נמוכים יתורגמו לכמויות גדולות של תמיסת rAAV הנדרשת להתמרה של HSPCs. ככלל, תמיסת ה- rAAV שנוספה לתאי הגרעין לא תעלה על 20% מהנפח הכולל של מדיום השמירה HSPC. כמויות גדולות יותר של תמיסת AAV עלולות להוביל למוות מוגבר של תאים, לשגשוג נמוך יותר ולפגיעה ביעילות הטרנסדוקציה. במקרה של titers וירוס נמוך, מומלץ, אם כן, לרכז עוד יותר את הנגיף.

לסיכום, פרוטוקול זה מציע גישה הניתנת לשחזור למניפולציה של HSPCs אנושיים באופן מדויק ויעיל באמצעות שימוש בו-זמני בתבניות תורמים של CRIPSR/Cas9 ו-rAAV6 עם כתבים פלואורסצנטיים כפולים נוספים. גישה זו הוכיחה את עצמה ככלי נהדר בחקר ביולוגיה נורמלית של תאי גזע המטופויאטיים והתרומות של מוטציות ללוקמוגנזה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע האוסטרית (FWF; מספר P32783 ו- I5021) ל- A.R. מימון נוסף לא.ר. ניתן גם על ידי האגודה האוסטרית לרפואה פנימית (מלגת ג'וזף סקודה), האגודה האוסטרית להמטולוגיה ואונקולוגיה (OeGHO; מענק מחקר קליני), ו- MEFOgraz. T.K. הוא עמית מיוחד של האגודה ללוקמיה ולימפומה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated Corning 431080
150 mm x 25 mm dishes Corning 430599
293T DSMZ ACC 635 https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit Lonza - For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit Lonza -
500 ml Centrifuge Tube Corning 431123
7-AAD BD Biosciences 559925
AAVpro Purification Kit Takara 6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies (IDT) 1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge Beckman Coulter -
Benchling sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad -
Chemically modified synthetic sgRNA Synthego Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526
CRISPick sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific K1081
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
FACSAria Fusion BD Biosciences -
Falcon 5 mL Round Bottom Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml Pan Biotech P40-47500
FlowJo 10.8.0 BD Biosciences  -
GenAgarose L.E. Inno-train GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs Inc. (NEB) E2611L
HEK293T
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887-100ML
ICE Synthego https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7533-1KG
Midori Green Advance Nippon Genetics MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit NEB T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml Ambion AM9939
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml Gibco 31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L Lonza V4XP-3024 The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2 Addgene 46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable Bio-Rad 1814040
pDGM6 Addgene 110660
Penicillin-Streptomycin (P/S) Gibco 15140122
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966 Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers  Eurofins - Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay IDT - PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
QuantaSoft Software Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 1864002
QX200 Droplet Reader Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand Peprotech 300-19
Recombinant human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human SCF Peprotech 300-07
Recombinant Human TPO Peprotech 300-18
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758-6X500ML
SnapGene Dotmatics Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium NEB B9020S
Sodium-butyrate Sigma-Aldrich B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1) Biogems 1224999
StemSpan SFEM II STEMCELL Technologies 9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X Thermo Scientific  B49
TIDE http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml Thermo Scientific 16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml Thermo Scientific 15575-038
UM171 STEMCELL Technologies 72914
Vector Builder codon optimization tool Vector Builder https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  9. Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
  10. Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757 (2013).
  11. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
  14. Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
  15. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  16. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  17. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  18. Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
  19. Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
  20. Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
  21. Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  22. Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
  23. Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
  24. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
  25. Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
  26. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
  27. Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
  28. Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371 (2021).
  29. How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
  30. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  31. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  32. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
  33. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  34. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
  35. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
  36. Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
  37. Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
  38. Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
  40. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
  41. Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  42. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873 (2017).
  43. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  44. Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
  45. Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977 (2020).
  46. Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
  47. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  48. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  49. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  50. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Tags

חקר הסרטן גיליון 193 CRISPR/Cas9 הנדסת גנום לוקמוגנזה תאי גזע המטופויאטיים AAV מוטציה רקומבינציה הומולוגית מוטציות רווח תפקודי
הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sconocchia, T., Foßelteder, J., … More

Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter