Summary
Den foreliggende protokollen beskriver rensetrinnene og påfølgende studier av fire forskjellige sopp- β-glukaner som potensielle immunmodulerende molekyler som forbedrer de antitumorale egenskapene til mikroglia mot glioblastomceller.
Abstract
En av de største utfordringene ved å utvikle effektive terapier mot glioblastom er å overvinne den sterke immunundertrykkelsen i tumormikromiljøet. Immunterapi har dukket opp som en effektiv strategi for å snu immunsystemresponsen mot tumorceller. Gliomassosierte makrofager og mikroglia (GAM) er viktige drivere for slike antiinflammatoriske scenarier. Derfor kan forbedring av anti-kreftresponsen i GAMs representere en potensiell co-adjuvant behandling for å behandle glioblastompasienter. På den måten har sopp- β-glukanmolekyler lenge vært kjent som potente immunmodulatorer. Deres evne til å stimulere den medfødte immunaktiviteten og forbedre behandlingsresponsen er beskrevet. Disse modulerende egenskapene tilskrives delvis deres evne til å binde seg til mønstergjenkjenningsreseptorer, som interessant nok uttrykkes sterkt i GAM. Dermed er dette arbeidet fokusert på isolering, rensing og etterfølgende bruk av sopp- β-glukaner for å forbedre tumoricid respons av mikroglia mot glioblastomceller. Musen glioblastom (GL261) og microglia (BV-2) cellelinjer brukes til å teste immunmodulerende egenskaper av fire forskjellige sopp β-glukaner ekstrahert fra sopp tungt brukt i dagens biofarmasøytiske industri: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum. For å teste disse forbindelsene ble det utført kostimuleringsanalyser for å måle effekten av et preaktivert mikrogliabetinget medium på proliferasjon og apoptoseaktivering i glioblastomceller.
Introduction
Til tross for fremkomsten av nye prestasjoner innen nevro-onkologi, forblir forventet levetid for glioblastompasienter mager. Gullstandardbehandlinger mot hjernesvulster er basert på sammenslåing av kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men i det siste tiåret har immunterapi dukket opp som en kraftig strategi for å behandle ulike typer kreft1. Dermed har muligheten for å utnytte kroppens immunrespons mot tumorceller nylig blitt den fjerde søylen i onkologi.
Det har lenge vært kjent at en av de største utfordringene i feltet er å overvinne den sterke immunsuppresjonen som finnes i tumormikromiljøet2. Spesielt i tilfelle av glioblastom, en av de vanligste og mest aggressive former for hjernekreft, unraveling viktige veier som orkestrerer slike pro-tumorale scenarier og finne nye forbindelser som kan motvirke immunsystemets deprimerende respons, kan bane vei for fremtidige terapier mot denne uhelbredelige sykdommen.
Hjernen har sine egne immunsystemceller, og den mest aktuelle celletypen er mikroglia. Disse cellene har vist seg å ha en ganske kompleks oppførsel på tvers av ulike sentrale sykdommer3. I tilfelle av primære hjernesvulster (f.eks. Glioblastom), blir disse cellene skiftet mot en antiinflammatorisk fenotype som støtter tumorceller for å kolonisere hjerneparenkymet3. Tallrike publikasjoner har forbedret hovedrollen til disse cellene under tumorprogresjon. En av hovedårsakene til dette er at gliomassosiert mikroglia og infiltrerte makrofager (GAM) står for en tredjedel av den totale tumormassen, noe som tyder på den utvetydige innflytelsen av deres aktiveringstilstander under hjernesvulstprogresjon 4,5.
På den måten har sopp- β glukaner blitt beskrevet som potente molekyler som utløser effektive immunresponser, inkludert fagocytose og proinflammatoriske faktorer, noe som fører til eliminering av skadelige midler 6,7,8,9,10. Fungal β-glukaner har generelt blitt studert ved hjelp av ekstrakter fra forskjellige soppdeler. Tildelingen av spesifikke effekter krever imidlertid rensing for å unngå tvetydigheter og for å kunne forstå virkningsmekanismen til slike molekyler som immunmodulerende midler8.
I dette arbeidet renses løselige β-glukaner fra fruktkroppen til fire forskjellige sopper, regelmessig brukt som spiselige (Pleurotus ostreatus og Pleurotus djamor) og som medisinske (Ganoderma lucidum og Hericium erinaceus) sopp. Spesielt har disse fire soppene stor nytte i næringsmiddel- og farmasøytisk industri og ble produsert innenfor en miljøvennlig sirkulær økonomi i en kommersiell bedrift (se Materialliste).
For å legge grunnlaget for fremtidig bruk av sopp- β-glukaner i hjernekreftbehandlinger, er veldefinerte rensestrategier og prekliniske studier som dykker ned i deres antatte interaksjon med immunsystemceller avgjørende for å evaluere deres potensielle rolle som antitumormediatorer. Dette arbeidet beskriver de mange trinnene av isolasjon og rensing som trengs for å hente de løselige β-glukanene som finnes i fruktkroppene til den valgte soppen. Når de er vellykket renset, aktiveres mikrogliaceller for å forbedre deres inflammatoriske fenotype. Glioblastomceller fra mus (GL261) er belagt med et annet mikrogliabetinget medium, som tidligere er behandlet med disse ekstraktene, og deretter evalueres effekten på tumorcellenes oppførsel. Interessant nok har pilotstudier fra laboratoriet vårt (data ikke vist) avdekket hvordan pro-inflammatorisk mikroglia kan bremse tumorcellemigrasjon og invasjonsegenskaper, ikke bare i glioblastomceller, men også i andre kreftcellelinjer. Dette tverrfaglige arbeidet kan gi et nyttig verktøy for onkologiske forskere for å teste lovende forbindelser som kan øke immunresponsen i mange forskjellige typer svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De fire forskjellige soppvariantene beskrevet i denne protokollen ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Isolering av sopp- β-glukaner
- Ekstraksjon og isolering av løselige sopppolysakkarider
MERK: Løselige sopppolysakkarider (SMP) ble oppnådd i henhold til prosedyren skjematisk vist i figur 1.- Skyll forsiktig fersk P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum fruktlegemer (ca. 2000 g / sopp) i destillert vann fem ganger.
- Tørk fruktlegemene ved 50 ± 2 °C i en vanlig lufttørkeovn til en konstant vekt er nådd (~24 timer).
- Mal de tørkede soppene i en bladmølle, og få ca. 200 g pulver fra hver sopp.
- Suspender 100 g sopppulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum) i 1000 ml H2O d. Deretter autoklav ved 121 ° C i 15 minutter, og til slutt la i romtemperatur i 30 minutter.
- Sentrifuger den resulterende suspensjonen ved 6000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Tørk bunnfallet som inneholder uløselige sopppolysakkarider (IMP) ved 50 ± 2 °C i en lufttørkeovn i 24 timer.
- Kast bunnfallet og behold supernatanten. Konsentrer supernatanten 10 ganger i en roterende fordamper.
- Fell ut konsentratet som inneholder SMP med etanol (80 % sluttkonsentrasjon) ved 4 °C over natten.
- Sentrifuger etanolsuspensjonen ved 6000 x g i 15 minutter ved 4 °C, behold pelleten (bunnfallet) og kast supernatanten med en pipette.
- Vask bunnfallet tre ganger med 80 % etanol før det løses opp i H2O d (10 % w/v). Juster pH til 6,5/7 og temperaturen til 37 °C, og behandle med henholdsvis 2 U og 4 U α-amylase og glukoamylase for å oppløse α-glukaner i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse).
- Etter behandling med α-amylase/glukoamylase, juster pH og temperatur til henholdsvis 8,0 og 50 °C, og behandle med alkalase (2,5 E/g protein) (se materialtabell) for å solubilisere proteinene.
MERK: Denne sekvensielle enzymatiske behandlingen fjerner de fleste α glukaner og proteiner som felles ut med β-glukaner i etanolutfellingen. - Etter hydrolyse sentrifugerer du hydrolysatet ved 6000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og det rene supernatantkonsentratet fem ganger i en roterende fordamper. Fell igjen med 80% etanol.
- Solubiliser det resulterende bunnfallet i H2O d og dialyser i destillert vann i 24 timer ved bruk av celluloserørmembraner (12.000 Da cut-off membraner, se materialtabell) for å fjerne molekyler med lav molekylvekt. Gjenvinn den vannløselige delen og frysetørke den for å produsere løselige β-glukaner (SβGs).
- Sukker- og proteinmåling
- Mål det totale sukkerinnholdet i hver fraksjon ved fenol-svovelsyremetoden, ved bruk av glukose som standard8.
MERK: Kvantifisering av β-glukaninnholdet kan også gjøres ved å bruke β-glukananalysesettet (sopp og gjær; se materialfortegnelse), basert på enzymatisk hydrolyse og aktiviteten til oksidoreduktaser: nemlig exo-1,3-β-glukanase, glukoseoksidase, β-glukosidase og peroksidase, med den påfølgende dannelsen av kinonimin. Følg produsentens instruksjoner, med små modifikasjoner. - Bruk 18 MH 2SO 4 i stedet for 12 MH2SO4.
- Vurder innholdet av de totale glukanene og α-glukanene separat.
- Mål de resulterende β-glukanverdiene som forskjellen mellom de totale glukan- og α-glukanverdiene (triplikat) etter Kjeldahl-protokollen. I visse tilfeller kan proteininnhold bestemmes av Lowry-metoden, ved hjelp av albumin for å plotte kalibreringskurven11,12.
- Mål det totale sukkerinnholdet i hver fraksjon ved fenol-svovelsyremetoden, ved bruk av glukose som standard8.
- Analyse av ultrafiolett absorpsjonsspektroskopi
- Oppnå SβG ultrafiolett (UV) spektra ved hjelp av et UV-synlig spektrofotometer (se materialtabell) ved å skanne prøvene i 200-400 nm regionen (figur 2).
- Tilbered 1,0 mg/ml av hver SβG i H2Od, overfør oppløsningen til en kvartskuvette, og skann ved romtemperatur.
- Analyse av molekylvektfordeling
- Estimere homoegeniteten til SβG og molekylvekten til polymerer ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) ved bruk av et høyytelses væskekromatografisystem (HPLC) (se materialtabell) utstyrt med en brytningsindeksdetektor og en ultrahydrogel lineær gelfiltreringskolonne (300 mm x 7,8 mm; Figur 3).
- Utføre analysen ved 40 °C ved bruk av avionisert vann som eluent ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min-1 og dextrans (110, 80 og 50 kDa) som standarder (se materialfortegnelse). Samle en 5 ml fraksjon.
- Fourier-transform infrarød (FTIR) analyse
- Ta opp de infrarøde spektrene (figur 4) på et FTIR-spektrometer i området 4000-500 cm-1. Prøvene skal tidligere blandes med KBr for å danne filmer (standard FTIR-prosedyre; se produsentens instruksjoner og materialfortegnelse).
- Molekylær sammensetningsanalyse
- Estimere molekylære sammensetninger av SβG ved høyytelses tynnsjiktskromatografi (HPTLC) samt gasskromatografi koblet til massespektrometri (GC-MS), etter standardprosedyrer12.
2. In vitro-studie av β-glukanindusert mikrogliastimulering
- Cellekultur av mus glioblastom og microglia celler i 8-brønns kammer lysbilder
MERK: Denne protokollen er spesifikk for GL261 (glioblastom) og BV2 (mikroglia) cellelinjer. Men med små modifikasjoner kan disse trinnene potensielt brukes til å studere andre kreft- og immuncellelinjer.- Forbered Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) komplett medium modifisert med L-glutamin, 4,5 g / L D-glukose og uten pyruvat. Tilsett 10% av føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (se materialfortegnelse). Forvarm materialet i et vannbad ved 37 °C i 15 minutter.
- Tin frosne BV2- og GL261-alikoter i et vannbad (37 °C) i 2 minutter, og like før de tiner helt, bær dem inn i en laminær strømningshette og plate cellene i to forskjellige sterile T25-kolber (en for hver cellelinje).
- Inkuber T25-kolbene ved 37 °C, 5% CO2 til kulturen er sammenflytende.
MERK: Avhengig av fryseforholdene og tiden under kryopreservering, kan tiden til samløpet variere. Disse cellelinjene krever vanligvis mellom 3 og 5 dager for å nå sammenløp i en T75-kolbe. - Etter at BV2-cellekulturen blir sammenflytende, overfør den til 8-brønns kammerlysbilder 0,6 x 106 celler / brønn. Hold 8-brønnkammerets lysbilder i inkubatoren i 24 timer.
- Når mikrogliacellene er belagt inn i 8-brønns kammerlysbildene, gjenta den samme protokollen med GL261-cellene.
- Aktivering av mikroglia med β-glukaner
- Belegg BV2-cellene med fire forskjellige β-glukaner (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus) i en 0,2 mg/ml konsentrasjon i 72 timer. En eksperimentell tilstand må forbli ubehandlet (normalt medium), som fungerer som kontrollgruppe.
- Samle supernatanten med en pipette etter 72 timer og før det gjenværende volumet gjennom et 0,20 mikrom sprøytefilter. Supernatanten fryses deretter ved -80 °C i minst 24 timer.
- Behandling av GL261 med preaktivert mikrogliabetinget medium
- Når GL261 er 80 % konfluent i de 8-brønns kammerlysbildene, tilsett β-glukanbehandlet mikrogliamedium (trinn 2.2.2) ved en endelig volumkonsentrasjon på 25 % i 72 timer (totalt volum: 250 μl/brønn).
- Fjern mediet etter 72 timers inkubasjon og kast det.
- Vask cellene med fosfatbuffer saltvann (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre ganger i 5 minutter.
- Fiks cellene ved å tilsette 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C i 15 minutter.
MERK: Avhengig av de forskjellige antistoffene som kan brukes til immunfluorescens, kan fikseringsmetoder avvike fra typisk 4% PFA. Alkoholbaserte fikseringsmidler kan være mer effektive for å bevare visse epitoper.
- Immunfluorescensstudie
- Vask prøvene med PBS med triton X (PBST; 0,01%) i 10 min tre ganger.
- Fjern PBST og tilsett bovint serumalbumin (BSA) blokkeringsbuffer 10 % i PBST (tabell 1) i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsbufferen og tilsett 200 μL per brønn av PBS som inneholder den primære antistoffblandingen (1:500 rotte Ki-67 monoklonalt antistoff og 1:500 kaninspaltet caspase-3 antistoff; se materialfortegnelse). Inkuber over natten ved 4 °C.
- Etter 24 timers inkubasjon ved 4 °C, la prøvene stå i romtemperatur i 30 minutter.
- Vask brønnene tre ganger i 10 min med PBS på en shaker (lav hastighet).
- Fjern PBS og erstatt med 200 μL per brønn av PBS som inneholder blandingen av sekundære antistoffer (1:200 esel anti-rotte IgG (H + L) høyt kryssadsorbert sekundært antistoff, Alexa Fluor 488 og 1:200 esel anti-kanin IgG (H + L) høyt kryssadsorbert sekundært antistoff, Alexa Fluor 647; se materialfortegnelse) i 45 min ved romtemperatur i mørket.
- Vask prøvene med PBS i 10 min på en flerbruksshaker.
- Fjern PBS og tilsett 200 μL per brønn med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i PBS (1:5,000) i 1 min.
- Fjern DAPI (se materialfortegnelse) og vask cellene i 5 min i PBS.
- Fjern brønnrammen og tilsett 50 μL PBS: glyserol (1: 1) på hver brønn og dekk med en deksel.
- Forsegl lysbildene med neglelakk.
- Ta bilder ved 20x ved hjelp av et konfokalmikroskopsystem (se Materialfortegnelse).
3. Kvantifisering og analyse av tumorcelleproliferasjon og apoptose
MERK: For å måle den potensielle effekten av de forskjellige β-glukanene på tumorcelleproliferasjon og apoptose, ble et internt skript brukt i ImageJ-programvaren for å kvantifisere antall positive piksler av Ki67 (spredning) og cCasp3 (apoptose)13.
- Åpne ImageJ. Klikk på Plugins-knappen . Klikk på Coloc2, et plugin som tidligere er installert i plugin-mappen, og velg til slutt bildet du vil analysere11.
MERK: Dette pluginet var tilgjengelig etter tidligere kontakt med Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). I stedet for skriptet har både ImageJ- og Fiji-programvaren forskjellige verktøy for samlokaliseringsanalyse (se Materialfortegnelse), med lignende egenskaper. - Angi terskler i henhold til kontrollbetingelsene (ubehandlet, bare DMEM). Klikk på OK-knappen .
MERK: For å unngå bakgrunns- og intensitetsavvik, må alle bilder tas under de samme forholdene. Fortrinnsvis bør bildebehandlinger utføres samme dag, og mikroskopparametere uendret på tvers av bilder. - Sørg for at de resulterende bildene av de samlokaliserte bildepunktene og et sammendragsvindu som gir prosentandelen eller råantallet piksler over terskelen, vises. Normaliser resultatene med hensyn til kontrollforholdene (ubehandlede).
MERK: Alle data er gitt som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av grafisk og analyse programvare (se Tabell over materialer). En enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest ble brukt. Feil er representert som standardfeil for gjennomsnittet (s.e.m.) (*p < 0.05, **p < 0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket rensing av β-glukaner
Massen av MP, SMP og SβG oppnådd fra fruktlegemer av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus etter ekstraksjons- og renseprosessen er oppsummert i tabell 1. Den grunnleggende sammensetningen (totale karbohydrater, β-glukaner og protein) av MP, SMP og SβG oppnådd fra soppene er vist i tabell 2. Disse resultatene viser hvordan protokollen tillot gjenfinning av en stor mengde proteininnhold i SMP-er. Den enzymatiske behandlingen med α-amylase/glukoamylase og protease reduserte imidlertid mengden protein og økte β-glukankonsentrasjonen.
UV-spektra av de forskjellige SβG-ene viste ingen UV-absorpsjonstopper ved 260 og 280 nm (figur 2A), noe som indikerer at SβG manglet nukleinsyrer (260 nm) og proteiner (280 nm). Videre ble homogeniteten til SβG testet etter UV-synlig absorpsjonsspektroelektrokjemi (SEC). Kromatogrammene (figur 3) viste god homogenitet, med en hovedskarp og enkel topp på henholdsvis 8,20, 10,5, 10,9 og 11,3 min for H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor. Disse dataene antyder at fraksjonen er konsistent med homopolymerer. Videre ble vektgjennomsnittet Mw beregnet til rundt 120,8, 92,8, 80,7 og 75,9 kDa for henholdsvis H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor, i henhold til kalibreringskurveligningen (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
FTIR-spektrene målte molekylære vibrasjoner som korresponderte med kovalente polysakkaridbindinger (figur 4). Spektrene viste en bred og intens hydroksylgruppe på rundt 3,435 cm-1. Den viste også en svak C-H-strekking på rundt 2 922 cm-1, tilsvarende polysakkarider14. Videre kan absorbansen på rundt 1,641 cm-1 tilordnes amid I15, relatert til forlengelsesvibrasjonene til C = O- og CN-gruppene. Signalet rundt 1,154 cm-1 kan skyldes C-O-C asymmetrisk strekking av den glykosidiske bindingen16. Til slutt indikerte båndet på rundt 1,072 cm-1 C-O strekking av β-glukaner16. Den svake absorpsjonen nær 893 cm-1 kan skyldes den asymmetriske brytningsvibrasjonen til β-pyranose, som viser β-konfigurasjonen av sukkerenheter17. Totalt sett ble SβG funnet å hovedsakelig bestå av karbohydrat konjugert med en minimal mengde protein.
Monosakkaridprofilen til SβG ble videre studert med HPTLC og GC-MS. Tilstedeværelsen av en stor mengde D-glukose med mindre mengder D-galaktose og D-mannose og et spor av D-xylose, D-rhamnose, D-fukose og L-arabinose ble bekreftet. Tabell 3 oppsummerer resultatene oppnådd for SβG av H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor.
Mikrogliabetinget medium, forhåndsaktivert med β-glukan, indusert apoptose i kreftceller
Når β-glukaner fra de utvalgte soppene ble vellykket isolert og fullstendig karakterisert, ble de tilsatt til mikrogliacellekulturen (BV2). Ved 72 timer etter tillegg av mikrogliabetinget medium til GL261-cellene (figur 5) ble ekspresjonen av to nøkkelmarkører for proliferasjon (Ki67) og apoptose (spaltet caspase 3 [cCasp3]) målt ved immunfluorescens. Ved hjelp av et internt skript i ImageJ-programvaren ble antall positive piksler for hver fluorescerende kanal kvantifisert, og dermed ble den potensielle effekten av β-glukanindusert mikrogliaaktivering kan påvirke tumorcellenes oppførsel analysert. Ved å bruke kontrollprøver som en terskel for intensiteten til hver fluorofor, ga skriptet antall piksler og indikerte dermed uttrykket for hver markør etter de forskjellige eksperimentelle forholdene (figur 6).
Interessant nok led GL261 ingen signifikant forskjell med hensyn til tumorproliferasjon når den ble utsatt for de forskjellige mikrogliabetingede mediene (figur 7). Imidlertid viste P. djamor (B) og H. erinaceus (C) en sterk induksjon (henholdsvis omtrent seks ganger og ni ganger) av cCasp3.
Figur 1: Isolasjonsprotokoll. Skjematisk fremstilling av protokollen for å isolere og rense SβG-preparat fra P. streatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: UV-spektra av β-glukaner. UV-spektra i 200-400 nm regionen av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor, og (D) H. erinaceus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Størrelse ekskluderingskromatogrammer. Størrelseseksklusjonskromatogrammer av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor, og (D) H. erinaceus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: FTIR-spektra. Fourier-transform infrarøde (FTIR) spektra av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor, og (D) H. erinaceus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk fremstilling av kostimuleringsanalysene. Co-stimuleringsanalyse hvor musmikroglia (BV2) celler ble belagt i 72 timer med β-glukaner. Etter å ha blitt kryopreservert og filtrert, ble supernatanten samlet og overført til GL261 cellekultur (25 %) i 72 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sprednings- og apoptosebilder. Immunfluorescensbilder som viser en trippel samlokalisering av GL261 med DAPI (blå), Ki67 (grønn) og cCasp3 (rød). Prob Coloc-skriptet (nederste bilder) tillot kvantifisering av antall positive piksler fra hver markør og samlokalisering blant dem. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kvantifisering av spredningsrater og apoptose. Normaliserte verdier med hensyn til kontrollbetingelsene (DMEM) for Ki67 (venstre) og cCasp3 (høyre) uttrykk i GL261-celler etter den mikrogliabetingede mediumutstillingen. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Feil representeres som s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| MP (g) | SMP-er (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201.3 ± 2.2 | 14,4 ± 0,9 (7,1 %) | 5,3 ± 0,2 (2,6 %) |
| P. Djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7 %) | 4,9 ± 0,3 (2,4 %) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3 %) | 5,5 ± 0,2 (2,7 %) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1.2 | 15,4 ± 0,8 (7,5 %) | 5,7 ± 0,2 (2,8 %) |
Tabell 1: Tabell over glukaninnhold. Massebalanse for å oppnå MP, SMP og SβG fra fruktlegemer av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus.
| MP | SMP-er | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-glukan (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Protein (%) | 21.5±0.9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2.1 | 61,4 ± 3.1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. Djamor | β-glukan (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Protein (%) | 19,9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glukan (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3.1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Protein (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glukan (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2.1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Protein (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabell 2: Totalt karbohydrater. Tørrvekt (g) innhold av totale karbohydrater (CHt), β-glukan og protein av MP, SMP og SβG. Proteininnhold (MP) kvantifisert ved Kjeldah-metoden12. (*, proteiner kvantifisert ved Lowry-metoden9).
| D-Gluc (%) | D-mann (%) | D-galla (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-arabisk (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2.1 ± 0,2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | n.d |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2,6 ± 0,2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | n.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. Djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1.1 ± 0,1 | 0,3 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabell 3: Karakterisering av monosakkarider. Monosakkaridprofil av SβG av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus (n.d., noen monosakkarider var ikke påviselige).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver bruken av veletablerte teknikker for å kunne isolere, rense og karakterisere innholdet av SβG fra fire forskjellige sopp. Resultatene viste hvordan etter varmtvannsekstraksjon av SMP, oppnådd fra P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus, etterfulgt av hydrolytisk behandling med α-amylase, glukosidase og protease, ble innholdet av α-glukan og protein redusert, og dermed betydelig beriket mengden rene SβGs.
Til tross for dette observerte vi at de fleste sopp- β glukanene var vannuløselige under renseprosessen. Hovedinteressen for studien var SβGs, på grunn av deres medisinske/farmasøytiske egenskaper10,18. Videre, takket være hydrolytisk prosessering, etanolutfelling og dialyse, ble løselige karbohydrater med lav molekylvekt, peptider, oligopeptider og aminosyrer vellykket fjernet fra SMP, og viste en lignende effektivitet som andre tidligere arbeider med en annen type sopp, men med lignende prosesser19,20.
For å teste renheten til SβG ble UV-spektrene til de forskjellige SβG-ene undersøkt ved UV-spektrofotometri, og skannet prøvene i 200-400 nm-regionen. Ingen UV-absorpsjonstopper ble observert ved 260 og 280 nm, noe som indikerer at SβG verken hadde nukleinsyrer (260 nm) eller proteiner (280 nm), og viser dermed igjen at β-glukaner hovedsakelig utgjorde SβG. Selv om UV-spektra i området 200-400 nm viste fravær av noe definert/skarpt plukk ved 280 nm, kunne en liten topp fortsatt observeres. Dette kan forklares med tilstedeværelsen av en liten mengde polysakkaridbundne proteiner, som stemmer overens med resultatene vist i tabell 2. Det er imidlertid interessant å tenke på at en slik ubetydelig mengde polysakkarider også kan forklares av forsinket tilgang til de gjenværende proteinene, som kan skjermes av glukaner eller ved steriske effekter som forhindrer fullstendig nedbrytning av glukanbundne proteiner. Det er viktig at homogeniteten til SβG ble ytterligere testet av SEC, en kraftig analytisk teknikk som brukes til å rense oppløste molekyler etter størrelse, som bekreftet protokollresultatene.
I tillegg ble FTIR-spektra brukt til å måle molekylære vibrasjoner tilsvarende kovalente polysakkaridbindinger. Som tidligere beskrevet ble lignende spektra oppnådd for alle fire soppene. Spektrafunksjonen viste tilstedeværelsen av polysakkarider14, amid I 15 og β-glukaner16. Den svake absorpsjonen nær 893 cm-1 antydet β-konfigurasjonen av sukkerenheter17. Totalt sett ble SβG funnet å være hovedsakelig dannet av karbohydrater konjugert med minimalt protein. Når det gjelder interessen for å bruke SβG som immunmodulerende molekyler, er det verdt å fremheve at polysakkarid-proteinkomplekser ofte er kjent for deres immunmodulerende fordeler21.
Endelig ble monosakkaridprofilen til SβG studert av HPTLC og GC-MS. Tilstedeværelsen av en stor mengde D-glukose med mindre mengder D-galaktose og D-mannose og spor av D-xylose, D-rhamnose og D-fukose innebærer strengt at den dominerende komponenten i SβG er β-glukan. Det er imidlertid viktig å presisere at vårt rensesystem er et resultat av å optimalisere ulike klassiske prosedyrer. Vi jobber for tiden med å forbedre flere trinn, hovedsakelig fokusert på kromatografiteknikker (størrelsesekskludering og ionebytterkromatografi).
Når det gjelder hovedmålet med dette arbeidet, som var å teste effekten av β-glukaner på immunceller, ble deres potensielle effekter på aktivering av mikroglia testet når de fire forskjellige typer β-glukaner ble renset. Immunfluorescens ble brukt mot to gullstandardmarkører for proliferasjon og apoptose22,23.
Til tross for ingen statistiske forskjeller i tumorproliferasjonsrater, var P. ostreatus (A) og H. erinaceus (C) i stand til å redusere Ki67-uttrykk med opptil 50%. Mangelen på signifikans skyldes sannsynligvis den høye variansen i studien angående G. lucidum. Videre er induksjon av apoptose i kreftceller en ganske interessant terapeutisk tilnærming, og P. djamor (B) og H. erinaceus (C) viste en signifikant induksjon av cCasp3-nivåer, noe som tyder på aktivering av celledødsprogrammet. Alle disse resultatene er i samsvar med tidligere studier som viste den antitumorale effekten av disse soppene i andre typer svulster24,25. Forsøkene ble utført i duplikat, opprettholdt de samme forholdene og ledet av de samme etterforskerne. Programvarebasert analyse av resultatene fra immunfluorescensstudiene støtter en objektiv tilnærming og forbedrer den potensielle rekkevidden av denne studien.
Generelt har disse studiene en hovedutfordring når det gjelder bruk av β-glukaner, som er renheten av forbindelsene. Det er obligatorisk å forfølge de høyeste standardene for å bekrefte at de observerte effektene, etter bruk i immunologiske studier, utelukkende provoseres av karbohydrater, og ikke på grunn av proteiner eller andre strukturer som kan forbli festet til dem dersom rensingen ikke utføres tilstrekkelig. Et ekstra skritt som kan vurderes i fremtidige studier er bruk av kromatografiteknikker (f.eks. ionebytting eller størrelsesekskludering).
Den overordnede konklusjonen etter studiene plasserer H. erinaceus som toppkandidat som et potensielt immunterapeutisk alternativ for behandling av glioblastom, på grunn av sin evne til å slippe tumorproliferasjon (~ 50%) og indusere sterk aktivering av celledødsprogrammet i glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende interesser å erklære.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Vasiliki Economopoulos for hennes interne manus for å måle fuluorescenssignalet i ImageJ. Vi vil også takke CITIUS (Universitetet i Sevilla) og alt deres personell for deres støtte under demonstrasjonen. Dette arbeidet ble støttet av den spanske FEDER I + D + i-USE, US-1264152 fra Universitetet i Sevilla, og Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
