Summary
本协议描述了四种不同真菌β-葡聚糖的纯化步骤和后续研究，作为增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤特性的潜在免疫调节分子。
Abstract
开发针对胶质母细胞瘤的有效疗法的最大挑战之一是克服肿瘤微环境中的强免疫抑制。免疫疗法已成为使免疫系统对肿瘤细胞的反应的有效策略。胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（GAMs）是这种抗炎方案的主要驱动因素。因此，增强GAM的抗癌反应可能代表治疗胶质母细胞瘤患者的潜在联合辅助疗法。本着这种精神，真菌β-葡聚糖分子长期以来一直被称为有效的免疫调节剂。已经描述了它们刺激先天免疫活性和改善治疗反应的能力。这些调节特征部分归因于它们与模式识别受体结合的能力，有趣的是，模式识别受体在GAM中得到了极大的表达。因此，这项工作的重点是真菌β-葡聚糖的分离，纯化和随后的使用，以增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的杀瘤反应。小鼠胶质母细胞瘤（GL261）和小胶质细胞（BV-2）细胞系用于测试从当前生物制药行业中大量使用的蘑菇中提取的四种不同真菌β-葡聚糖的免疫调节特性： Pleurotus ostreatus， Pleurotus djamor， 猴头菇和灵 芝。为了测试这些化合物，进行了共刺激测定以测量预活化的小胶质细胞条件培养基对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡活化的影响。
Introduction
尽管在神经肿瘤学领域取得了新的成就，但胶质母细胞瘤患者的预期寿命仍然微不足道。针对脑肿瘤的金标准疗法基于手术、放疗和化疗的结合。然而，在过去十年中，免疫疗法已成为治疗不同类型癌症的有力策略1。因此，利用身体对肿瘤细胞的免疫反应的可能性最近已成为肿瘤学的第四大支柱。
人们早就知道，该领域最大的挑战之一是克服肿瘤微环境中发现的强免疫抑制2。特别是，在胶质母细胞瘤的情况下，这是最常见和最具侵袭性的脑癌形式之一，揭示协调这种促肿瘤场景的关键途径，并找到可以抵消免疫系统抑郁反应的新化合物，可能为未来针对这种不治之症的治疗铺平道路。
大脑拥有自己的免疫系统细胞，最相关的细胞类型是小胶质细胞。这些细胞已被证明在不同的中心疾病中具有相当复杂的行为3。在原发性脑肿瘤（例如胶质母细胞瘤）的情况下，这些细胞向支持肿瘤细胞定植脑实质的抗炎表型转移3。许多出版物增强了这些细胞在肿瘤进展过程中的主要作用。其中一个主要原因是胶质瘤相关的小胶质细胞和浸润巨噬细胞（GAMs）占肿瘤总量的三分之一，因此表明它们在脑肿瘤进展过程中的激活状态的明确影响4，5。
本着这种精神，真菌β-葡聚糖被描述为触发有效免疫反应的有效分子，包括吞噬作用和促炎因子的产生，导致有害物质的消除6，7，8，9，10。真菌β-葡聚糖通常使用来自不同蘑菇部位的提取物进行研究。然而，特定效应的归属需要其纯化以避免歧义并能够理解诸如免疫调节剂之类的分子的作用机制8。
在这项工作中，可溶性β葡聚糖从四种不同蘑菇的子实体中纯化，通常用作食用蘑菇（Pleurotus ostreatus 和 Pleurotus djamor）和药用（灵芝 和 猴头菇）蘑菇。特别是，这四种蘑菇在食品和制药工业中有很大的用途，并且是在商业企业的环境友好型循环经济中生产的（见 材料表）。
为了为真菌β-葡聚糖在脑癌治疗中的未来使用奠定基础，明确的纯化策略和临床前研究深入研究它们与免疫系统细胞的假定相互作用对于评估其作为抗肿瘤介质的潜在作用至关重要。这项工作描述了回收所选蘑菇子实体中所含的可溶性β-葡聚糖所需的许多分离和纯化步骤。一旦成功纯化，小胶质细胞就会被激活以增强其炎症表型。小鼠胶质母细胞瘤细胞（GL261）涂有不同的小胶质细胞条件培养基，先前用这些提取物处理，然后评估其对肿瘤细胞行为的影响。有趣的是，我们实验室的初步研究（数据未显示）揭示了促炎小胶质细胞如何减缓肿瘤细胞迁移和侵袭特性，不仅在胶质母细胞瘤细胞中，而且在其他癌细胞系中。这项多学科工作可能为肿瘤学研究人员提供有用的工具，以测试能够增强许多不同类型肿瘤免疫反应的有前途的化合物。
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Protocol
本协议中描述的四种不同的蘑菇变体是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 真菌β-葡聚糖的分离
- 可溶性蘑菇多糖的提取和分离
注意：可溶性蘑菇多糖（SMP）是根据 图1所示的示意性程序获得的。- 在蒸馏水中轻轻冲洗新鲜的 P. ostreatus， P. djamor， H. erinaceus和 G. lucidum 子实体（约2，000克/蘑菇）五次。
- 在常规风干炉中在50±2°C下干燥子实体，直到达到恒定重量（~24小时）。
- 将干蘑菇在刀片磨机中研磨，从每个蘑菇中获得约200克粉末。
- 将 100 g 蘑菇粉 （MP）（P. ostreatus、P. djamor、H. erinaceus 和 G. 灵芝）悬浮在 1，000 mL 的 H2Od 中。然后，在121°C高压灭菌15分钟，最后在室温下放置30分钟。
- 将所得悬浮液在4°C下以6，000× g 离心10分钟。
- 将含有不溶性蘑菇多糖（IMP）的沉淀物在50±2°C下在空气干燥炉中干燥24小时。
- 弃去沉淀物并保留上清液。将上清液在旋转蒸发器中浓缩10次。
- 用乙醇（80%终浓度）在4°C下沉淀含有SMP的浓缩物过夜。
- 在4°C下以6，000× g 离心乙醇悬浮液15分钟，保留沉淀（沉淀），并用移液管弃去上清液。
- 用80%乙醇洗涤沉淀三次，然后将其溶解在H2Od （10% w / v）中。将pH调节至6.5 / 7，温度调节至37°C，并分别用2 U和4U的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理，以按照制造商的说明溶解α-葡聚糖（参见 材料表）。
- 用α-淀粉酶/葡糖淀粉酶处理后，将pH和温度分别调节至8.0和50°C，并用碱性酶（2.5U / g蛋白质）（见 材料表）处理以溶解蛋白质。
注意：这种顺序酶处理可去除乙醇沉淀中与β-葡聚糖共沉淀的大多数α-葡聚糖和蛋白质。 - 水解后，将水解产物在4°C下以6，000× g 离心15分钟，并将干净的上清液浓缩物在旋转蒸发器中离心5次。再次用80%乙醇沉淀。
- 将所得沉淀溶解在H2Od 中，并使用纤维素管膜（12，000 Da截止膜;参见 材料表）在蒸馏水中透析24小时以除去低分子量分子。回收水溶性部分并将其冷冻干燥以产生可溶性β-葡聚糖（SβG）。
- 糖和蛋白质测量
- 用苯酚-硫酸法测定每个馏分的总糖含量，使用葡萄糖作为标准品8。
注意：β-葡聚糖含量的定量也可以通过使用基于酶水解和氧化还原酶活性的β-葡聚糖测定试剂盒（蘑菇和酵母;见 材料表）来完成：即exo-1，3-β-葡聚糖酶，葡萄糖氧化酶，β-葡萄糖苷酶和过氧化物酶，随后形成醌亚胺。按照制造商的说明进行操作，稍作修改。 - 使用 18 MH 2 SO4 而不是 12 MH2SO4。
- 分别评估总葡聚糖和α-葡聚糖的含量。
- 按照凯氏定氮方案测量所得β-葡聚糖值作为总葡聚糖和α-葡聚糖（一式三份）值之间的差异。在某些情况下，蛋白质含量可以通过Lowry方法确定，使用白蛋白绘制校准曲线11，12。
- 用苯酚-硫酸法测定每个馏分的总糖含量，使用葡萄糖作为标准品8。
- 紫外吸收光谱分析
- 通过扫描200-400nm区域的样品，使用紫外-可见分光光度计（参见材料表）获得SβG紫外（UV）光谱。
- 在H2Od中制备1.0mg / mL的每个SβG，将溶液转移到石英比色皿中，并在室温下扫描。
- 分子量分布分析
- 使用配备折光率检测器和超水凝胶线性凝胶过滤柱（300 mm x 7.8 mm;图3）。
- 使用去离子水作为洗脱液，流速为0.5mL / min-1 ，并以葡聚糖（110，80和50kDa）作为标准品在40°C下进行测定（参见 材料表）。收集 5 mL 级分。
- 傅里叶变换红外 （FTIR） 分析
- 在FTIR光谱仪上记录4000-500cm-1范围内的红外光谱（图4）。样品应事先与KBr混合以形成薄膜（标准FTIR程序;请参阅制造商的说明和材料表）。
- 分子组成分析
- 按照标准程序12，通过高效薄层色谱（HPTLC）以及气相色谱与质谱联用（GC-MS）估计SβG的分子组成。
2. β-葡聚糖诱导的小胶质细胞刺激的 体外 研究
- 小鼠胶质母细胞瘤和小胶质细胞在8孔室载玻片中的细胞培养
注意：本协议特定于GL261（胶质母细胞瘤）和BV2（小胶质细胞）细胞系。然而，通过轻微的修改，这些步骤可能用于研究其他癌症和免疫细胞系。- 准备Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）完全培养基，改性L-谷氨酰胺，4.5 g / L D-葡萄糖，不含丙酮酸。加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（见 材料表）。将材料在37°C的水浴中预热15分钟。
- 将冷冻的BV2和GL261等分试样解冻到水浴（37°C）中2分钟，在它们完全解冻之前，将它们带入层流罩中，并将细胞接种到两个不同的无菌T25烧瓶中（每个细胞系一个）。
- 将T25烧瓶在37°C，5%CO2 下孵育，直到培养物汇合。
注意：根据冷冻条件和冷冻保存时间，汇合前的时间可能会有所不同。这些细胞系通常需要 3 到 5 天才能在 T75 烧瓶中汇合。 - BV2细胞培养物汇合后，将其转移到0.6 x 106 细胞/孔的8孔室载玻片中。将8孔室载玻片在培养箱中保持24小时。
- 将小胶质细胞接种到8孔室载玻片中后，对GL261细胞重复相同的方案。
- 用β-葡聚糖激活小胶质细胞
- 用四种不同的β-葡聚糖（P. ostreatus，P. djamor，G. lucidum和H. erinaceus）以0.2mg / mL浓度包被BV2细胞72小时。 一个实验条件必须保持未经处理（正常培养基），作为对照组。
- 72小时后用移液管收集上清液，并将剩余体积通过0.20μm注射器过滤器。然后，将上清液在-80°C冷冻至少24小时。
- 用预活化的小胶质细胞条件培养基处理GL261
- 一旦GL261在8孔室载玻片中汇合80%，加入β-葡聚糖处理的小胶质细胞培养基（步骤2.2.2），终体积浓度为25%72小时（总体积：250μl/孔）。
- 孵育72小时后取出培养基并丢弃。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4，0.1 M）洗涤细胞三次，持续5分钟。
- 通过在4°C下加入200μL4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟。
注意：根据可能用于免疫荧光的不同抗体，固定方法可能与典型的4%PFA不同。基于酒精的固定剂在保存某些表位方面可能更有效。
- 免疫荧光检查
- 用Triton X（PBST; 0.01%）用PBS洗涤样品10分钟三次。
- 除去PBST并在室温下加入牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液10%在PBST中（表1）30分钟。
- 取出封闭缓冲液，每孔加入200 μL含有一抗混合物（1：500大鼠Ki-67单克隆抗体和1：500兔裂解半胱天冬酶-3抗体;参见 材料表）的PBS。在4°C孵育过夜。
- 在4°C孵育24小时后，将样品在室温下放置30分钟。
- 在摇床上用PBS洗涤孔三次10分钟（低速）。
- 取出PBS，用每孔200μL含有二抗（1：200驴抗大鼠IgG（H + L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488和1：200驴抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附二抗Alexa Fluor 647;见 材料表）混合物的PBS混合物在室温下在黑暗中45分钟。
- 用PBS在多功能摇床上洗涤样品10分钟。
- 取出 PBS，每孔加入 200 μL 在 PBS （1：5，000） 中稀释的 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 1 分钟。
- 去除DAPI（见 材料表）并在PBS中洗涤细胞5分钟。
- 取下孔框，在每个孔上加入 50 μL PBS：甘油 （1：1），并盖上盖玻片。
- 用指甲油密封载玻片。
- 使用共聚焦显微镜系统以20倍采集图像（见 材料表）。
3. 肿瘤细胞增殖和凋亡的定量和分析
注意：为了测量不同β-葡聚糖对肿瘤细胞增殖和凋亡的潜在影响，在 ImageJ 软件中使用内部脚本来量化 Ki67（增殖）和 cCasp3（细胞凋亡）的正像素数13。
- 打开图像J。单击 插件按钮。 点击之前安装在插件文件夹中的插件 Coloc2，最后选择要分析11 的图像。
注意：此插件是在之前与Vasiliki Economopoulos博士（veconom@uwo.ca）联系后提供的。代替脚本，ImageJ和Fiji软件都有不同的共定位分析工具（参见 材料表），具有相似的属性。 - 根据对照（未处理，仅限 DMEM）条件设置阈值。点击 OK 按钮。
注意：为了避免背景和强度差异，所有图像必须在相同条件下拍摄。优选地，成像会议应在同一天进行，并且显微镜参数在图像中保持不变。 - 确保弹出共定位像素的结果图像和提供高于阈值的像素百分比或原始数量的摘要窗口。根据对照（未处理）条件对结果进行归一化。
注意：所有数据均以SEM平均值±给出。 使用图形和分析软件进行统计分析（见材料表）。使用具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析。误差表示为平均值的标准误差（s.e.m.）（*p < 0.05，**p < 0.01）。
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Representative Results
成功纯化β-葡聚糖
表1总结了从毛竹、黄杨、灵芝和猴头孢子实体中获得的MP、SMP和SβG的质量。 从真菌中获得的MP、SMP和SβG的基本组成（总碳水化合物、β-葡聚糖和蛋白质）如表2所示。这些结果表明该方案如何允许在SMP中检索大量蛋白质含量。然而，用α-淀粉酶/葡糖淀粉酶和蛋白酶酶处理减少了蛋白质的量并增加了β-葡聚糖浓度。
不同SβG的紫外光谱在260和280 nm处没有紫外吸收峰（图2A），表明SβG缺乏核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）。此外，在紫外可见吸收光谱电化学（SEC）之后测试了SβGs的均匀性。色谱图（图3）显示出良好的均匀性，猴头菇、灵芝、灰霉和假单峰分别在8.20、10.5、10、9和11.3 min处出现尖峰和单峰。这些数据表明，该馏分与均聚物一致。此外，根据校准曲线方程（y = -0.0655x + 2.6194; R2 = 0.9951）。
FTIR 光谱测量了对应于共价多糖键的分子振动（图 4）。该光谱在约3，435 cm-1处表现出广泛而强烈的羟基。它还在2，922 cm-1左右显示出较弱的C-H拉伸峰，对应于多糖14。此外，在1，641 cm-1左右的吸光度可以分配给酰胺I15，这与C = O和CN基团的伸长振动有关。大约1，154 cm-1处的信号可能是由于糖苷键16的C-O-C不对称拉伸。最后，约1，072 cm-1处的条带表明β-葡聚糖的C-O拉伸16。893 cm-1附近的弱吸收可能是由于β-吡喃糖的不对称折射振动，显示了糖单元17的β构型。总体而言，发现SβG主要由碳水化合物与少量蛋白质结合组成。
通过HPTLC和GC-MS进一步研究了SβGs的单糖谱。确认存在大量D-葡萄糖和少量D-半乳糖和D-甘露糖以及微量的D-木糖、D-鼠李糖、D-岩藻糖和L-阿拉伯糖。 表3 总结了 猴头菇、 灵芝、 灵芝假单胞菌和 djamor的SβGs的结果。
用β-葡聚糖预激活的小胶质细胞条件培养基诱导癌细胞凋亡
成功分离并完全表征来自所选蘑菇的β-葡聚糖后，将它们添加到小胶质细胞培养物（BV2）中。在向GL261细胞加入小胶质细胞条件培养基后72小时（图5），通过免疫荧光测量增殖（Ki67）和细胞凋亡（裂解的半胱天冬酶3[cCasp3]）的两个关键标志物的表达。使用ImageJ软件中的内部脚本，量化了每个荧光通道的正像素数，从而分析了β-葡聚糖诱导的小胶质细胞活化可能影响肿瘤细胞行为的潜在作用的方式。使用对照样品作为每个荧光团强度的阈值，脚本提供了像素数，从而指示了不同实验条件后每个标记物的表达（图6）。
有趣的是，一旦暴露于不同的小胶质细胞条件培养基，GL261在肿瘤增殖方面没有任何显着差异（图7）。然而， P. djamor （B） 和 H. erinaceus （C） 显示出对 cCasp3 的强烈诱导（分别增加约 6 倍和 9 倍）。
图 1：隔离协议。 从 白杨、贾莫尔假单胞菌、猴头菇和 灵芝中分离和纯化 SβG 制剂的方案示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：β-葡聚糖的紫外线光谱。 （A） P. ostreatus、（B） G. lucidum、（C） P. djamor 和 （D） H. erinaceus 的 200-400 nm 区域的紫外光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图3：体积排阻色谱图。（A） P. ostreatus、（B） G. lucidum、（C） P. djamor 和 （D） H. erinaceus 的大小排阻色谱图。请点击此处查看此图的大图。
图 4：FTIR 光谱。 （A） P. ostreatus、（B） G. lucidum、（C） P. djamor 和 （D） H. erinaceus 的傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图5：共刺激测定示意图。 共刺激测定，其中小鼠小胶质细胞（BV2）细胞用β-葡聚糖包被72小时。冷冻保存并过滤后，收集上清液并转移到GL261细胞培养物（25%）中72小时。 请点击此处查看此图的大图。
图6：增殖和凋亡图像。 免疫荧光图像显示GL261与DAPI（蓝色），Ki67（绿色）和cCasp3（红色）的三重共定位。“Prob Coloc”脚本（底部图像）允许量化来自每个标记的正像素数并在它们之间进行共定位。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图7：增殖速率和细胞凋亡的定量。小胶质细胞条件培养基暴露后GL261细胞中Ki67（左）和cCasp3（右）表达的对照条件（DMEM）的归一化值。（一） Pleurotus ostreatus，（B）Pleurotus djamor，（C）猴头菇y，（D）灵芝。错误表示为 s.e.m. （*p < 0.05， **p < 0.01）。请点击此处查看此图的大图。
| MP （g） | 小型小型封装 （g） | SβGs （g） | |
| P. ostreatus | 201.3 ± 2.2 | 14.4 ± 0.9 （7.1%） | 5.3 ± 0.2 （2.6%） |
| 贾莫尔 | 200.8 ± 1.9 | 13.5 ± 0.6 （6.7%） | 4.9 ± 0.3 （2.4%） |
| 灵芝 | 201.8 ± 1.6 | 14.7 ± 1.2 （7.3%） | 5.5 ± 0.2 （2.7%） |
| 猴头菇属 | 204.2 ± 1.2 | 15.4 ± 0.8 （7.5%） | 5.7 ± 0.2 （2.8%） |
表1：葡聚糖含量表。从 P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum 和 H. erinaceus 的子实体中获得 MP、SMP 和 SβG 的质量平衡。
| 议员 | SMP | SβGs | ||
| CH吨 （%） | 67.3 ± 1.9 | 53.8 ± 2.3 | 90.1 ± 1.2 | |
| P. ostreatus | β-葡聚糖（%） | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89.4 ± 2.3 |
| 蛋白质 （%） | 21.5±0.9 | 19.6 ± 0.8* | 0.4 ± 0.1* | |
| CH吨 （%） | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93.4 ± 1.1 | |
| 贾莫尔 | β-葡聚糖（%） | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91.3 ± 3.4 |
| 蛋白质 （%） | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0.9 ± 0.2* | |
| 灵芝 | CH吨 （%） | 66.4 ± 1.8 | 56.8 ± 2.9 | 93.7 ± 0.9 |
| β-葡聚糖（%） | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92.0 ± 2.6 | |
| 蛋白质 （%） | 18.9 ± 0.8 | 21.4 ± 0.6* | 1.5 ± 0.4* | |
| 猴头菇属 | CH吨 （%） | 67.4 ± 1.2 | 58.9 ± 1.9 | 93.8 ± 1.4 |
| β-葡聚糖（%） | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91.8 ± 2.8 | |
| 蛋白质 （%） | 17.6 ± 1.3 | 22.7 ± 1.8* | 1.3 ± 0.2* |
表2：总碳水化合物。 总碳水化合物 （CHt）、β-葡聚糖和蛋白质的干重 （g） 含量、SMP 和 SβG。 通过凯氏法定量的蛋白质含量 （MP）12.（*，通过劳瑞方法9定量的蛋白质）。
| D-葡聚糖 （%） | D-曼恩 （%） | D-晚会 （%） | D-岩藻 （%） | D-木糖 （%） | D-拉姆 （%） | L-阿拉伯 （%） | |
| 猴头菇属 | 91.6 ± 0.6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | N.D |
| 灵芝 | 94.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 | N.D. | 0.4 ± 0.1 |
| P. ostreatus | 93.8±0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0.8 ± 0.1 | 0.4 ± 0.1 | N.D. | N.D. | N.D. |
| 贾莫尔 | 95.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | N.D. | N.D. | N.D. |
表3：单糖的表征。P. ostreatus，P. djamor，G. lucidum和H. erinaceus的SβG的单糖谱（N.D.，一些单糖检测不到）。
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Discussion
这项工作描述了使用成熟的技术成功地从四种不同的真菌中分离、纯化和表征 SβG 的含量。结果表明，热水提取灰 霉、黄 杨、 灵芝 和猴头孢杆菌的SMPs后，用α-淀粉酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶水解处理后，α-葡聚糖和蛋白质的含量降低，从而显著丰富了纯SβGs的含量。
尽管如此，我们观察到大多数真菌β葡聚糖在纯化过程中不溶于水。该研究的主要兴趣是SβGs，因为它们的医学/药物特性10，18。此外，由于水解处理，乙醇沉淀和透析，可溶性低分子量碳水化合物，肽，寡肽和氨基酸成功地从SMP中去除，显示出与以前使用不同类型的蘑菇但具有相似工艺的其他先前工作相似的效率19，20。
为了测试SβGs的纯度，通过紫外分光光度法研究了不同SβG的紫外光谱，扫描了200-400 nm区域的样品。在260和280 nm处未观察到紫外吸收峰，表明SβGs既没有核酸（260 nm）也没有蛋白质（280 nm），再次表明β-葡聚糖主要构成SβGs。尽管200-400 nm区域的紫外光谱显示280 nm处没有任何明确/尖锐的拾取，但仍可观察到一个小峰。这可以通过存在少量多糖结合蛋白来解释，与 表2所示的结果一致。然而，有趣的是，如此微不足道的多糖量也可以解释为延迟访问剩余蛋白质，这些蛋白质可能被葡聚糖或阻止葡聚糖结合蛋白质完全降解的空间位阻效应所屏蔽。重要的是，SEC进一步测试了SβG的均一性，SEC是一种强大的分析技术，用于按大小纯化溶解分子，证实了协议结果。
此外，FTIR光谱用于测量对应于共价多糖键的分子振动。如前所述，所有四种真菌都获得了相似的光谱。光谱特征表现出多糖14，酰胺I15和β-葡聚糖16的存在。893 cm-1 附近的弱吸收表明糖单位的β构型17。总体而言，发现SβG主要由碳水化合物与最少蛋白质结合形成。关于使用SβG作为免疫调节分子的兴趣，值得强调的是，多糖 - 蛋白质复合物通常以其免疫调节益处而著称21。
最后，采用HPTLC和GC-MS研究了SβGs的单糖谱。大量D-葡萄糖与少量D-半乳糖和D-甘露糖以及痕量的D-木糖、D-鼠李糖和D-岩藻糖的存在严格意味着SβGs中的主要成分是β-葡聚糖。然而，重要的是要澄清我们的纯化系统是优化不同经典程序的结果。我们目前正在努力改进几个步骤，主要集中在色谱技术（体积排阻和离子交换色谱）。
关于这项工作的主要目的是测试β-葡聚糖对免疫细胞的影响，一旦成功纯化四种不同类型的β-葡聚糖，就测试了它们对小胶质细胞活化的潜在影响。免疫荧光用于对抗增殖和凋亡的两个金标准标志物22，23。
尽管肿瘤增殖率没有统计学差异，但 P. ostreatus （A） 和 H. erinaceus （C） 能够将 Ki67 表达降低多达 50%。缺乏意义可能是由于关于 灵芝的研究差异很大。此外，诱导癌细胞凋亡是一种相当有趣的治疗方法， P. djamor （B）和 H. erinaceus （C）显示出cCasp3水平的显着诱导，表明细胞死亡程序的激活。所有这些结果都符合先前的研究，这些研究显示了这些真菌在其他类型的肿瘤中的抗肿瘤作用24，25。实验一式两份进行，保持相同的条件，并由相同的研究人员领导。对免疫荧光研究结果的基于软件的分析支持无偏倚的方法，并增强了本研究的潜在范围。
一般来说，这些研究在使用β-葡聚糖方面存在主要挑战，即化合物的纯度。必须追求最高标准，以确认观察到的效果在用于免疫学研究后完全由碳水化合物引起，而不是由于蛋白质或其他结构，如果纯化未充分进行，则可能仍然附着在它们上。在未来的研究中可以考虑的一个额外步骤是使用色谱技术（例如，离子交换或尺寸排阻）。
研究后的总体结论将 猴头菌 作为治疗胶质母细胞瘤的潜在免疫治疗选择的最佳候选者，因为它能够降低肿瘤增殖（~50%）并诱导胶质母细胞瘤细胞中细胞死亡程序的强烈激活。
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Disclosures
没有竞争利益需要申报。
Acknowledgments
我们要感谢Vasiliki Economopoulos博士在ImageJ中测量富洛尔斯信号的内部脚本。我们还要感谢CITIUS（塞维利亚大学）及其所有人员在示威期间的支持。这项工作得到了塞维利亚大学的西班牙FEDER I + D + i-USE，US-1264152和科学，创新和大学部PID2021-126090OA-I00的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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