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Neuroscience

ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक इम्यूनोथेरेपी रणनीति के रूप में फंगल β-ग्लूकन का अलगाव और शुद्धिकरण

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 1, 1,2, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, Universidad de Sevilla, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del Rocío, CSIC, Universidad de Sevilla
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल चार अलग-अलग फंगल β-ग्लूकेन के शुद्धिकरण चरणों और बाद के अध्ययनों का वर्णन करता है जो संभावित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं के रूप में हैं जो ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के खिलाफ माइक्रोग्लिया के एंटी-ट्यूमरल गुणों को बढ़ाते हैं।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा के खिलाफ प्रभावी उपचार विकसित करने में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर मजबूत प्रतिरक्षा दमन पर काबू पाना है। इम्यूनोथेरेपी ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया को बदलने के लिए एक प्रभावी रणनीति के रूप में उभरी है। ग्लिओमा से जुड़े मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया (जीएएम) ऐसे विरोधी भड़काऊ परिदृश्यों के प्रमुख चालक हैं। इसलिए, जीएएम में कैंसर-विरोधी प्रतिक्रिया को बढ़ाने से ग्लियोब्लास्टोमा रोगियों के इलाज के लिए एक संभावित सह-सहायक चिकित्सा का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। उस नस में, फंगल β-ग्लूकन अणुओं को लंबे समय से शक्तिशाली प्रतिरक्षा मॉड्यूलेटर के रूप में जाना जाता है। जन्मजात प्रतिरक्षा गतिविधि को प्रोत्साहित करने और उपचार प्रतिक्रिया में सुधार करने की उनकी क्षमता का वर्णन किया गया है। उन मॉड्यूलेटिंग सुविधाओं को आंशिक रूप से पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स को बांधने की उनकी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जो दिलचस्प रूप से, जीएएम में बहुत व्यक्त किए जाते हैं। इस प्रकार, यह काम ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के खिलाफ माइक्रोग्लिया की ट्यूमरनाशक प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए फंगल β-ग्लूकन के अलगाव, शुद्धिकरण और बाद के उपयोग पर केंद्रित है। माउस ग्लियोब्लास्टोमा (जीएल 261) और माइक्रोग्लिया (बीवी -2) सेल लाइनों का उपयोग वर्तमान बायोफार्मास्युटिकल उद्योग में भारी उपयोग किए जाने वाले मशरूम से निकाले गए चार अलग-अलग फंगल β-ग्लूकेन के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों का परीक्षण करने के लिए किया जाता है: प्लुरोटस ओस्ट्रीटस, प्लुरोटस डजामोर, हेरिशियम एरिनेसस, और गैनोडर्मा ल्यूसिडम। इन यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में प्रसार और एपोप्टोसिस सक्रियण पर पूर्व-सक्रिय माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम के प्रभाव को मापने के लिए सह-उत्तेजना परख की गई थी।

Introduction

न्यूरो-ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में नई उपलब्धियों के आगमन के बावजूद, ग्लियोब्लास्टोमा रोगियों की जीवन प्रत्याशा कम है। मस्तिष्क ट्यूमर के खिलाफ स्वर्ण-मानक उपचार सर्जरी, रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी के समामेलन पर आधारित हैं। हालांकि, पिछले दशक में, इम्यूनोथेरेपी विभिन्न प्रकारके कैंसर के इलाज के लिए एक शक्तिशाली रणनीति के रूप में उभरी है। इस प्रकार, ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का उपयोग करने की संभावना हाल ही में ऑन्कोलॉजी का चौथा स्तंभ बन गई है।

यह लंबे समय से ज्ञात है कि क्षेत्र में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट2 के भीतर पाए जाने वाले मजबूत इम्यूनोसप्रेशन को दूर करना है। विशेष रूप से, ग्लियोब्लास्टोमा के मामले में, मस्तिष्क कैंसर के सबसे आम और आक्रामक रूपों में से एक, इस तरह के प्रो-ट्यूमरल परिदृश्यों को व्यवस्थित करने वाले प्रमुख मार्गों को उजागर करना और नए यौगिकों को खोजना जो प्रतिरक्षा प्रणाली की निराशाजनक प्रतिक्रिया का मुकाबला कर सकते हैं, इस लाइलाज बीमारी के खिलाफ भविष्य के उपचारों का मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं।

मस्तिष्क की अपनी प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाएं होती हैं, और सबसे प्रासंगिक सेल प्रकार माइक्रोग्लिया होते हैं। इन कोशिकाओं को विभिन्न केंद्रीय रोगों में एक जटिल व्यवहार साबित किया गयाहै। प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर (जैसे, ग्लियोब्लास्टोमा) के मामले में, इन कोशिकाओं को एक विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप की ओर स्थानांतरित कर दिया जाता है जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा3 को उपनिवेशित करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं का समर्थन करता है। कई प्रकाशनों ने ट्यूमर की प्रगति के दौरान इन कोशिकाओं की प्रमुख भूमिका को बढ़ाया है। इसका एक मुख्य कारण यह है कि ग्लियोमा से जुड़े माइक्रोग्लिया और घुसपैठ मैक्रोफेज (जीएएम) कुल ट्यूमर द्रव्यमान का एक तिहाई हिस्सा हैं, इस प्रकार मस्तिष्क ट्यूमर की प्रगति के दौरान उनके सक्रियण राज्यों के स्पष्ट प्रभाव का सुझावदेते हैं।

उस नस में, फंगल β-ग्लूकन को प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने वाले शक्तिशाली अणुओं के रूप में वर्णित किया गया है, जिसमें फागोसाइटोसिस और प्रो-भड़काऊ कारक उत्पादन शामिल हैं, जिससे घातक एजेंट 6,7,8,9,10 का उन्मूलन होता है। फंगल β-ग्लूकन का अध्ययन आमतौर पर विभिन्न मशरूम भागों से अर्क का उपयोग करके किया गया है। हालांकि, विशिष्ट प्रभावों के एट्रिब्यूशन के लिए अस्पष्टता से बचने और इम्यूनोमॉड्यूलेटरीएजेंटों के रूप में ऐसे अणुओं की कार्रवाई के तंत्र को समझने में सक्षम होने के लिए इसकी शुद्धि की आवश्यकता होती है।

इस काम में, घुलनशील β-ग्लूकन को चार अलग-अलग मशरूम के फलने वाले शरीर से शुद्ध किया जाता है, नियमित रूप से खाद्य (प्लुरोटस ओस्ट्रीटस और प्लुरोटस डजामोर) और औषधीय (गैनोडर्मा ल्यूसिडम और हेरिशियम एरिनेसस) मशरूम के रूप में नियोजित किया जाता है। विशेष रूप से, इन चार मशरूम का खाद्य और दवा उद्योग में बहुत उपयोग है और एक वाणिज्यिक उद्यम में पर्यावरण के अनुकूल परिपत्र अर्थव्यवस्था के भीतर उत्पादित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

मस्तिष्क कैंसर उपचारों में फंगल β-ग्लूकन के भविष्य के उपयोग की नींव रखने के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाओं के साथ उनकी कथित बातचीत में अच्छी तरह से परिभाषित शुद्धिकरण रणनीतियों और प्रीक्लिनिकल अध्ययन एंटी-ट्यूमर मध्यस्थों के रूप में उनकी संभावित भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं। यह काम चयनित मशरूम के फलने वाले निकायों के भीतर निहित घुलनशील β-ग्लूकन को पुनः प्राप्त करने के लिए आवश्यक अलगाव और शुद्धिकरण के कई चरणों का वर्णन करता है। एक बार सफलतापूर्वक शुद्ध होने के बाद, माइक्रोग्लिया कोशिकाएं अपने भड़काऊ फेनोटाइप को बढ़ाने के लिए सक्रिय होती हैं। माउस ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं (जीएल 261) को एक अलग माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम के साथ लेपित किया जाता है, पहले इन अर्क के साथ इलाज किया जाता है, और फिर ट्यूमर कोशिकाओं के व्यवहार पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि हमारी प्रयोगशाला के पायलट अध्ययन (डेटा नहीं दिखाया गया है) ने खुलासा किया है कि कैसे प्रो-भड़काऊ माइक्रोग्लिया न केवल ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में बल्कि अन्य कैंसर सेल लाइनों में भी ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण गुणों को धीमा कर सकता है। यह बहु-विषयक कार्य ऑन्कोलॉजी शोधकर्ताओं के लिए कई अलग-अलग प्रकार के ट्यूमर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने में सक्षम आशाजनक यौगिकों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित चार अलग-अलग मशरूम वेरिएंट एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. फंगल β-ग्लूकन का अलगाव

  1. घुलनशील मशरूम पॉलीसेकेराइड का निष्कर्षण और अलगाव।
    नोट: घुलनशील मशरूम पॉलीसेकेराइड (एसएमपी) चित्रा 1 में योजनाबद्ध रूप से दिखाए गए प्रक्रिया के अनुसार प्राप्त किए गए थे।
    1. आसुत जल में पांच बार ताजा पी. ओस्ट्रिटस, पी. डजामोर, एच. एरिनेसस और जी. ल्यूसिडम फलने वाले शरीर (लगभग 2,000 ग्राम/मशरूम) को धीरे-धीरे धोएं।
    2. फलों के शरीर को पारंपरिक हवा ± सुखाने वाले ओवन में 50 2 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं जब तक कि एक निरंतर वजन (~ 24 घंटे) तक न पहुंच जाए।
    3. सूखे मशरूम को ब्लेड मिल में पीसकर, प्रत्येक मशरूम से लगभग 200 ग्राम पाउडर प्राप्त करें।
    4. 100 ग्राम मशरूम पाउडर (एमपी) (पी. ओसट्रीटस, पी. डीजामोर, एच. एरिनेसस, और जी. लुसिडम) को 1,000 मिलीलीटर एच2ओडी में निलंबित करें। फिर, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव, और अंत में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर परिणामी निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. अघुलनशील मशरूम पॉलीसेकेराइड (आईएमपी) युक्त अवक्षेप को 24 घंटे के लिए हवा ± सुखाने वाले ओवन में 50 2 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं।
    7. अवक्षेप को त्याग दें और सतह पर तैरनेवाला रखें। रोटरी बाष्पीकरण में सुपरनैटेंट को 10 बार केंद्रित करें।
    8. इथेनॉल (80% अंतिम एकाग्रता) के साथ एसएमपी युक्त एकाग्रता को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अवक्षेपित करें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6,000 x g पर इथेनॉल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, गोली (अवक्षेप) को बनाए रखें, और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
    10. अवक्षेप को H2Od (10% w / v) में घोलने से पहले 80% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं। पीएच को 6.5/7 और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए α-ग्लूकेन को घुलनशील करने के लिए क्रमशः 2 यू और 4 यू α-एमाइलेज और ग्लूकोमाइलेस के साथ इलाज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    11. α ग्लूकोमाइलेस के साथ उपचार के बाद, पीएच और तापमान को क्रमशः 8.0 और 50 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें, और प्रोटीन को घुलनशील करने के लिए अल्कालाज़ (2.5 यू / जी प्रोटीन) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इलाज करें।
      नोट: यह अनुक्रमिक एंजाइमेटिक उपचार अधिकांश α-ग्लूकन और प्रोटीन को हटा देता है जो इथेनॉल वर्षा में β-ग्लूकन के साथ सह-अवक्षेपित होते हैं।
    12. हाइड्रोलिसिस के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 6,000 x g पर हाइड्रोलाइज़ेट को सेंट्रीफ्यूज करें, और एक रोटरी बाष्पीकरण में स्वच्छ सुपरनैटेंट को पांच बार केंद्रित करें। 80% इथेनॉल के साथ फिर से अवक्षेपित करें।
    13. एच2ओडी में परिणामी अवक्षेप को घुलनशील करें और कम आणविक भार अणुओं को हटाने के लिए सेल्यूलोज ट्यूबिंग झिल्ली (12,000 डीए कट-ऑफ झिल्ली; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 24 घंटे के लिए आसुत जल में डायलाइज करें। पानी में घुलनशील हिस्से को पुनर्प्राप्त करें और घुलनशील β-ग्लूकेन (एस-जी) का उत्पादन करने के लिए इसे फ्रीज-ड्राई करें।
  2. चीनी और प्रोटीन माप
    1. मानक8 के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करते हुए, फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि द्वारा प्रत्येक अंश की कुल चीनी सामग्री को मापें।
      नोट: β-ग्लूकन सामग्री की मात्रा β-ग्लूकन परख किट (मशरूम और खमीर; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके भी की जा सकती है, जो एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस और ऑक्सीडोरडक्टेस की गतिविधि पर आधारित है: अर्थात् एक्सो-1,3-β-ग्लूकानेस, ग्लूकोज ऑक्सीडेज, β-ग्लूकोसाइडेस, और पेरोक्सीडेज, क्विनोनिमाइन के बाद के गठन के साथ। मामूली संशोधनों के साथ, निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. 12 MH2SO 4 के बजाय 18 MH2SO4 का उपयोग करें।
    3. कुल ग्लूकन और α-ग्लूकन की सामग्री का अलग-अलग मूल्यांकन करें।
    4. परिणामी β-ग्लूकन मूल्यों को कुल ग्लूकन और α-ग्लूकन (तीन प्रतियों) मूल्यों के बीच अंतर के रूप में मापें। कुछ मामलों में, प्रोटीन सामग्री को लोरी विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें अंशांकन वक्र11,12 को प्लॉट करने के लिए एल्बुमिन का उपयोग किया जाता है।
  3. पराबैंगनी अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण
    1. 200-400 एनएम क्षेत्र (चित्रा 2) में नमूनों को स्कैन करके यूवी-दृश्यस्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एसयूजी पराबैंगनी (यूवी) स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
    2. एच2ओडी में प्रत्येक एस-जी के 1.0 मिलीग्राम / एमएल तैयार करें, घोल को क्वार्ट्ज क्यूवेट में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर स्कैन करें।
  4. आणविक भार वितरण विश्लेषण
    1. एक अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर और एक अल्ट्रा-हाइड्रोगेल रैखिक जेल-निस्पंदन स्तंभ (300 मिमी x 7.8 मिमी) से लैस एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा एसयूजी की समरूपता और पॉलिमर के आणविक भार का अनुमान लगाएं; चित्र 3)।
    2. मानक के रूप में 0.5 एमएल / मिनट -1 और डेक्सट्रान (110, 80, और 50 केडीए) की प्रवाह दर पर विआयनीकृत पानी का उपयोग करके 40 डिग्री सेल्सियस पर परख करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 5 एमएल अंश एकत्र करें।
  5. फूरियर-ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड (एफटीआईआर) विश्लेषण
    1. 4000-500 सेमी -1 की सीमा में एफटीआईआर स्पेक्ट्रोमीटर पर अवरक्त स्पेक्ट्रा (चित्रा 4) रिकॉर्ड करें। नमूने को पहले फिल्म बनाने के लिए केबीआर के साथ मिलाया जाना चाहिए (मानक एफटीआईआर प्रक्रिया; निर्माता के निर्देश और सामग्री तालिका देखें)।
  6. आणविक संरचना विश्लेषण
    1. मानक प्रक्रियाओं12 का पालन करते हुए उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (एचपीटीएलसी) के साथ-साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) के साथ युग्मित गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा एसओजी की आणविक रचनाओं का अनुमान लगाएं।

2. β-ग्लूकन-प्रेरित माइक्रोग्लिया उत्तेजना का इन विट्रो अध्ययन

  1. 8-वेल चैंबर स्लाइड में माउस ग्लियोब्लास्टोमा और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं की सेल संस्कृति
    नोट: यह प्रोटोकॉल जीएल 261 (ग्लियोब्लास्टोमा) और बीवी 2 (माइक्रोग्लिया) सेल लाइनों के लिए विशिष्ट है। हालांकि, मामूली संशोधनों के साथ, इन चरणों का उपयोग संभावित रूप से अन्य कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिका लाइनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
    1. डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) को एल-ग्लूटामिन, 4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज और पाइरूवेट के बिना संशोधित पूर्ण माध्यम तैयार करें। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का 10% और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सामग्री को पूर्व-गर्म करें।
    2. जमे हुए बीवी 2 और जीएल 261 एलिकोट को 2 मिनट के लिए पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में पिघलाएं, और पूरी तरह से पिघलने से ठीक पहले, उन्हें एक लामिनर प्रवाह हुड में ले जाएं और कोशिकाओं को दो अलग-अलग बाँझ टी 25 फ्लास्क (प्रत्येक सेल लाइन के लिए एक) में प्लेट करें।
    3. टी 25 फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति सुसंगत न हो जाए।
      नोट: ठंड की स्थिति और क्रायोप्रिजर्वेशन के तहत समय के आधार पर, संगम तक का समय भिन्न हो सकता है। इन सेल लाइनों को आमतौर पर टी 75 फ्लास्क में कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के लिए 3 से 5 दिनों की आवश्यकता होती है।
    4. बीवी 2 सेल कल्चर के कंफ्लुएंट हो जाने के बाद, इसे 8-वेल चैंबर स्लाइड 0.6 x 106 सेल / वेल में स्थानांतरित करें। 8-वेल चैंबर स्लाइड को इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए रखें।
    5. एक बार माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को 8-वेल चैंबर स्लाइड में चढ़ाया जाता है, तो जीएल 261 कोशिकाओं के साथ उसी प्रोटोकॉल को दोहराएं।
  2. β-ग्लूकन के साथ माइक्रोग्लिया का सक्रियण
    1. बीवी 2 कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए 0.2 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर चार अलग-अलग β-ग्लूकेन (पी. ओस्ट्रीटस, पी. डीजेमोर, जी. लुसिडम और एच. एरिनेसस) के साथ कोट करें। एक प्रयोगात्मक स्थिति अनुपचारित (सामान्य माध्यम) रहनी चाहिए, नियंत्रण समूह के रूप में कार्य करना चाहिए।
    2. 72 घंटे के बाद एक पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और शेष मात्रा को 0.20 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें। फिर, सतह पर तैरनेवाला को कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  3. पूर्व-सक्रिय माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम के साथ जीएल 261 का उपचार
    1. एक बार जब जीएल 261 8-वेल चैंबर स्लाइड के भीतर 80% कंफ्लुएंट हो जाता है, तो 72 घंटे के लिए 25% की अंतिम मात्रा एकाग्रता पर β-ग्लूकन-उपचारित माइक्रोग्लियल माध्यम (चरण 2.2.2) जोड़ें (कुल मात्रा: 250 μl /
    2. 72 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद माध्यम को हटा दें और इसे छोड़ दें।
    3. फॉस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस; पीएच 7.4, 0.1 एम) के साथ कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    4. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 μL जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
      नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न एंटीबॉडी के आधार पर, निर्धारण विधियां विशिष्ट 4% पीएफए से भिन्न हो सकती हैं। अल्कोहल-आधारित फिक्सेटिव कुछ एपिटोप्स को संरक्षित करने में अधिक कुशल हो सकते हैं।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन
    1. 10 मिनट के लिए ट्राइटन एक्स (पीबीएसटी; 0.01%) के साथ पीबीएस के साथ नमूने को तीन बार धोएं।
    2. पीबीएसटी को हटा दें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएसटी (तालिका 1) में बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) ब्लॉकिंग बफर 10% जोड़ें।
    3. ब्लॉकिंग बफर को हटा दें और प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण (1: 500 चूहे की -67 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और 1: 500 खरगोश क्लीवर कैसपेज़ -3 एंटीबॉडी) युक्त पीबीएस के प्रति कुएं में 200 μL जोड़ें; सामग्री की तालिका देखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, नमूने को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    5. शेकर (कम गति) पर पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए कुओं को तीन बार धोएं।
    6. पीबीएस को हटा दें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी (1:200 गधा एंटी-रैट आईजीजी (एच + एल) अत्यधिक क्रॉस-अधिशोषित द्वितीयक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लुर 488 और 1:200 गधा एंटी-खरगोश आईजीजी (एच + एल) अत्यधिक क्रॉस-अधिशोषित द्वितीयक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लुर 647; सामग्री की तालिका देखें) के मिश्रण वाले पीबीएस के प्रति कुएं 200 μL के साथ प्रतिस्थापित करें।
    7. एक बहुउद्देशीय शेकर पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने धोएं।
    8. पीबीएस को निकालें और 1 मिनट के लिए पीबीएस (1: 5,000) में पतला 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) के प्रति कुएं में 200 μL जोड़ें।
    9. DAPI को निकालें ( सामग्री की तालिका देखें) और पीबीएस में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोएं।
    10. अच्छी तरह से फ्रेम निकालें और प्रत्येक कुएं पर पीबीएस: ग्लिसरॉल (1: 1) के 50 μL जोड़ें और कवरस्लिप के साथ कवर करें।
    11. स्लाइड्स को नेल पॉलिश से सील करें।
    12. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करके 20x पर छवियों को प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

3. ट्यूमर सेल प्रसार और एपोप्टोसिस का परिमाणीकरण और विश्लेषण

नोट: ट्यूमर सेल प्रसार और एपोप्टोसिस पर विभिन्न β-ग्लूकेन के संभावित प्रभाव को मापने के लिए, इमेजजे सॉफ्टवेयर में एक इन-हाउस स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था ताकि Ki67 (प्रसार) और cCasp3 (एपोप्टोसिस) 13 के सकारात्मक पिक्सेल की संख्या निर्धारित की जा सके।

  1. छवि जे खोलें। प्लगइन्स बटन पर क्लिक करें। प्लगइन फ़ोल्डर में पहले स्थापित एक प्लगइन Coloc2 पर क्लिक करें, और अंत में11 का विश्लेषण करने के लिए छवि का चयन करें।
    नोट: यह प्लगइन डॉ वासिलिकी इकोनोमोपोलोस (veconom@uwo.ca) के साथ पिछले संपर्क के बाद उपलब्ध था। स्क्रिप्ट के बजाय, इमेजजे और फिजी सॉफ्टवेयर दोनों में समान गुणों के साथ कोलोकलाइजेशन विश्लेषण ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए अलग-अलग उपकरण हैं।
  2. नियंत्रण (अनुपचारित, केवल डीएमईएम) स्थितियों के अनुसार थ्रेसहोल्ड सेट करें। ओके बटन पर क्लिक करें।
    नोट: पृष्ठभूमि और तीव्रता विसंगतियों से बचने के लिए, सभी छवियों को समान परिस्थितियों में लिया जाना चाहिए। अधिमानतः, इमेजिंग सत्र उसी दिन किए जाने चाहिए, और माइक्रोस्कोप पैरामीटर छवियों में अपरिवर्तित होना चाहिए।
  3. सुनिश्चित करें कि कोलोकाइज्ड पिक्सेल की परिणामी छवियां और थ्रेशोल्ड से ऊपर पिक्सेल की प्रतिशत या कच्ची संख्या प्रदान करने वाली सारांश विंडो पॉप अप करें। नियंत्रण (अनुपचारित) स्थितियों के संबंध में परिणामों को सामान्य करें।
    नोट: सभी डेटा एसईएम ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग किया गया था। त्रुटियों को माध्य (s.e.m.) (*p < 0.05, *p < 0.01) की मानक त्रुटि के रूप में दर्शाया जाता है।

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Representative Results

β-ग्लूकन का सफल शुद्धिकरण
निष्कर्षण और शुद्धिकरण प्रक्रिया के बाद पी. ओस्ट्रीटस, पी. डीजेमोर, जी. लुसीडम और एच. एरिनेसस के फलने वाले निकायों से प्राप्त एमपी, एसएमपी और एस.एस.जी. के द्रव्यमान को तालिका 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। कवक से प्राप्त एमपी, एसएमपी और एस-जी की मूल संरचना (कुल कार्बोहाइड्रेट, β-ग्लूकन और प्रोटीन) को तालिका 2 में दर्शाया गया है। इन परिणामों से पता चलता है कि प्रोटोकॉल ने एसएमपी में बड़ी मात्रा में प्रोटीन सामग्री की पुनर्प्राप्ति की अनुमति कैसे दी। ग्लूकोमाइलेस और प्रोटीज के α साथ एंजाइमेटिक उपचार ने प्रोटीन की मात्रा को कम कर दिया और β-ग्लूकन एकाग्रता में वृद्धि की।

विभिन्न एस2जी के यूवी स्पेक्ट्रा ने 260 और 280 एनएम (चित्रा 2 ए) पर कोई यूवी अवशोषण शिखर नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि एस2जी में न्यूक्लिक एसिड (260 एनएम) और प्रोटीन (280 एनएम) की कमी थी। इसके अलावा, यूवी-दृश्य अवशोषण स्पेक्ट्रोइलेक्ट्रोकैमिस्ट्री (एसईसी) के बाद एसओजी की समरूपता का परीक्षण किया गया था। क्रोमैटोग्राम (चित्रा 3) ने अच्छी समरूपता दिखाई, जिसमें क्रमशः एच एरिनेसस, जी लुसिडम, पी ओसट्रीटस और पी डीजामोर के लिए 8.20, 10.5, 10,9 और 11.3 मिनट पर एक मुख्य तेज और एकल शिखर था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि अंश होमोपॉलिमर के अनुरूप है। इसके अलावा, अंशांकन वक्र समीकरण (y = -0.0655x + 2.6194) के अनुसार, वजन-औसत Mw की गणना H. एरिनेसस, G. Lucidum, P. ostreatus और P. djamor के लिए क्रमशः लगभग 120.8, 92.8, 80.7 और 75.9 kDA के रूप में की गई थी। आर2 = 0.9951)।

एफटीआईआर स्पेक्ट्रा ने आणविक कंपन को मापा जो सहसंयोजक पॉलीसेकेराइड बॉन्ड (चित्रा 4) के अनुरूप था। स्पेक्ट्रा ने लगभग 3,435 सेमी -1 पर एक व्यापक और तीव्र हाइड्रॉक्सिल समूह का प्रदर्शन किया। इसने पॉलीसेकेराइड14 के अनुरूप लगभग 2,922 सेमी -1 पर एक कमजोर सी-एच-स्ट्रेचिंग शिखर भी दिखाया। इसके अलावा, लगभग 1,641 सेमी -1 पर अवशोषण को एमाइड आई15 को सौंपा जा सकता है, जो सी = ओ और सीएन समूहों के बढ़ाव कंपन से संबंधित है। लगभग 1,154 सेमी -1 पर सिग्नल ग्लाइकोसिडिक लिंकेज16 के सी-ओ-सी असममित खिंचाव के कारण हो सकता है। अंत में, लगभग 1,072 सेमी -1 पर बैंड ने β-ग्लूकन16 के सी-ओ स्ट्रेचिंग का संकेत दिया। 893 सेमी -1 के पास कमजोर अवशोषण β-पाइरानोज के असममित अपवर्तक कंपन के कारण हो सकता है, जो चीनी इकाइयों17 के β-विन्यास को दर्शाता है। कुल मिलाकर, एसयूजी को मुख्य रूप से प्रोटीन की न्यूनतम मात्रा के साथ संयुग्मित कार्बोहाइड्रेट से युक्त पाया गया।

एचपीटीएलसी और जीसी-एमएस द्वारा एस-जी के मोनोसैकराइड प्रोफाइल का आगे अध्ययन किया गया था। डी-गैलेक्टोज और डी-मैनोज की छोटी मात्रा के साथ बड़ी मात्रा में डी-ग्लूकोज की उपस्थिति और डी-ज़ाइलोज़, डी-रेहमनोस, डी-फ्यूकोज़ और एल-अरबिनोज़ के निशान की पुष्टि की गई थी। तालिका 3 में एच. एरिनेसस, जी. लुसिडम, पी. ओसट्रीटस और पी. डीजामोर के एस.जी. के लिए प्राप्त परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम, β-ग्लूकन के साथ पूर्व-सक्रिय, कैंसर कोशिकाओं में प्रेरित एपोप्टोसिस
एक बार चयनित मशरूम से β-ग्लूकन को सफलतापूर्वक अलग और पूरी तरह से विशेषता दी गई, उन्हें माइक्रोग्लिया सेल कल्चर (बीवी 2) में जोड़ा गया। जीएल 261 कोशिकाओं (चित्रा 5) में माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित माध्यम को जोड़ने के 72 घंटे बाद, प्रसार (केआई 67) और एपोप्टोसिस (क्लीवर कैसपेस 3 [सीकैस्प 3]) के लिए दो प्रमुख मार्करों की अभिव्यक्ति को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मापा गया था। इमेजजे सॉफ्टवेयर में एक इन-हाउस स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए, प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए सकारात्मक पिक्सेल की संख्या निर्धारित की गई थी, और इस प्रकार जिस तरह से β-ग्लूकन-प्रेरित माइक्रोग्लियल सक्रियण का संभावित प्रभाव ट्यूमर कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है, उसका विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक फ्लोरोफोरे की तीव्रता के लिए एक सीमा के रूप में नियंत्रण नमूने का उपयोग करते हुए, स्क्रिप्ट ने पिक्सेल की संख्या प्रदान की और इस प्रकार, विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बाद प्रत्येक मार्कर के लिए अभिव्यक्ति का संकेत दिया (चित्रा 6)।

दिलचस्प बात यह है कि जीएल 261 को विभिन्न माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित मीडिया (चित्रा 7) के संपर्क में आने के बाद ट्यूमर प्रसार के बारे में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हुआ। हालांकि, पी डीजामोर (बी) और एच एरिनेसस (सी) ने सीकैस्प 3 का एक मजबूत प्रेरण (लगभग छह गुना और नौ गुना वृद्धि, क्रमशः) दिखाया।

Figure 1
चित्र 1: अलगाव प्रोटोकॉल। पी. स्ट्रीटस, पी. डीजामोर, एच. एरिनेसस और जी. ल्यूसिडम से एस-जी तैयारी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: β-ग्लूकन का यूवी स्पेक्ट्रा। (ए) पी ओस्ट्रीटस, (बी) जी ल्यूसिडम, (सी) पी डीजेमोर, और (डी) एच एरिनेसस के 200-400 एनएम क्षेत्र में यूवी स्पेक्ट्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राम। (ए) पी ओस्ट्रीटस, (बी) जी लुसिडम, (सी) पी डीजामोर, और (डी) एच एरिनेसस के आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एफटीआईआर स्पेक्ट्रा। फूरियर-ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड (एफटीआईआर) स्पेक्ट्रा (ए) पी ओस्ट्रीटस, (बी) जी लुसिडम, (सी) पी डीजेमोर, और (डी) एच एरिनेसस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सह-उत्तेजना परख का योजनाबद्ध। सह-उत्तेजना परख जहां माउस माइक्रोग्लिया (बीवी 2) कोशिकाओं को β-ग्लूकन के साथ 72 घंटे के लिए लेपित किया गया था। क्रायोसंरक्षित और फ़िल्टर किए जाने के बाद, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और 72 घंटे के लिए जीएल 261 सेल कल्चर (25%) में स्थानांतरित कर दिया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रसार और एपोप्टोसिस छवियां। इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां DAPI (नीला), Ki67 (हरा), और cCasp3 (लाल) के साथ GL261 के ट्रिपल कोलोकलाइजेशन को दिखाती हैं। 'प्रोब कोलोक' स्क्रिप्ट (नीचे की छवियां) ने प्रत्येक मार्कर से सकारात्मक पिक्सेल की संख्या निर्धारित करने और उनके बीच कोलोकलाइजेशन की अनुमति दी। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रसार दर और एपोप्टोसिस की मात्रा। माइक्रोग्लिया-वातानुकूलित मध्यम प्रदर्शनी के बाद जीएल 261 कोशिकाओं में Ki67 (बाएं) और cCasp3 (दाएं) अभिव्यक्ति की नियंत्रण स्थितियों (DMEM) के संबंध में सामान्यीकृत मान। (A) प्लुरोटस ओस्ट्रीटस, (बी) प्लुरोटस डीजेमोर, (सी) हेरिशियम एरिनेसस वाई, (डी) गैनोडर्मा ल्यूसिडम। त्रुटियों को s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01) के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमपी (जी) SMP (g) SβGs (g)
पी. ओस्ट्रीटस 201.3 ± 2.2 14.4 ± 0.9 (7.1%) 5.3 ± 0.2 (2.6%)
पी. डी. जामोर 200.8 ± 1.9 13.5 ± 0.6 (6.7%) 4.9 ± 0.3 (2.4%)
जी. ल्यूसिडम। 201.8 ± 1.6 14.7 ± 1.2 (7.3%) 5.5 ± 0.2 (2.7%)
एच. एरिनेसस। 204.2 ± 1.2 15.4 ± 0.8 (7.5%) 5.7 ± 0.2 (2.8%)

तालिका 1: ग्लूकन सामग्री की तालिका। पी. ओस्ट्रीटस, पी. डीजेमोर, जी. लुसीडम और एच. एरिनेसस के फलने वाले निकायों से एमपी, एसएमपी और एस.एस.जी. प्राप्त करने के लिए द्रव्यमान संतुलन।

सांसद SMPs SβGs
सीएचटी (%) 67.3 ± 1.9 53.8 ± 2.3 90.1 ± 1.2
पी. ओस्ट्रीटस β-ग्लूकन (%) 22.7 ± 1.4 31.3 ± 2.4 89.4 ± 2.3
प्रोटीन (%) 21.5±0.9 19.6 ± 0.8* 0.4 ± 0.1*
सीएचटी (%) 68.3 ± 2.1 61.4 ± 3.1 93.4 ± 1.1
पी. डी. जामोर β-ग्लूकन (%) 24.3 ± 2.8 30.8 ± 3.5 91.3 ± 3.4
प्रोटीन (%) 19.9 ± 1.0 22.3 ± 1.1* 0.9 ± 0.2 *
जी. ल्यूसिडम। सीएचटी (%) 66.4 ± 1.8 56.8 ± 2.9 93.7 ± 0.9
β-ग्लूकन (%) 22.5 ± 1.9 24.9 ± 3.1 92.0 ± 2.6
प्रोटीन (%) 18.9 ± 0.8 21.4 ± 0.6* 1.5 ± 0.4*
एच. एरिनेसस। सीएचटी (%) 67.4 ± 1.2 58.9 ± 1.9 93.8 ± 1.4
β-ग्लूकन (%) 23.9 ± 1.6 35.9 ± 2.1 91.8 ± 2.8
प्रोटीन (%) 17.6 ± 1.3 22.7 ± 1.8* 1.3 ± 0.2 *

तालिका 2: कुल कार्बोहाइड्रेट। कुल कार्बोहाइड्रेट (सीएचटी), β-ग्लूकन और एमपी, एसएमपी और एस2जी के प्रोटीन की शुष्क वजन (जी) सामग्री। (*, लोरीविधि 9 द्वारा निर्धारित प्रोटीन)।

डी-ग्लूक (%) डी-मैन (%) डी-गाला (%) डी-फुको (%) D-Xylo (%) डी-रेहम (%) एल-अरब (%)
एच. एरिनेसस। 91.6 ± 0.6 3.8 ± 0.1 2.1 ± 0.2 0.5 ± 0.2 0.8 ± 0.2 0.3 ± 0.1 n.d
जी. ल्यूसिडम। 94.3 ± 0.8 2.6 ± 0.2 1.9 ± 0.2 0.3 ± 0.1 0.9 ± 0.2 एन.डी. 0.4 ± 0.1
पी. ओस्ट्रीटस 93.8 ± 0.5 4.4 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.4 ± 0.1 एन.डी. एन.डी. एन.डी.
पी. डी. जामोर 95.2 ± 0.7 1.7 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.3 ± 0.1 एन.डी. एन.डी. एन.डी.

तालिका 3: मोनोसेकेराइड का लक्षण वर्णन। ओस्ट्रीटस, पी. डीजेमोर, जी. लुसीडम और एच. एरिनेसस (एन.डी., कुछ मोनोसैकराइड्स का पता नहीं लगाया जा सकता था) के एस.एस.जी. के मोनोसैकराइड प्रोफाइल।

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Discussion

यह काम चार अलग-अलग कवक से एसआईजी की सामग्री को सफलतापूर्वक अलग करने, शुद्ध करने और चिह्नित करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित तकनीकों के उपयोग का वर्णन करता है। परिणामों से पता चला कि कैसे पी. ओस्ट्रीटस, पी. डजामोर, जी. लुसीडम और एच. एरिनेसस से प्राप्त एसएमपी के गर्म पानी के निष्कर्षण के बाद, α-एमाइलेज, ग्लूकोसिडेज और प्रोटीज के साथ हाइड्रोलाइटिक उपचार के बाद, α-ग्लूकन और प्रोटीन की सामग्री कम हो गई, इस प्रकार शुद्ध एस2जी की मात्रा में काफी वृद्धि हुई।

इसके बावजूद, हमने देखा कि शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान अधिकांश फंगल β-ग्लूकन पानी-अघुलनशील थे। अध्ययन की मुख्य रुचि उनके चिकित्सा / दवा गुणों10,18 के कारण एसयूजी थी। इसके अलावा, हाइड्रोलाइटिक प्रसंस्करण, इथेनॉल वर्षा और डायलिसिस के लिए धन्यवाद, घुलनशील कम आणविक-भार कार्बोहाइड्रेट, पेप्टाइड्स, ऑलिगोपेप्टाइड्स और अमीनो एसिड को सफलतापूर्वक एसएमपी से हटा दिया गया था, जो एक अलग प्रकार के मशरूम का उपयोग करके अन्य पिछले कार्यों के समान दक्षता दिखा रहा था, लेकिन समान प्रक्रियाओं के साथ19,20।

एस2जी की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न एसओजी के यूवी स्पेक्ट्रा की जांच यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा की गई थी, जिसमें 200-400 एनएम क्षेत्र में नमूने स्कैन किए गए थे। 260 और 280 एनएम पर कोई यूवी अवशोषण शिखर नहीं देखा गया था, यह दर्शाता है कि एस-जी में न तो न्यूक्लिक एसिड (260 एनएम) और न ही प्रोटीन (280 एनएम) थे, इस प्रकार फिर से दिखाया गया कि β-ग्लूकन मुख्य रूप से एस-जी का गठन करते हैं। हालांकि 200-400 एनएम के क्षेत्र में यूवी स्पेक्ट्रा ने 280 एनएम पर किसी भी परिभाषित / तेज पिक की अनुपस्थिति दिखाई, फिर भी एक छोटा शिखर देखा जा सकता है। इसे तालिका 2 में दिखाए गए परिणामों से सहमत पॉलीसेकेराइड-बाध्य प्रोटीन की एक छोटी मात्रा की उपस्थिति से समझाया जा सकता है। हालांकि, यह विचार करना दिलचस्प है कि पॉलीसेकेराइड की इतनी नगण्य मात्रा को शेष प्रोटीन तक देरी से पहुंच द्वारा भी समझाया जा सकता है, जिसे ग्लूकन द्वारा या स्टेरिक प्रभावों द्वारा परिरक्षित किया जा सकता है जो ग्लूकन-बाध्य प्रोटीन के पूर्ण क्षरण को रोकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एसईसी द्वारा एसयूजी की समरूपता का आगे परीक्षण किया गया था, एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक तकनीक जिसका उपयोग आकार से विघटित अणुओं को शुद्ध करने के लिए किया जाता है, जिसने प्रोटोकॉल परिणामों की पुष्टि की।

इसके अतिरिक्त, एफटीआईआर स्पेक्ट्रा का उपयोग सहसंयोजक पॉलीसेकेराइड बॉन्ड के अनुरूप आणविक कंपन को मापने के लिए किया गया था। जैसा कि पहले वर्णित है, सभी चार कवक के लिए समान स्पेक्ट्रा प्राप्त किए गए थे। स्पेक्ट्रा सुविधा ने पॉलीसेकेराइड14, एमाइड आई 15 और β-ग्लूकेन16 की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। 893 सेमी -1 के पास कमजोर अवशोषण ने चीनी इकाइयों17 के β-विन्यास का सुझाव दिया। कुल मिलाकर, एस.एस.जी. मुख्य रूप से न्यूनतम प्रोटीन के साथ संयुग्मित कार्बोहाइड्रेट द्वारा गठित पाए गए थे। इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अणुओं के रूप में एस-जी का उपयोग करने में रुचि के बारे में, यह उजागर करने योग्य है कि पॉलीसेकेराइड-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को अक्सर उनके इम्यूनोमॉड्यूलेटरीलाभों के लिए नोट किया जाता है।

अंत में, एचपीटीएलसी और जीसी-एमएस द्वारा एस-जी के मोनोसैकराइड प्रोफाइल का अध्ययन किया गया था। डी-गैलेक्टोज और डी-मैननोज की छोटी मात्रा के साथ बड़ी मात्रा में डी-ग्लूकोज की उपस्थिति और डी-ज़ाइलोज़, डी-रेम्नोज़ और डी-फ्यूकोज़ के निशान सख्ती से दर्शाते हैं कि एस-जी में प्रमुख घटक β-ग्लूकन है। हालांकि, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि हमारी शुद्धि करण प्रणाली विभिन्न शास्त्रीय प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने से उत्पन्न होती है। हम वर्तमान में कई चरणों में सुधार करने पर काम कर रहे हैं, मुख्य रूप से क्रोमैटोग्राफी तकनीकों (आकार बहिष्करण और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी) पर केंद्रित हैं।

इस काम के मुख्य उद्देश्य के बारे में, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर β-ग्लूकन के प्रभाव का परीक्षण करना था, एक बार चार अलग-अलग प्रकार के β-ग्लूकन को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के बाद, माइक्रोग्लिया के सक्रियण पर उनके संभावित प्रभावों का परीक्षण किया गया था। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग प्रसार और एपोप्टोसिस22,23 के लिए दो स्वर्ण-मानक मार्करों के खिलाफ किया गया था।

ट्यूमर प्रसार दर में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं होने के बावजूद, पी ओस्ट्रीटस (ए) और एच एरिनेसस (सी) कि67 अभिव्यक्ति को 50% तक छोड़ने में सक्षम थे। जी ल्यूसिडम के बारे में अध्ययन में उच्च भिन्नता के कारण महत्व की कमी की संभावना है। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोसिस का प्रेरण एक दिलचस्प चिकित्सीय दृष्टिकोण है, और पी. डीजामोर (बी) और एच. एरिनेसस (सी) ने सीकैस्प 3 स्तरों का एक महत्वपूर्ण प्रेरण दिखाया, जो कोशिका मृत्यु कार्यक्रम के सक्रियण का सुझाव देता है। ये सभी परिणाम पिछले अध्ययनों के अनुसार हैं जो अन्य प्रकार के ट्यूमर24,25 में इन कवक के एंटी-ट्यूमरल प्रभाव को दिखाते हैं। प्रयोगों को डुप्लिकेट में किया गया था, समान स्थितियों को बनाए रखते हुए और एक ही जांचकर्ताओं के नेतृत्व में। इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययनों के परिणामों का सॉफ्टवेयर-आधारित विश्लेषण एक निष्पक्ष दृष्टिकोण का समर्थन करता है और इस अध्ययन की संभावित पहुंच को बढ़ाता है।

सामान्य तौर पर, इन अध्ययनों में β-ग्लूकन के उपयोग के बारे में एक मुख्य चुनौती है, जो यौगिकों की शुद्धता है। यह पुष्टि करने के लिए उच्चतम मानकों का पीछा करना अनिवार्य है कि प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में उनके उपयोग के बाद देखे गए प्रभाव, विशेष रूप से कार्बोहाइड्रेट द्वारा उत्तेजित होते हैं, न कि प्रोटीन या अन्य संरचनाओं के कारण जो शुद्धिकरण पर्याप्त रूप से नहीं किए जाने पर उनसे जुड़े रह सकते हैं। एक अतिरिक्त कदम जिसे भविष्य के अध्ययनों में माना जा सकता है वह क्रोमैटोग्राफी तकनीकों (जैसे, आयन विनिमय या आकार बहिष्करण) का उपयोग है।

अध्ययन के बाद समग्र निष्कर्ष एच एरिनेसस को ग्लियोब्लास्टोमा के उपचार के लिए एक संभावित इम्यूनोथेराप्यूटिक विकल्प के रूप में शीर्ष उम्मीदवार के रूप में रखता है, क्योंकि ट्यूमर प्रसार (~ 50%) को छोड़ने और ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु कार्यक्रम के मजबूत सक्रियण को प्रेरित करने की क्षमता के कारण।

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Disclosures

घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम इमेजजे में फुलयूरेसेंस सिग्नल को मापने के लिए अपनी इन-हाउस स्क्रिप्ट के लिए डॉ वासिलिकी इकोनोमोपोलोस को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम प्रदर्शन के दौरान उनके समर्थन के लिए CITIUS (सेविले विश्वविद्यालय) और उनके सभी कर्मियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्पेनिश फेडर I + D + i-USE, US-1264152 सेविले विश्वविद्यालय से, और मिनिस्टरियो डी सिएनसिया, Innovacion y Universidades PID2021-126090OA-I00 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chamber slides Thermo Fisher, USA 171080
Air-drying oven J.P. Selecta S.A., Spain 2000210
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis A7030
Alcalase Novozymes, Denmark protease
Alexa Fluor 488 Thermofisher, USA A32731
Alexa Fluor 647 Thermofisher, USA A32728
Blade mill Retsch, Germany  SM100
Bovine Serum Albumin MERK, Germany A9418
Cellulose tubing membrane Sigma-Aldrich, St. Louis D9402
Centrifuge MERK, Germany Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins ImageJ (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI MERK, Germany 28718-90-3
Dextrans Pharmacosmos, Holbalk, Denmark Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA 10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA A4736301
FT-IR spectromete Bruker-Vertex, Switzerland VERTEX 70v
Graphing and analysis software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system Waters Corp, Milford, MA, USA Waters 2695 HPLC
Incubator Eppedorf Galaxy 170S
Mass Spectometer Q Exactive GC, Thermo Scientific 725500
Paraformaldehyde MERK, Germany P6148
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis P4458
pH meter Crison, Barcelona, Spain Basic 20
Phosphate-buffered saline Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA 1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Abcam, UK ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal Thermofisher, USA MA5-14520
Rotary evaporator Büchi Ibérica S.L.U., Spain El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) Waters Corp, Milford, MA, USA WAT011545
UV-Visible spectrophotometer Amersham Bioscience, UK Ultrospec 2100 pro
VectaMount Vector Laboratories, C.A, USA H-5000-60
Water bath J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland K-BGLU
β-glucans Setas y Hongos del Sur, S.L. Supplied the four variants of mushrooms

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तंत्रिका विज्ञान अंक 196 β-ग्लूकन एचपीएलसी मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्लियोब्लास्टोमा माइक्रोग्लिया इम्यूनोफ्लोरेसेंस
ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक इम्यूनोथेरेपी रणनीति के रूप में फंगल β-ग्लूकन का अलगाव और शुद्धिकरण
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Folgado-Dorado, C., Caracena-De La Corte, J., Aguilera-Velázquez, J. R., Santana-Villalona, R., Rivera-Ramos, A., Carbonero-Aguilar, M. P., Talaverón, R., Bautista, J., Sarmiento Soto, M. Isolation and Purification of Fungal β-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (196), e64924, doi:10.3791/64924 (2023).

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