Summary
본 프로토콜은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 항종양 특성을 향상시키는 잠재적인 면역 조절 분자로서 4가지 다른 진균 β글루칸의 정제 단계 및 후속 연구를 설명합니다.
Abstract
교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 가장 큰 과제 중 하나는 종양 미세 환경 내에서 강력한 면역 억제를 극복하는 것입니다. 면역 요법은 종양 세포에 대한 면역계 반응을 돌리는 효과적인 전략으로 부상했습니다. 신경아교종 관련 대식세포 및 미세아교세포(GAM)는 이러한 항염증 시나리오의 주요 동인입니다. 따라서 GAM에서 항암 반응을 향상시키는 것은 교모세포종 환자를 치료하기 위한 잠재적인 공동 보조 요법을 나타낼 수 있습니다. 그런 맥락에서 곰팡이 β글루칸 분자는 오랫동안 강력한 면역 조절제로 알려져 왔습니다. 선천성 면역 활동을 자극하고 치료 반응을 개선하는 능력이 설명되었습니다. 이러한 조절 기능은 부분적으로 패턴 인식 수용체에 결합하는 능력에 기인하며, 흥미롭게도 GAM에서 크게 표현됩니다. 따라서 이 작업은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 종양 반응을 향상시키기 위한 진균 β글루칸의 분리, 정제 및 후속 사용에 중점을 둡니다. 마우스 교모세포종(GL261) 및 미세아교세포(BV-2) 세포주는 현재 바이오 제약 산업에서 많이 사용되는 버섯에서 추출한 4가지 다른 진균 β글루칸(Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum)의 면역 조절 특성을 테스트하는 데 사용됩니다. 이들 화합물을 시험하기 위해, 교모세포종 세포에서의 증식 및 세포자멸사 활성화에 대한 사전 활성화된 미세아교세포-조건화 배지의 효과를 측정하기 위해 공동-자극 분석을 수행하였다.
Introduction
신경 종양학 분야에서 새로운 업적이 출현 했음에도 불구하고 교 모세포종 환자의 기대 수명은 여전히 미미합니다. 뇌종양에 대한 표준 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 융합을 기반으로 합니다. 그러나 지난 10년 동안 면역요법은 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 강력한 전략으로 부상했다1. 따라서 종양 세포에 대한 신체의 면역 반응을 활용할 수 있는 가능성은 최근 종양학의 네 번째 기둥이 되었습니다.
이 분야에서 가장 큰 과제 중 하나는 종양미세환경2에서 발견되는 강력한 면역억제를 극복하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 특히, 가장 흔하고 공격적인 형태의 뇌암 중 하나인 교모세포종의 경우, 이러한 종양 전(前)종양 시나리오를 조율하는 주요 경로를 밝히고 면역 체계의 우울한 반응을 상쇄할 수 있는 새로운 화합물을 찾는 것은 이 난치병에 대한 미래 치료법의 길을 열 수 있습니다.
뇌는 자체 면역 체계 세포를 가지고 있으며 가장 관련성이 높은 세포 유형은 미세 아교 세포입니다. 이 세포들은 서로 다른 중추 질환에 걸쳐 다소 복잡한 행동을 하는 것으로 입증되었다3. 원발성 뇌종양(예: 교모세포종)의 경우, 이들 세포는 종양 세포가 뇌 실질에 서식하도록 지원하는 항염증 표현형으로 이동한다3. 수많은 출판물이 종양 진행 동안 이러한 세포의 주요 역할을 향상시켰습니다. 그 주된 이유 중 하나는 신경교종 관련 미세아교세포와 침윤성 대식세포(GAM)가 전체 종양 질량의 1/3을 차지하기 때문에 뇌종양 진행 중 활성화 상태의 명백한 영향을 시사하기 때문입니다 4,5.
이러한 맥락에서 진균 β-글루칸은 식균 작용 및 전염증 인자 생성을 포함한 효과적인 면역 반응을 유발하는 강력한 분자로 설명되어 악성 물질인 6,7,8,9,10을 제거합니다. 곰팡이 β글루칸은 일반적으로 다른 버섯 부분의 추출물을 사용하여 연구되었습니다. 그러나, 특정 효과의 귀속은 모호성을 피하고 면역조절제8와 같은 분자의 작용 기전을 이해할 수 있도록 정제를 필요로 한다.
이 연구에서 용해성 β 글루칸은 식용 버섯 (Pleurotus ostreatus 및 Pleurotus djamor) 및 약용 버섯 (Ganoderma lucidum 및 Hericium erinaceus)으로 정기적으로 사용되는 4 가지 버섯의 자실체에서 정제됩니다. 특히, 이 4가지 버섯은 식품 및 제약 산업에서 많이 사용되며 상업 기업의 환경 친화적인 순환 경제 내에서 생산되었습니다( 재료 표 참조).
뇌암 치료에서 진균 β글루칸의 향후 사용을 위한 토대를 마련하기 위해서는 항종양 매개체로서의 잠재적 역할을 평가하기 위해 잘 정의된 정제 전략과 면역계 세포와의 추정 상호 작용을 탐구하는 전임상 연구가 필수적입니다. 이 작업은 선택된 버섯의 자실체 내에 포함된 용해성 β글루칸을 회수하는 데 필요한 수많은 분리 및 정제 단계를 설명합니다. 성공적으로 정제되면 미세아교세포가 활성화되어 염증 표현형이 향상됩니다. 마우스 교모세포종 세포(GL261)를 이전에 이러한 추출물로 처리한 다른 미세아교세포 조절 배지로 코팅한 다음 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 평가합니다. 흥미롭게도, 우리 연구실의 파일럿 연구 (데이터는 표시되지 않음)는 전 염증성 미세 아교 세포가 교 모세포종 세포뿐만 아니라 다른 암 세포주에서도 종양 세포 이동 및 침윤 특성을 늦출 수있는 방법을 밝혀 냈습니다. 이 다학제적 연구는 종양학 연구자들이 다양한 유형의 종양에서 면역 반응을 높일 수 있는 유망한 화합물을 테스트하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 4가지 다른 버섯 변종은 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).
1. 곰팡이 β글루칸의 분리
- 용해성 버섯 다당류의 추출 및 분리
참고: 가용성 버섯 다당류(SMP)는 그림 1에 개략적으로 표시된 절차에 따라 얻었습니다.- 신선한 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum 자실체(약 2,000g/버섯)를 증류수로 5회 부드럽게 헹굽니다.
- 자실체를 50 ± 2 °C에서 일정한 무게에 도달 할 때까지 기존의 공기 건조 오븐에서 건조시킵니다 (~ 24 시간).
- 말린 버섯을 블레이드 밀에 갈아서 각 버섯에서 약 200g의 분말을 얻습니다.
- 100g의 버섯 분말(MP)(P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum)을 1,000mL의H2Od에 현탁합니다. 이어서, 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 마지막으로 실온에서 30분 동안 방치한다.
- 생성된 현탁액을 4°C에서 10분 동안 6,000 x g 에서 원심분리한다.
- 불용성 버섯 다당류(IMP)를 함유하는 침전물을 공기 건조 오븐에서 50± 2°C에서 24시간 동안 건조시킵니다.
- 침전물을 버리고 상청액을 유지하십시오. 상청액을 회전 증발기에서 10 회 농축합니다.
- SMPs를 함유한 농축액을 에탄올(80% 최종 농도)로 4°C에서 밤새 침전시킨다.
- 에탄올 현탁액을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g 에서 원심분리하고, 펠릿(침전물)을 유지하고, 피펫으로 상청액을 버린다.
- 침전물을 H2O d (10 % w / v)에 용해시키기 전에 80 % 에탄올로 3 회 세척하십시오. pH를 6.5/7로 조정하고 온도를 37°C로 조정하고 제조업체의 지침에 따라 α-글루칸을 가용화하기 위해 각각 2U 및 4U의 α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 처리하십시오(재료 표 참조).
- α-아밀라아제/글루코아밀라아제로 처리한 후 pH와 온도를 각각 8.0 및 50°C로 조정하고 알칼라제(단백질 2.5U/g)( 재료 표 참조)로 처리하여 단백질을 가용화합니다.
참고: 이 순차적 효소 처리는 에탄올 침전에서 β글루칸과 함께 침전되는 대부분의 α글루칸과 단백질을 제거합니다. - 가수분해한 후, 가수분해물을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g 로 원심분리하고, 상등액을 회전 증발기에서 5회 농축한다. 80 % 에탄올로 다시 침전시킨다.
- 생성된 침전물을H2Od에 가용화하고 셀룰로오스 튜브 멤브레인(12,000Da 컷오프 멤브레인, 재료 표 참조)을 사용하여 증류수에서 24시간 동안 투석하여 저분자량 분자를 제거합니다. 수용성 부분을 회수하고 동결 건조하여 용해성 β글루칸(SβGs)을 생성합니다.
- 설탕 및 단백질 측정
- 페놀-황산 방법으로 각 분획의 총 당 함량을 측정하고, 포도당을 표준으로사용한다 8.
참고: β-글루칸 함량의 정량화는 효소 가수분해 및 산화환원효소(즉, 엑소-1,3-β-글루카나제, 포도당 산화효소, β-글루코시다아제 및 과산화효소)의 활성을 기반으로 β-글루칸 분석 키트(버섯 및 효모, 재료 표 참조)를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 제조업체의 지침을 약간 수정하여 따르십시오. - 12MH2SO4 대신 18MH2SO4를 사용합니다.
- 총 글루칸과 α-글루칸의 함량을 별도로 평가합니다.
- Kjeldahl 프로토콜에 따라 결과 β-글루칸 값을 총 글루칸 및 α-글루칸(삼중) 값의 차이로 측정합니다. 특정 경우에, 단백질 함량은 로리 방법에 의해 결정될 수 있으며, 알부민을 사용하여 검량선11,12를 플롯팅한다.
- 페놀-황산 방법으로 각 분획의 총 당 함량을 측정하고, 포도당을 표준으로사용한다 8.
- 자외선 흡수 분광법 분석
- 200-400 nm 영역의 샘플을 스캔하여 UV 가시광선 분광 광도계( 재료 표 참조)를 사용하여 SβG 자외선(UV) 스펙트럼을 얻습니다(그림 2).
- H2Od에서 각 SβG의 1.0mg/mL를 준비하고, 용액을 석영 큐벳으로 옮기고, 실온에서 스캔한다.
- 분자량 분포 분석
- 굴절률 검출기와 울트라 하이드로겔 선형 겔 여과 컬럼(300 mm x 7.8 mm; 그림 3).
- 0.5mL/min-1 의 유속으로 용리액으로 탈이온수를 사용하고 표준으로 dextrans(110, 80 및 50kDa)를 사용하여 40°C에서 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 5mL 분획을 수집합니다.
- 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분석
- 적외선 스펙트럼(그림 4)을 4000-500cm-1 범위의 FTIR 분광계에 기록합니다. 샘플은 필름을 형성하기 위해 이전에 KBr과 혼합되어야 합니다(표준 FTIR 절차, 제조업체 지침 및 재료 표 참조).
- 분자 조성 분석
- 표준 절차12에 따라 고성능 박막 크로마토그래피(HPTLC)와 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피(GC-MS)를 통해 SβG의 분자 조성을 추정한다.
2. β글루칸 유도 미세아교세포 자극에 대한 시험관 내 연구
- 8-웰 챔버 슬라이드에서 마우스 교모세포종 및 미세아교세포 세포의 세포 배양
참고: 이 프로토콜은 GL261(교모세포종) 및 BV2(미세아교세포) 세포주에 특이적입니다. 그러나 약간의 수정을 통해 이러한 단계는 잠재적으로 다른 암 및 면역 세포주를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.- L-글루타민, 4.5g/L D-포도당으로 변형되고 피루브산이 없는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 완전 배지를 준비합니다. 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 추가합니다( 재료 표 참조). 재료를 37°C의 수조에서 15분 동안 예열합니다.
- 냉동된 BV2 및 GL261 분취액을 수조(37°C)에서 2분 동안 해동하고 완전히 해동하기 직전에 층류 후드로 옮기고 세포를 두 개의 다른 멸균 T25 플라스크(각 세포주당 하나씩)에 플레이트합니다.
- 배양물이 합류할 때까지 T25 플라스크를 37°C, 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
알림: 동결 조건 및 냉동 보존 시간에 따라 합류까지의 시간이 다를 수 있습니다. 이러한 세포주는 일반적으로 T75 플라스크에서 합류도에 도달하는 데 3-5일이 걸립니다. - BV2 세포 배양이 합류한 후 8웰 챔버 슬라이드 0.6 x 106 세포/웰로 옮깁니다. 8-웰 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 24시간 동안 보관합니다.
- 미세아교세포 세포가 8웰 챔버 슬라이드에 도말되면 GL261 세포와 동일한 프로토콜을 반복합니다.
- β-글루칸을 이용한 미세아교세포의 활성화
- BV2 세포를 4개의 다른 β글루칸(P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus)으로 72시간 동안 0.2mg/mL 농도로 코팅합니다. 하나의 실험 조건은 대조군으로 작용하여 처리되지 않은 상태로 유지되어야 합니다(정상 배지).
- 72시간 후 피펫으로 상층액을 수집하고 나머지 부피를 0.20μm 주사기 필터에 통과시킵니다. 그런 다음 상청액을 -80°C에서 최소 24시간 동안 동결합니다.
- 사전 활성화된 미세아교세포 조절 배지로 GL261 처리
- GL261이 8웰 챔버 슬라이드 내에서 80% 합류하면 2.2.2시간 동안 25%의 최종 부피 농도로 β글루칸 처리된 소교세포 배지(단계 72)를 추가합니다(총 부피: 250μl/웰).
- 72시간 배양 후 배지를 제거하고 폐기합니다.
- 세포를 인산완충식염수(PBS; pH 7.4, 0.1 M)로 5분 동안 3회 세척하였다.
- 4°C에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL를 첨가하여 세포를 고정합니다.
참고: 면역형광에 사용될 수 있는 다양한 항체에 따라 고정 방법은 일반적인 4% PFA와 다를 수 있습니다. 알코올 기반 고정제는 특정 에피토프를 보존하는 데 더 효율적일 수 있습니다.
- 면역형광 연구
- 샘플을 트리톤 X(PBST; 0.01%)로 PBS로 10분 동안 3회 세척한다.
- PBST를 제거하고 PBST(표 1) 중 10% 소혈청알부민(BSA) 차단 완충액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 처리하였다.
- 블로킹 완충액을 제거하고, 1차 항체 혼합물(1:500 rat Ki-67 monoclonal 항체 및 1:500 rabbit cleaved caspase-3 antibody; 표 참조)을 함유하는 PBS의 웰당 200 μL 를 첨가한다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 4°C에서 24시간 배양한 후 샘플을 실온에서 30분 동안 방치합니다.
- 웰을 진탕기 상에서 PBS로 10분 동안 3회 세척한다(저속).
- PBS를 제거하고, 2차 항체(1:200 당나귀 항-래트 IgG(H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488 및 1:200 당나귀 항-토끼 IgG(H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 647; 재료 표 참조)의 혼합물을 함유하는 PBS를 웰 당 200 μL로 실온에서 실온에서 45분 동안 교체하였다.
- 다목적 셰이커에서 10분 동안 PBS로 샘플을 세척합니다.
- PBS를 제거하고 PBS(1:5,000)에 희석된 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 웰당 200μL를 1분 동안 추가합니다.
- DAPI( 재료 표 참조)를 제거하고 PBS에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
- 웰 프레임을 제거하고 각 웰에 50μL의 PBS:글리세롤(1:1)을 추가하고 커버슬립으로 덮습니다.
- 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오.
- 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 20x에서 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조).
3. 종양 세포 증식 및 세포 사멸의 정량화 및 분석
참고: 종양 세포 증식 및 세포자멸사에 대한 다양한 β글루칸의 잠재적 효과를 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어에서 사내 스크립트를 사용하여 Ki67(증식) 및 cCasp3(세포자멸사)13의 양성 픽셀 수를 정량화했습니다.
- ImageJ를 엽니다. 플러그인 버튼을 클릭합니다. 플러그인 폴더에 기존에 설치된 플러그인인 Coloc2를 클릭하고, 마지막으로 분석할 이미지를 선택한다11.
참고: 이 플러그인은 Dr. Vasiliki Economopoulos(veconom@uwo.ca)와의 이전 연락 후 사용할 수 있었습니다. 스크립트 대신 ImageJ와 Fiji 소프트웨어에는 유사한 속성을 가진 공동 위치 분석을 위한 서로 다른 도구( 재료 표 참조)가 있습니다. - 제어(처리되지 않음, DMEM만 해당) 조건에 따라 임계값을 설정합니다. 확인 버튼을 클릭합니다.
참고: 배경과 강도 불일치를 피하기 위해 모든 이미지는 동일한 조건에서 촬영해야 합니다. 가급적이면 이미징 세션은 같은 날에 수행되어야 하며 현미경 매개변수는 이미지 전반에 걸쳐 변경되지 않아야 합니다. - colocalized 픽셀의 결과 이미지와 임계값 이상의 픽셀 비율 또는 원시 수를 제공하는 요약 창이 팝업되는지 확인합니다. 대조군(처리되지 않은) 조건에 대한 결과를 정규화합니다.
참고: 모든 데이터는 SEM± 평균으로 제공됩니다. 통계 분석은 그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다(재료 표 참조). Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석이 사용되었습니다. 오차는 평균(s.e.m.)의 표준 오차(*p < 0.05, **p < 0.01)로 표시됩니다.
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Representative Results
β글루칸의 성공적인 정제
추출 및 정제 과정을 거쳐 P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus 의 자실체에서 얻은 MP, SMP 및 SβG의 질량은 표 1에 요약되어 있습니다. 진균으로부터 얻어진 MP, SMPs 및 SβGs의 기본 조성(총 탄수화물, β-글루칸 및 단백질)은 표 2에 묘사되어 있다. 이러한 결과는 프로토콜이 어떻게 SMP에서 많은 양의 단백질 함량을 검색할 수 있었는지 보여줍니다. 그러나 α-아밀라아제/글루코아밀라아제 및 프로테아제를 사용한 효소 처리는 단백질의 양을 감소시키고 β-글루칸 농도를 증가시켰습니다.
상이한 SβG의 UV 스펙트럼은 260 및 280 nm에서 UV 흡수 피크를 나타내지 않았으며(그림 2A), 이는 SβGs에 핵산(260 nm)과 단백질(280 nm)이 부족함을 나타냅니다. 또한, SβGs의 균질성은 UV 가시광선 흡수 분광전기화학(SEC)에 따라 테스트되었습니다. 크로마토그램(그림 3)은 H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus 및 P. djamor에 대해 각각 8.20, 10.5, 10,9 및 11.3분에서 주요 샤프 및 단일 피크와 함께 우수한 균질성을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 분획이 단독중합체와 일치함을 시사합니다. 또한, 중량 평균 Mw는 검량선 방정식(y = -0.0655x + 2.6194; R2 = 0.9951).
FTIR 스펙트럼은 공유 다당류 결합에 해당하는 분자 진동을 측정했습니다(그림 4). 스펙트럼은 약 3,435 cm-1에서 광범위하고 강렬한 하이드록실기를 나타냈다. 또한 약 2,922 cm-1에서 약한 C-H-스트레칭 피크를 보였으며, 이는 다당류14에 해당합니다. 또한, 약 1,641 cm-1 에서의 흡광도는 C=O 및 CN 그룹의 신장 진동과 관련된 아미드 I15에 할당될 수 있습니다. 약 1,154 cm-1에서의 신호는 글리코시드 결합(glycosidic linkage)의 C-O-C 비대칭 스트레칭(asymmetric stretching)에 기인할 수 있다(16). 마지막으로, 약 1,072 cm-1의 띠는 β-글루칸의 C-O 스트레칭을 나타낸다16. 893 cm-1 근처의 약한 흡수는 β-피라노스의 비대칭 굴절 진동 때문일 수 있으며, 이는 당 단위17의 β 구성을 보여줍니다. 전반적으로, SβG는 주로 최소한의 단백질과 결합된 탄수화물로 구성되는 것으로 밝혀졌습니다.
SβGs의 단당류 프로파일은 HPTLC 및 GC-MS에 의해 추가로 연구되었습니다. 소량의 D-갈락토오스 및 D-만노스와 D-자일로스, D-람노스, D-푸코오스 및 L-아라비노스의 미량과 함께 다량의 D-포도당의 존재가 확인되었습니다. 표 3 은 H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus 및 P. djamor의 SβGs에 대해 얻은 결과를 요약한 것입니다.
β-글루칸으로 미리 활성화된 미세아교세포 조절 배지는 암세포에서 세포자멸사를 유도했습니다.
선별된 버섯에서 β글루칸이 성공적으로 분리되고 완전히 특성화되면 미세아교세포 배양액(BV2)에 첨가되었습니다. GL261 세포에 미세아교세포-컨디셔닝 배지를 첨가한 후 72시간에(그림 5), 증식(Ki67) 및 세포자멸사(절단된 카스파제 3[cCasp3])에 대한 두 가지 주요 마커의 발현을 면역형광으로 측정했습니다. ImageJ 소프트웨어의 사내 스크립트를 사용하여 각 형광 채널에 대한 양성 픽셀의 수를 정량화하여 β-글루칸 유도 소교세포 활성화의 잠재적 효과가 종양 세포 행동에 영향을 미칠 수 있는 방식을 분석했습니다. 각 형광단의 강도에 대한 임계값으로 대조 샘플을 사용하여 스크립트는 픽셀 수를 제공했으며, 따라서 서로 다른 실험 조건 후에 각 마커에 대한 발현을 표시했습니다(그림 6).
흥미롭게도, GL261은 상이한 미세아교세포-조건화 배지에 노출된 후 종양 증식과 관련하여 어떠한 유의한 차이도 겪지 않았다(도 7). 그러나 P. djamor (B)와 H. erinaceus (C)는 cCasp3의 강력한 유도 (각각 약 6 배 및 9 배 증가)를 보였다.
그림 1: 격리 프로토콜. P. streatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum으로부터 SβG 제제를 분리하고 정제하기 위한 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: β글루칸의 UV 스펙트럼. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor 및 (D) H. erinaceus의 200-400 nm 영역에서의 UV 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 크기 배제 크로마토그램. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor 및 (D) H. erinaceus의 크기 배제 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FTIR 스펙트럼. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor 및 (D) H. erinaceus의 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 공동 자극 분석의 개략도. 마우스 미세아교세포(BV2) 세포를 β-글루칸으로 72시간 동안 코팅한 공동 자극 분석. 냉동보존되고 여과된 후, 상청액을 수집하여 72시간 동안 GL261 세포 배양물(25%)로 옮 겼다.
그림 6: 증식 및 세포자멸사 이미지. DAPI(파란색), Ki67(녹색) 및 cCasp3(빨간색)과 GL261의 삼중 공동 국소화를 보여주는 면역형광 이미지. 'Prob Coloc' 스크립트(하단 이미지)를 사용하면 각 마커의 포지티브 픽셀 수와 그 사이의 공동 위치 파악을 정량화할 수 있었습니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 증식 속도 및 세포자멸사의 정량화. 미세아교세포-컨디셔닝 배지 노출 후 GL261 세포에서 Ki67(왼쪽) 및 cCasp3(오른쪽) 발현의 대조 조건(DMEM)에 대한 정규화된 값. (ᅡ) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. 오류는 s.e.m.(*p < 0.05, **p < 0.01)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MP (g) | SMP (g) | SβGs (g) | |
| P. 오스트리투스 | 201.3 ± 2.2 | 14.4 ± 0.9 (7.1%) | 5.3 ± 0.2 (2.6%) |
| P. 자모르 | 200.8 ± 1.9 | 13.5 ± 0.6 (6.7%) | 4.9 ± 0.3 (2.4%) |
| G. 루시덤 | 201.8 ± 1.6 | 14.7 ± 1.2 (7.3%) | 5.5 ± 0.2 (2.7%) |
| H. 에리나세우스 | 204.2 ± 1.2 | 15.4 ± 0.8 (7.5%) | 5.7 ± 0.2 (2.8%) |
표 1: 글루칸 함량 표. P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus의 자실체에서 MP, SMP 및 SβG를 얻기 위한 질량 균형.
| MP (하원의원 | SMPs (SMP) | SβGs | ||
| CHt (%) | 67.3 ± 1.9 | 53.8 ± 2.3 | 90.1 ± 1.2 | |
| P. 오스트리투스 | β글루칸 (%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89.4 ± 2.3 |
| 단백질(%) | 21.5±0.9 | 19.6 ± 0.8* | 0.4 ± 0.1* | |
| CHt (%) | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93.4 ± 1.1 | |
| P. 자모르 | β글루칸 (%) | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91.3 ± 3.4 |
| 단백질(%) | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0.9 ± 0.2* | |
| G. 루시덤 | CHt (%) | 66.4 ± 1.8 | 56.8 ± 2.9 | 93.7 ± 0.9 |
| β글루칸 (%) | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92.0 ± 2.6 | |
| 단백질(%) | 18.9 ± 0.8 | 21.4 ± 0.6* | 1.5 ± 0.4* | |
| H. 에리나세우스 | CHt (%) | 67.4 ± 1.2 | 58.9 ± 1.9 | 93.8 ± 1.4 |
| β글루칸 (%) | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91.8 ± 2.8 | |
| 단백질(%) | 17.6 ± 1.3 | 22.7 ± 1.8* | 1.3 ± 0.2* |
표 2 : 총 탄수화물. 총 탄수화물(CHt), β글루칸 및 MP, SMP 및 SβG의 단백질 함량(g) 함량. Kjeldah 방법으로 정량한 단백질 함량(MP)12. (*, Lowry 방법9에 의해 정량화된 단백질).
| D-글루크 (%) | D-만 (%) | 디갈라 (%) | D-푸코 (%) | D-자일로(%) | D-람 (%) | L-아랍 (%) | |
| H. 에리나세우스 | 91.6 ± 0.6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | N.D (주) |
| G. 루시덤 | 94.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 | n.d. | 0.4 ± 0.1 |
| P. 오스트리투스 | 93.8 ± 0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0.8 ± 0.1 | 0.4 ± 0.1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. 자모르 | 95.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | n.d. | n.d. | n.d. |
표 3: 단당류의 특성화. P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus의 SβG의 단당류 프로파일(n.d., 일부 단당류는 검출할 수 없음).
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Discussion
이 연구는 4가지 다른 균류에서 SβG의 함량을 성공적으로 분리, 정제 및 특성화하기 위해 잘 확립된 기술의 사용을 설명합니다. 그 결과, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, H. erinaceus로부터 얻은 SMP를 열수 추출한 후 α-아밀라아제, 글루코시다아제, 프로테아제로 가수분해 처리한 후 α-글루칸과 단백질의 함량이 감소하여 순수한 SβG의 양이 크게 풍부해졌습니다.
그럼에도 불구하고 우리는 대부분의 곰팡이 β글루칸이 정제 과정에서 수불용성임을 관찰했습니다. 이 연구의 주요 관심사는 SβGs의 의학적/약학적 특성10,18로 인해 SβG였습니다. 또한, 가수분해 처리, 에탄올 침전 및 투석 덕분에 수용성 저분자량 탄수화물, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 아미노산이 SMP에서 성공적으로 제거되어 다른 유형의 버섯을 사용했지만 유사한 공정을 가진 다른 이전 연구와 유사한 효율성을 보였습니다19,20.
SβGs의 순도를 테스트하기 위해 200-400nm 영역의 샘플을 스캔하여 UV 분광 광도법으로 다른 SβG의 UV 스펙트럼을 조사했습니다. 260 및 280 nm에서 UV 흡수 피크가 관찰되지 않았으며, 이는 SβG가 핵산(260 nm)이나 단백질(280 nm)을 갖지 않았음을 나타내며, 따라서 β-글루칸이 주로 SβG를 구성한다는 것을 다시 보여줍니다. 200-400 nm 영역의 UV 스펙트럼은 280 nm에서 정의 된 / 날카로운 선택이없는 것으로 나타 났지만 작은 피크는 여전히 관찰 될 수 있습니다. 이것은 표 2에 나타난 결과와 일치하는 소량의 다당류 결합 단백질의 존재로 설명될 수 있습니다. 그러나, 이러한 무시할 수 있는 양의 다당류는 글루칸에 의해 차폐될 수 있는 나머지 단백질에 대한 지연된 접근에 의해서도 설명될 수 있거나 글루칸 결합 단백질의 완전한 분해를 방지하는 입체 효과에 의해 설명될 수 있다는 점을 고려하는 것은 흥미롭습니다. 중요한 것은 SβG의 균질성이 용해된 분자를 크기별로 정제하는 데 사용되는 강력한 분석 기술인 SEC에 의해 추가로 테스트되어 프로토콜 결과를 확인했다는 것입니다.
또한, FTIR 스펙트럼은 공유 다당류 결합에 해당하는 분자 진동을 측정하는 데 사용되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 4개의 균류 모두에 대해 유사한 스펙트럼이 얻어졌다. 스펙트럼 특징은 다당류14, 아미드 I 15 및 β-글루칸16의 존재를 나타냈다. 893 cm-1 근처의 약한 흡수는 당 단위17의 β 구성을 시사한다. 전반적으로, SβG는 주로 최소한의 단백질과 결합 된 탄수화물에 의해 형성되는 것으로 밝혀졌습니다. SβG를 면역조절 분자로 사용하는 것에 대한 관심과 관련하여, 다당류-단백질 복합체가 종종 면역조절 이점으로 주목받는다는 점을 강조할 필요가 있다21.
마지막으로, SβGs의 단당류 프로파일은 HPTLC 및 GC-MS에 의해 연구되었습니다. 소량의 D-갈락토오스 및 D-만노스와 미량의 D-자일로스, D-람노스 및 D-푸코스가 포함된 다량의 D-포도당의 존재는 SβGs의 주요 성분이 β-글루칸임을 엄격히 의미합니다. 그러나 우리의 정화 시스템은 다양한 고전적 절차를 최적화한 결과라는 점을 명확히 하는 것이 중요합니다. 우리는 현재 주로 크로마토그래피 기술(크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피)에 중점을 둔 여러 단계를 개선하기 위해 노력하고 있습니다.
β글루칸이 면역 세포에 미치는 영향을 테스트하는 이 연구의 주요 목표와 관련하여 4가지 유형의 β글루칸이 성공적으로 정제되면 미세아교세포 활성화에 대한 잠재적 영향을 테스트했습니다. 면역형광은 증식 및 세포자멸사에 대한 2개의 금본위제 마커에 대해 사용되었다22,23.
종양 증식률의 통계적 차이는 없었지만 P. ostreatus(A)와 H. erinaceus(C)는 Ki67 발현을 최대 50%까지 감소시킬 수 있었습니다. 중요성의 부족은 G. lucidum에 관한 연구의 높은 차이 때문일 수 있습니다. 또한, 암세포에서 세포자멸사의 유도는 다소 흥미로운 치료적 접근이며, P. djamor(B) 및 H. erinaceus(C)는 cCasp3 수준의 상당한 유도를 보여주었고, 이는 세포 사멸 프로그램의 활성화를 시사합니다. 이 모든 결과는 다른 유형의 종양에서 이러한 진균의 항 종양 효과를 보여준 이전 연구에 따른 것입니다24,25. 실험은 동일한 조건을 유지하면서 동일한 조사관이 주도하여 이중으로 수행되었습니다. 면역형광 연구 결과에 대한 소프트웨어 기반 분석은 편견 없는 접근 방식을 지원하고 이 연구의 잠재적 범위를 향상시킵니다.
일반적으로 이러한 연구는 화합물의 순도인 β글루칸의 사용과 관련하여 주요 과제를 안고 있습니다. 면역 학적 연구에 사용 된 후 관찰 된 효과가 탄수화물에 의해 독점적으로 유발되고 정제가 적절하게 수행되지 않을 경우 단백질이나 다른 구조가 부착되어 있지 않은지 확인하기 위해 가장 높은 기준을 추구하는 것이 필수적입니다. 향후 연구에서 고려할 수 있는 한 가지 추가 단계는 크로마토그래피 기술(예: 이온 교환 또는 크기 배제)의 사용입니다.
연구 후 전반적인 결론은 H. erinaceus 를 교모세포종 치료를 위한 잠재적인 면역요법 옵션으로서 최고의 후보로 꼽았는데, 이는 종양 증식(~50%)을 떨어뜨리고 교모세포종 세포에서 세포 사멸 프로그램의 강력한 활성화를 유도하는 능력으로 인한 것입니다.
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Disclosures
선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
ImageJ에서 fuluorescence 신호를 측정하기 위한 사내 스크립트를 제공한 Vasiliki Economopoulos 박사에게 감사드립니다. 또한 시위 기간 동안 지원해 주신 CITIUS(세비야 대학교)와 모든 직원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 스페인 FEDER I + D + i-USE의 지원을 받았으며 세비야 대학의 US-1264152 및 Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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