Summary
Detta protokoll beskriver reningsstegen och efterföljande studier av fyra olika svamp-β-glukaner som potentiella immunmodulerande molekyler som förbättrar de antitumörala egenskaperna hos mikroglia mot glioblastomceller.
Abstract
En av de största utmaningarna med att utveckla effektiva terapier mot glioblastom är att övervinna den starka immunsuppressionen inom tumörmikromiljön. Immunterapi har vuxit fram som en effektiv strategi för att vända immunsystemets svar mot tumörceller. Gliomassocierade makrofager och mikroglia (GAM) är viktiga drivkrafter för sådana antiinflammatoriska scenarier. Därför kan förbättring av det anti-cancerösa svaret i GAM representera en potentiell samadjuvant behandling för behandling av glioblastompatienter. I den venen har svamp- β-glukanmolekyler länge varit kända som potenta immunmodulatorer. Deras förmåga att stimulera den medfödda immunaktiviteten och förbättra behandlingssvaret har beskrivits. Dessa modulerande egenskaper tillskrivs delvis deras förmåga att binda till mönsterigenkänningsreceptorer, som intressant nog uttrycks starkt i GAM. Således är detta arbete inriktat på isolering, rening och efterföljande användning av svamp-β-glukaner för att förbättra tumördödande respons av mikroglia mot glioblastomceller. Musglioblastom (GL261) och mikroglia (BV-2) cellinjer används för att testa de immunmodulerande egenskaperna hos fyra olika svamp- β-glukaner extraherade från svamp som används kraftigt i den nuvarande biofarmaceutiska industrin: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus och Ganoderma lucidum. För att testa dessa föreningar utfördes samstimuleringsanalyser för att mäta effekten av ett föraktiverat mikroglia-konditionerat medium på proliferations- och apoptosaktiveringen i glioblastomceller.
Introduction
Trots tillkomsten av nya prestationer inom neuro-onkologi är livslängden för glioblastompatienter fortfarande mager. Guldstandardterapier mot hjärntumörer är baserade på sammanslagning av kirurgi, strålbehandling och kemoterapi. Men under det senaste decenniet har immunterapi framstått som en kraftfull strategi för att behandla olika typer av cancer1. Således har möjligheten att utnyttja kroppens immunsvar mot tumörceller nyligen blivit den fjärde pelaren i onkologi.
Det har länge varit känt att en av de största utmaningarna inom området är att övervinna den starka immunsuppression som finns inom tumörmikromiljön2. Särskilt när det gäller glioblastom, en av de vanligaste och aggressiva formerna av hjärncancer, kan unraveling viktiga vägar som orkestrerar sådana pro-tumörscenarier och hitta nya föreningar som kan motverka immunsystemets deprimerande respons bana väg för framtida terapier mot denna obotliga sjukdom.
Hjärnan har sina egna immunsystemceller, och den mest relevanta celltypen är mikroglia. Dessa celler har visat sig ha ett ganska komplext beteende över olika centrala sjukdomar3. När det gäller primära hjärntumörer (t.ex. glioblastom) flyttas dessa celler mot en antiinflammatorisk fenotyp som stöder tumörceller för att kolonisera hjärnparenkymet3. Många publikationer har förbättrat dessa cellers viktiga roll under tumörprogression. En av de främsta orsakerna till detta är att gliomassocierad mikroglia och infiltrerade makrofager (GAM) står för en tredjedel av den totala tumörmassan, vilket tyder på det entydiga inflytandet av deras aktiveringstillstånd under hjärntumörprogression 4,5.
I den venen har svamp- β-glukaner beskrivits som potenta molekyler som utlöser effektiva immunsvar, inklusive fagocytos och proinflammatorisk faktorproduktion, vilket leder till eliminering av skadliga medel 6,7,8,9,10. Svamp- β-glukaner har generellt studerats med hjälp av extrakt från olika svampdelar. Tilldelningen av specifika effekter kräver emellertid dess rening för att undvika tvetydigheter och för att kunna förstå verkningsmekanismen för sådana molekyler som immunmodulerande medel8.
I detta arbete renas lösliga β-glukaner från fruktkroppen av fyra olika svampar, som regelbundet används som ätliga (Pleurotus ostreatus och Pleurotus djamor) och som medicinska (Ganoderma lucidum och Hericium erinaceus) svampar. I synnerhet har dessa fyra svampar stor användning inom livsmedels- och läkemedelsindustrin och producerades inom en miljövänlig cirkulär ekonomi i ett kommersiellt företag (se materialtabell).
För att lägga grunden för framtida användning av svamp-β-glukaner i hjärncancerterapier är väldefinierade reningsstrategier och prekliniska studier som fördjupar sig i deras förmodade interaktion med immunsystemets celler avgörande för att utvärdera deras potentiella roll som antitumörmediatorer. Detta arbete beskriver de många stegen av isolering och rening som behövs för att hämta de lösliga β-glukanerna som finns i fruktkropparna i den valda svampen. När de väl har renats aktiveras mikrogliaceller för att förbättra deras inflammatoriska fenotyp. Musglioblastomceller (GL261) är belagda med ett annat mikroglia-konditionerat medium, som tidigare behandlats med dessa extrakt, och sedan utvärderas dess effekt på tumörcellernas beteende. Intressant nog har pilotstudier från vårt laboratorium (data visas inte) avslöjat hur proinflammatorisk mikroglia kan bromsa tumörcellmigration och invasionsegenskaper inte bara i glioblastomceller utan också i andra cancercellinjer. Detta tvärvetenskapliga arbete kan ge ett användbart verktyg för onkologiforskare att testa lovande föreningar som kan öka immunsvaret i många olika typer av tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De fyra olika svampvarianterna som beskrivs i detta protokoll erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
1. Isolering av svamp β-glukaner
- Extraktion och isolering av lösliga svamppolysackarider
Anmärkning: Lösliga svamppolysackarider (SMP) erhölls enligt det förfarande som schematiskt visas i figur 1.- Skölj försiktigt färska fruktkroppar av P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus och G. lucidum (cirka 2 000 g/svamp) i destillerat vatten fem gånger.
- Torka fruktkropparna vid 50 ± 2 °C i en konventionell lufttorkugn tills en konstant vikt uppnås (~ 24 timmar).
- Mal de torkade svamparna i en bladkvarn och få cirka 200 g pulver från varje svamp.
- Suspendera 100 g svamppulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus och G. lucidum) i 1 000 mlH2Od. Autoklav sedan vid 121 °C i 15 minuter och låt slutligen stå i rumstemperatur i 30 minuter.
- Centrifugera suspensionen vid 6 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Torka fällningen innehållande olösliga svamppolysackarider (IMP) vid 50 ± 2 °C i lufttorkande ugn i 24 timmar.
- Kassera fällningen och behåll supernatanten. Koncentrera supernatanten 10 gånger i en roterande indunstare.
- Fäll ut koncentratet innehållande SMP med etanol (80 % slutlig koncentration) vid 4 °C över natten.
- Centrifugera etanolsuspensionen vid 6 000 x g i 15 minuter vid 4 °C, behåll pelleten (fäll ut) och kassera supernatanten med pipett.
- Tvätta fällningen tre gånger med 80 % etanol innan den löses upp iH2Od (10 % vikt/volym). Justera pH till 6,5/7 och temperaturen till 37 °C och behandla med 2 U och 4 U α-amylas respektive glukosamylas för att solubilisera α-glukaner enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning).
- Efter behandling med α-amylas/glukosamylas, justera pH och temperatur till 8,0 respektive 50 °C och behandla med alkalas (2,5 E/g protein) (se Materialtabell) för att lösliga proteinerna.
OBS: Denna sekventiella enzymatiska behandling avlägsnar de flesta α-glukaner och proteiner som fälls ut tillsammans med β-glukaner i etanolutfällningen. - Efter hydrolys, centrifugera hydrolysatet vid 6 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och det rena supernatantkoncentratet fem gånger i en rotationsindunstare. Fäll ut igen med 80% etanol.
- Lösgör den resulterande fällningen i H2Od och dialysera i destillerat vatten i 24 timmar med hjälp av cellulosaslangmembran (12000 Da avskurna membran; se materialtabell) för att avlägsna molekyler med låg molekylvikt. Återvinn den vattenlösliga delen och frystorka den för att producera lösliga β-glukaner (SβGs).
- Socker- och proteinmätning
- Mät den totala sockerhalten i varje fraktion med fenol-svavelsyrametoden med glukos som standard8.
OBS: Kvantifiering av β-glukaninnehåll kan också göras med hjälp av β-glukananalyssatsen (svamp och jäst; se materialtabell), baserat på enzymatisk hydrolys och aktiviteten av oxidoreduktaser: nämligen exo-1,3-β-glukanas, glukosoxidas, β-glukosidas och peroxidas, med efterföljande bildning av kinoneimin. Följ tillverkarens instruktioner, med små ändringar. - Använd 18 MH2SO4 istället för 12MH2SO4.
- Utvärdera innehållet av de totala glukanerna och α-glukanerna separat.
- Mät de resulterande β-glukanvärdena som skillnaden mellan de totala glukan- och α-glukanvärdena (tre gånger) enligt Kjeldahlprotokollet. I vissa fall kan proteinhalten bestämmas med Lowry-metoden med hjälp av albumin för att plotta kalibreringskurvan11,12.
- Mät den totala sockerhalten i varje fraktion med fenol-svavelsyrametoden med glukos som standard8.
- Ultraviolett absorptionsspektroskopianalys
- Hämta SβG ultraviolett (UV) spektra med hjälp av en UV-synlig spektrofotometer (se materialtabell) genom att skanna proverna i området 200-400 nm (figur 2).
- Bered 1,0 mg/ml av varje SβG iH2Od, överför lösningen till en kvartskyvett och skanna i rumstemperatur.
- Analys av molekylviktfördelning
- Uppskatta homoegeniteten hos SβG och molekylvikten hos polymerer genom storleksuteslutningskromatografi (SEC) med hjälp av ett högpresterande vätskekromatografisystem (HPLC) (se materialtabell) utrustat med en brytningsindexdetektor och en ultrahydrogel linjär gelfiltreringskolonn (300 mm x 7,8 mm; Figur 3).
- Utför analysen vid 40 °C med avjoniserat vatten som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,5 ml/min-1 och dextrans (110, 80 och 50 kDa) som standarder (se materialtabell). Samla en 5 ml fraktion.
- Fourier-transform infraröd (FTIR) analys
- Spela in de infraröda spektra (figur 4) på en FTIR-spektrometer i intervallet 4000-500 cm-1. Proverna ska tidigare blandas med KBr för att bilda filmer (standard FTIR-förfarande; se tillverkarens instruktioner och materialförteckning).
- Analys av molekylär sammansättning
- Uppskatta molekylsammansättningen av SβGs genom högpresterande tunnskiktskromatografi (HPTLC) samt gaskromatografi kopplad till masspektrometri (GC-MS), enligt standardprocedurer12.
2. In vitro-studie av β-glukaninducerad mikrogliastimulering
- Cellodling av musglioblastom och mikrogliaceller i 8-brunnskammarglas
OBS: Detta protokoll är specifikt för GL261 (glioblastom) och BV2 (microglia) cellinjer. Men med små modifieringar kan dessa steg potentiellt användas för att studera andra cancer- och immuncellinjer.- Förbered Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletta medium modifierat med L-glutamin, 4,5 g / L D-glukos och utan pyruvat. Tillsätt 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin/streptomycin (se materialförteckning). Förvärm materialet i ett vattenbad vid 37 °C i 15 minuter.
- Tina frysta tänder av tända tänder av BV2 och GL261 i ett vattenbad (37 °C) i 2 minuter, och strax innan de tinar helt, bär in dem i en huv med laminärt flöde och platta cellerna i två olika sterila T25-kolvar (en för varje cellinje).
- Inkubera T25-kolvarna vid 37 °C, 5 %CO2 tills kulturen flyter samman.
OBS: Beroende på frysförhållandena och tiden under kryokonservering kan tiden fram till sammanflödet variera. Dessa cellinjer kräver vanligtvis mellan 3 och 5 dagar för att nå sammanflöde i en T75-kolv. - När BV2-cellkulturen blir sammanflytande, överför den till 8-brunnskammarglas 0,6 x 106 celler / brunn. Håll 8-brunnskammaren i inkubatorn i 24 timmar.
- När mikrogliacellerna har pläterats in i 8-brunnskammarens glas, upprepa samma protokoll med GL261-cellerna.
- Aktivering av mikroglia med β-glukaner
- Belägg BV2-cellerna med fyra olika β-glukaner (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus) vid en koncentration på 0,2 mg/ml i 72 timmar. Ett experimentellt tillstånd måste förbli obehandlat (normalt medium) och fungera som kontrollgrupp.
- Samla upp supernatanten med pipett efter 72 timmar och för den återstående volymen genom ett 0,20 μm sprutfilter. Frys sedan supernatanten vid -80 °C i minst 24 timmar.
- Behandling av GL261 med föraktiverat mikroglia-konditionerat medium
- När GL261 är 80 % sammanflytande i 8-brunnskammarglasen, tillsätt β-glukanbehandlat mikrogliamedium (steg 2.2.2) vid en slutlig volymkoncentration på 25 % under 72 timmar (total volym: 250 μl/brunn).
- Ta bort mediet efter 72 h inkubation och kassera det.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffertsaltlösning (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre gånger i 5 minuter.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C i 15 minuter.
OBS: Beroende på de olika antikroppar som kan användas för immunofluorescens kan fixeringsmetoderna skilja sig från typiska 4% PFA. Alkoholbaserade fixeringsmedel kan vara effektivare för att bevara vissa epitoper.
- Immunofluorescensstudie
- Tvätta proverna med PBS med triton X (PBST; 0,01%) i 10 min tre gånger.
- Ta bort PBST och tillsätt bovint serumalbumin (BSA) blockerande buffert 10% i PBST (tabell 1) i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt 200 μl PBS per brunn innehållande den primära antikroppsblandningen (1:500 Ki-67 monoklonal antikropp på råtta och 1:500 kaninklyvd kaspas-3-antikropp; se materialförteckning). Inkubera över natten vid 4 °C.
- Efter 24 timmars inkubation vid 4 °C låt proverna stå i rumstemperatur i 30 minuter.
- Tvätta brunnarna tre gånger i 10 minuter med PBS på en shaker (låg hastighet).
- Ta bort PBS och ersätt med 200 μL per brunn PBS innehållande blandningen av sekundära antikroppar (1:200 åsna anti-råtta IgG (H + L) mycket korsadsorberad sekundär antikropp, Alexa Fluor 488 och 1:200 åsna anti-kanin IgG (H + L) mycket korsadsorberad sekundär antikropp, Alexa Fluor 647; se materialtabell) i 45 min vid rumstemperatur i mörkret.
- Tvätta proverna med PBS i 10 minuter på en universalskak.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 μL per brunn av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspätt i PBS (1:5,000) i 1 min.
- Ta bort DAPI (se Materialförteckning) och tvätta cellerna i 5 minuter i PBS.
- Ta bort brunnsramen och tillsätt 50 μL PBS: glycerol (1: 1) på varje brunn och täck med ett täckglas.
- Försegla bilderna med nagellack.
- Ta bilder vid 20x med hjälp av ett konfokalmikroskopsystem (se materialförteckning).
3. Kvantifiering och analys av tumörcellproliferation och apoptos
OBS: För att mäta den potentiella effekten av de olika β-glukanerna på tumörcellsproliferation och apoptos användes ett internt skript i ImageJ-programvaran för att kvantifiera antalet positiva pixlar av Ki67 (proliferation) och cCasp3 (apoptos)13.
- Öppna ImageJ. Klicka på knappen Plugins . Klicka på Coloc2, ett plugin som tidigare installerats i plugin-mappen, och välj slutligen bilden för att analysera11.
OBS: Denna plugin var tillgänglig efter tidigare kontakt med Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Istället för skriptet har både ImageJ- och Fiji-programvaran olika verktyg för samlokaliseringsanalys (se materialförteckning), med liknande egenskaper. - Ställ in tröskelvärden enligt kontrollförhållandena (obehandlade, endast DMEM). Klicka på OK-knappen .
OBS: För att undvika bakgrunds- och intensitetsavvikelser måste alla bilder tas under samma förhållanden. Helst bör avbildningssessioner utföras samma dag och mikroskopparametrar oförändrade över bilder. - Se till att de resulterande bilderna av de samlokaliserade pixlarna och ett sammanfattningsfönster med procentandelen eller det råa antalet pixlar över tröskelvärdet visas. Normalisera resultaten med avseende på kontrollen (obehandlade) förhållanden.
OBS: Alla data anges som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av graf- och analysprogramvara (se materialförteckning). En enkelriktad ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest användes. Fel representeras som standardfel för medelvärdet (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik rening av β-glukaner
Massan av MP, SMP och SβG som erhålls från fruktkroppar av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus efter extraktions- och reningsprocessen sammanfattas i tabell 1. Den grundläggande sammansättningen (totala kolhydrater, β-glukaner och protein) av MP, SMP och SβG erhållna från svamparna visas i tabell 2. Dessa resultat visar hur protokollet möjliggjorde hämtning av en stor mängd proteininnehåll i SMP. Den enzymatiska behandlingen med α-amylas/glukosamylas och proteas minskade dock mängden protein och ökade β-glukankoncentrationen.
UV-spektra för de olika SβG-ämnena visade inga UV-absorptionstoppar vid 260 och 280 nm (figur 2A), vilket indikerar att SβG saknade nukleinsyror (260 nm) och proteiner (280 nm). Dessutom testades homogeniteten hos SβGs efter UV-synlig absorptionsspektroelektrokemi (SEC). Kromatogrammen (figur 3) visade god homogenitet, med en skarp huvudtopp och en enda topp på 8,20, 10,5, 10,9 och 11,3 minuter för H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus respektive P. djamor. Dessa data tyder på att fraktionen överensstämmer med homopolymerer. Dessutom beräknades den viktgenomsnittliga Mw som cirka 120,8, 92,8, 80,7 och 75,9 kDa för H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus respektive P. djamor, enligt kalibreringskurvans ekvation (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
FTIR-spektra mätte molekylära vibrationer som motsvarade kovalenta polysackaridbindningar (figur 4). Spektra uppvisade en bred och intensiv hydroxylgrupp vid cirka 3 435 cm-1. Den visade också en svag C-H-sträckande topp på cirka 2 922 cm-1, motsvarande polysackarider14. Vidare kunde absorbansen vid cirka 1 641 cm-1 tilldelas amid I15, relaterad till töjningsvibrationerna hos C=O- och CN-grupperna. Signalen vid cirka 1 154 cm-1 kan bero på C-O-C asymmetrisk sträckning av glykosidbindningen16. Slutligen indikerade bandet vid cirka 1 072 cm-1 C-O-sträckning av β-glukaner 16. Den svaga absorptionen nära 893 cm-1 kan bero på den asymmetriska brytningsvibrationen hos β-pyranos, vilket visar β-konfigurationen av sockerenheter17. Sammantaget visade sig SβG huvudsakligen bestå av kolhydrater konjugerade med en minimal mängd protein.
Monosackaridprofilen för SβGs studerades vidare av HPTLC och GC-MS. Förekomsten av en stor mängd D-glukos med mindre mängder D-galaktos och D-mannos och ett spår av D-xylos, D-rhamnos, D-fukos och L-arabinos bekräftades. I tabell 3 sammanfattas de resultat som erhållits för SβGs av H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus och P. djamor.
Microglia-konditionerat medium, föraktiverat med β-glukan, inducerad apoptos i cancerceller
När β-glukaner från de valda svamparna framgångsrikt isolerades och karakteriserades fullständigt, tillsattes de till mikrogliacellkulturen (BV2). Vid 72 timmar efter tillsats av mikrogliakonditionerat medium till GL261-cellerna (figur 5) mättes uttrycket av två nyckelmarkörer för proliferation (Ki67) och apoptos (klyvd kaspas 3 [cCasp3]) med immunofluorescens. Med hjälp av ett internt skript i ImageJ-programvaran kvantifierades antalet positiva pixlar för varje fluorescerande kanal, och därmed analyserades hur den potentiella effekten av β-glukaninducerad mikroglialaktivering kan påverka tumörcellernas beteende. Med hjälp av kontrollprover som ett tröskelvärde för intensiteten hos varje fluorofor gav skriptet antalet pixlar och indikerade därmed uttrycket för varje markör efter de olika experimentella betingelserna (figur 6).
Intressant nog drabbades GL261 inte av någon signifikant skillnad när det gäller tumörproliferation när den exponerades för de olika mikroglia-konditionerade medierna (figur 7). P. djamor (B) och H. erinaceus (C) visade dock en stark induktion (ungefär sexfaldig respektive niofaldig ökning) av cCasp3.
Bild 1: Isoleringsprotokoll. Schematisk beskrivning av protokollet för att isolera och rena SβG-preparat från P. streatus, P. djamor, H. erinaceus och G. lucidum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: UV-spektra för β-glukaner. UV-spektra i området 200-400 nm av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor och (D) H. erinaceus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kromatogram för uteslutning av storlek. Kromatogram för storleksuteslutning av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor och (D) H. erinaceus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: FTIR-spektra. Fourier-transform infraröda (FTIR) spektra av (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor och (D) H. erinaceus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Schematisk bild av samstimuleringstesterna. Samstimuleringsanalys där musmikroglia (BV2) -celler belades i 72 timmar med β-glukaner. Efter att ha kryokonserverats och filtrerats samlades supernatanten upp och överfördes till GL261-cellodling (25%) i 72 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Spridnings- och apoptosbilder. Immunofluorescensbilder som visar en trippel samlokalisering av GL261 med DAPI (blå), Ki67 (grön) och cCasp3 (röd). Skriptet 'Prob Coloc' (nedre bilder) gjorde det möjligt att kvantifiera antalet positiva pixlar från varje markör och samlokalisering mellan dem. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Kvantifiering av spridningshastigheter och apoptos. Normaliserade värden med avseende på kontrollförhållandena (DMEM) för Ki67 (vänster) och cCasp3 (höger) uttryck i GL261-celler efter mikroglia-konditionerad mediumexponering. a) Pleurotus ostreatus, B) Pleurotus djamor, C) Hericium erinaceus y, D) Ganoderma lucidum. Fel representeras som s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| MP (g) | SMP (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabell 1: Tabell över glukaninnehåll. Massbalans för att erhålla MP, SMP och SβG från fruktkroppar av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus.
| PARLAMENTSLEDAMOT | SMP | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90.1 ± 1.2 | |
| P. ostreatus | β-glukan (%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89,4 ± 2,3 |
| Protein (%) | 21.5±0.9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68.3 ± 2.1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-glukan (%) | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91,3 ± 3,4 |
| Protein (%) | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56.8 ± 2.9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glukan (%) | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Protein (%) | 18.9 ± 0.8 | 21.4 ± 0.6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58.9 ± 1.9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glukan (%) | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Protein (%) | 17.6 ± 1.3 | 22,7 ± 1,8* | 1.3 ± 0.2* |
Tabell 2: Totalt kolhydrater. Torrvikt (g) innehåll av totala kolhydrater (CHt), β-glukan och protein av MP, SMP och SβGs. Proteininnehåll (MP) kvantifierat med Kjeldah-metoden12. (*, proteiner kvantifierade med Lowry-metoden9).
| D-gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-arabiska (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2.1 ± 0.2 | 0,5 ± 0,2 | 0.8 ± 0.2 | 0,3 ± 0,1 | Ej så länge |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | odaterad | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | odaterad | odaterad | odaterad |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0,3 ± 0,1 | odaterad | odaterad | odaterad |
Tabell 3: Karakterisering av monosackarider. Monosackaridprofil för SβGs av P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus (nd, vissa monosackarider var odetekterbara).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver användningen av väletablerade tekniker för att framgångsrikt isolera, rena och karakterisera innehållet av SβG från fyra olika svampar. Resultaten visade hur efter varmvattenextraktion av SMP, erhållna från P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum och H. erinaceus, följt av hydrolytisk behandling med α-amylas, glukosidas och proteas, reducerades innehållet av α-glukan och protein, vilket avsevärt berikade mängden rena SβGs.
Trots detta observerade vi att de flesta svamp-β-glukanerna var vattenolösliga under reningsprocessen. Huvudintresset för studien var SβGs, på grund av deras medicinska/farmaceutiska egenskaper10,18. Dessutom, tack vare hydrolytisk bearbetning, etanolutfällning och dialys, avlägsnades lösliga kolhydrater, peptider, oligopeptider och aminosyror med låg molekylvikt framgångsrikt från SMP, vilket visade en liknande effektivitet som andra tidigare verk med en annan typ av svamp men med liknande processer19,20.
För att testa renheten hos SβG undersöktes UV-spektra för de olika SβGs med UV-spektrofotometri och skannade proverna i 200-400 nm-området. Inga UV-absorptionstoppar observerades vid 260 och 280 nm, vilket indikerar att SβG varken hade nukleinsyror (260 nm) eller proteiner (280 nm), vilket återigen visar att β-glukaner huvudsakligen utgjorde SβGs. Även om UV-spektra i området 200-400 nm visade frånvaron av någon definierad / skarp plockning vid 280 nm, kunde en liten topp fortfarande observeras. Detta kan förklaras av närvaron av en liten mängd polysackaridbundna proteiner, vilket överensstämmer med resultaten i tabell 2. Det är emellertid intressant att överväga att en sådan försumbar mängd polysackarider också kan förklaras av fördröjd tillgång till de återstående proteinerna, som kan skyddas av glukaner eller av steriska effekter som förhindrar fullständig nedbrytning av glukanbundna proteiner. Viktigt är att homogeniteten hos SβGs testades ytterligare av SEC, en kraftfull analysteknik som används för att rena upplösta molekyler efter storlek, vilket bekräftade protokollresultaten.
Dessutom användes FTIR-spektra för att mäta molekylära vibrationer motsvarande kovalenta polysackaridbindningar. Som tidigare beskrivits erhölls liknande spektra för alla fyra svamparna. Spektrafunktionen uppvisade närvaron av polysackarider14, amid I 15 och β-glukaner16. Den svaga absorptionen nära 893 cm-1 föreslog β-konfigurationen av sockerenheter17. Sammantaget visade sig SβG huvudsakligen bildas av kolhydrater konjugerade med minimalt protein. När det gäller intresset för att använda SβG som immunmodulerande molekyler är det värt att betona att polysackarid-proteinkomplex ofta noteras för sina immunmodulerande fördelar21.
Slutligen studerades monosackaridprofilen för SβGs med HPTLC och GC-MS. Närvaron av en stor mängd D-glukos med mindre mängder D-galaktos och D-mannos och spår av D-xylos, D-rhamnos och D-fukos innebär strikt att den dominerande komponenten i SβGs är β-glukan. Det är dock viktigt att klargöra att vårt reningssystem är resultatet av optimering av olika klassiska procedurer. Vi arbetar för närvarande med att förbättra flera steg, främst med fokus på kromatografitekniker (storleksuteslutning och jonbyteskromatografi).
När det gäller huvudsyftet med detta arbete, som var att testa effekterna av β-glukaner på immunceller, testades deras potentiella effekter på aktiveringen av mikroglia när de fyra olika typerna av β-glukaner framgångsrikt renades. Immunofluorescens användes mot två guldstandardmarkörer för proliferation och apoptos22,23.
Trots inga statistiska skillnader i tumörproliferationshastigheter kunde P. ostreatus (A) och H. erinaceus (C) släppa Ki67-uttryck med upp till 50%. Bristen på betydelse beror sannolikt på den höga variansen i studien avseende G. lucidum. Vidare är induktionen av apoptos i cancerceller ett ganska intressant terapeutiskt tillvägagångssätt, och P. djamor (B) och H. erinaceus (C) visade en signifikant induktion av cCasp3-nivåer, vilket tyder på aktivering av celldödsprogrammet. Alla dessa resultat är i enlighet med tidigare studier som visade den antitumörala effekten av dessa svampar i andra typer av tumörer24,25. Experimenten utfördes i två exemplar, upprätthöll samma förhållanden och leddes av samma utredare. Mjukvarubaserad analys av resultaten från immunofluorescensstudierna stödjer ett opartiskt tillvägagångssätt och förbättrar studiens potentiella räckvidd.
I allmänhet har dessa studier en huvudutmaning när det gäller användningen av β-glukaner, vilket är renheten hos föreningarna. Det är obligatoriskt att följa högsta standard för att bekräfta att de observerade effekterna, efter användning i immunologiska studier, uteslutande provoceras av kolhydraterna och inte på grund av proteiner eller andra strukturer som kan förbli fästa vid dem om reningen inte utförs tillräckligt. Ett extra steg som kan övervägas i framtida studier är användningen av kromatografitekniker (t.ex. jonbyte eller storleksuteslutning).
Den övergripande slutsatsen efter studierna placerar H. erinaceus som toppkandidat som ett potentiellt immunterapeutiskt alternativ för behandling av glioblastom, på grund av dess förmåga att minska tumörproliferation (~ 50%) och inducera stark aktivering av celldödsprogrammet i glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande intressen att deklarera.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Vasiliki Economopoulos för hennes interna manus för att mäta fuluorescenssignalen i ImageJ. Vi vill också tacka CITIUS (universitetet i Sevilla) och all deras personal för deras stöd under demonstrationen. Detta arbete stöddes av den spanska FEDER I + D + i-USE, US-1264152 från universitetet i Sevilla och Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
