Summary
El presente protocolo describe los pasos de purificación y los estudios posteriores de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes como moléculas inmunomoduladoras potenciales que mejoran las propiedades antitumorales de la microglía contra las células de glioblastoma.
Abstract
Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de terapias efectivas contra el glioblastoma es superar la fuerte supresión inmune dentro del microambiente tumoral. La inmunoterapia se ha convertido en una estrategia eficaz para convertir la respuesta del sistema inmunitario en contra de las células tumorales. Los macrófagos asociados al glioma y la microglía (GAM) son los principales impulsores de tales escenarios antiinflamatorios. Por lo tanto, mejorar la respuesta anticancerosa en los GAM puede representar una posible terapia coadyuvante para tratar a los pacientes con glioblastoma. En ese sentido, las moléculas fúngicas de β-glucano se conocen durante mucho tiempo como potentes moduladores inmunes. Se ha descrito su capacidad para estimular la actividad inmune innata y mejorar la respuesta al tratamiento. Esas características moduladoras se atribuyen en parte a su capacidad para unirse a los receptores de reconocimiento de patrones, que, curiosamente, se expresan en gran medida en los GAM. Por lo tanto, este trabajo se centra en el aislamiento, purificación y posterior uso de β-glucanos fúngicos para mejorar la respuesta tumoricida de la microglía contra las células de glioblastoma. Las líneas celulares de glioblastoma de ratón (GL261) y microglia (BV-2) se utilizan para probar las propiedades inmunomoduladoras de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes extraídos de hongos muy utilizados en la industria biofarmacéutica actual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum. Para probar estos compuestos, se realizaron ensayos de coestimulación para medir el efecto de un medio preactivado condicionado por microglía sobre la proliferación y la activación de la apoptosis en las células de glioblastoma.
Introduction
A pesar del advenimiento de nuevos logros en el campo de la neurooncología, la esperanza de vida de los pacientes con glioblastoma sigue siendo escasa. Las terapias estándar de oro contra los tumores cerebrales se basan en la fusión de cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, en la última década, la inmunoterapia se ha convertido en una poderosa estrategia para tratar diferentes tipos de cáncer1. Por lo tanto, la posibilidad de aprovechar la respuesta inmune del cuerpo contra las células tumorales se ha convertido recientemente en el cuarto pilar de la oncología.
Desde hace tiempo se sabe que uno de los mayores desafíos en el campo es superar la fuerte inmunosupresión que se encuentra dentro del microambiente tumoral2. En particular, en el caso del glioblastoma, una de las formas más comunes y agresivas de cáncer cerebral, desentrañar las vías clave que orquestan tales escenarios protumorales y encontrar nuevos compuestos que podrían contrarrestar la respuesta deprimente del sistema inmunológico podría allanar el camino para futuras terapias contra esta enfermedad incurable.
El cerebro posee sus propias células del sistema inmunológico, y el tipo de célula más relevante es la microglía. Se ha demostrado que estas células tienen un comportamiento bastante complejo en diferentes enfermedades centrales3. En el caso de los tumores cerebrales primarios (por ejemplo, glioblastoma), estas células se desplazan hacia un fenotipo antiinflamatorio que apoya a las células tumorales para colonizar el parénquima cerebral3. Numerosas publicaciones han mejorado el papel principal de estas células durante la progresión tumoral. Una de las principales razones de esto es que la microglía asociada al glioma y los macrófagos infiltrados (GAMs) representan un tercio de la masa tumoral total, lo que sugiere la influencia inequívoca de sus estados de activación durante la progresión del tumor cerebral 4,5.
En ese sentido, los β-glucanos fúngicos han sido descritos como moléculas potentes que desencadenan respuestas inmunes efectivas, incluyendo fagocitosis y producción de factores proinflamatorios, lo que lleva a la eliminación de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Los β-glucanos fúngicos generalmente se han estudiado utilizando extractos de diferentes partes de hongos. Sin embargo, la atribución de efectos específicos requiere su purificación para evitar ambigüedades y poder comprender el mecanismo de acción de tales moléculas como agentes inmunomoduladores8.
En este trabajo, los β-glucanos solubles se purifican del cuerpo fructífero de cuatro hongos diferentes, empleados regularmente como hongos comestibles (Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor) y medicinales (Ganoderma lucidum y Hericium erinaceus). En particular, estos cuatro hongos tienen un gran uso en la industria alimentaria y farmacéutica y se produjeron dentro de una economía circular respetuosa con el medio ambiente en una empresa comercial (ver Tabla de materiales).
Con el fin de sentar las bases para el uso futuro de β-glucanos fúngicos en terapias contra el cáncer cerebral, las estrategias de purificación bien definidas y los estudios preclínicos que profundizan en su supuesta interacción con las células del sistema inmune son esenciales para evaluar su papel potencial como mediadores antitumorales. Este trabajo describe los numerosos pasos de aislamiento y purificación necesarios para recuperar los β-glucanos solubles contenidos dentro de los cuerpos fructíferos del hongo seleccionado. Una vez purificadas con éxito, las células microgliales se activan para mejorar su fenotipo inflamatorio. Las células de glioblastoma de ratón (GL261) se recubren con un medio diferente condicionado por microglía, previamente tratado con estos extractos, y luego se evalúa su efecto sobre el comportamiento de las células tumorales. Curiosamente, los estudios piloto de nuestro laboratorio (datos no mostrados) han descubierto cómo la microglía proinflamatoria puede retrasar la migración de células tumorales y las propiedades de invasión no solo en las células de glioblastoma sino también en otras líneas celulares cancerosas. Este trabajo multidisciplinario puede proporcionar una herramienta útil para que los investigadores oncológicos prueben compuestos prometedores capaces de aumentar la respuesta inmune en muchos tipos diferentes de tumores.
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Protocol
Las cuatro variantes diferentes de hongos descritas en este protocolo se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
1. Aislamiento de β-glucanos fúngicos
- Extracción y aislamiento de polisacáridos solubles de hongos
NOTA: Los polisacáridos solubles de hongos (SMP) se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento esquemáticamente mostrado en la Figura 1.- Enjuague suavemente los cuerpos fructíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum (aproximadamente 2,000 g / hongo) en agua destilada cinco veces.
- Secar los cuerpos frutales a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire convencional hasta alcanzar un peso constante (~24 h).
- Moler los champiñones secos en un molino de cuchillas, obteniendo unos 200 g de polvo de cada hongo.
- Suspender 100 g de hongos en polvo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum) en 1.000 mL deH2Od. A continuación, autoclave a 121 °C durante 15 min, y finalmente dejar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugar la suspensión resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Secar el precipitado que contiene polisacáridos de setas insolubles (IMP) a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire durante 24 h.
- Deseche el precipitado y conserve el sobrenadante. Concentrar el sobrenadante 10 veces en un evaporador rotativo.
- Precipitar el concentrado que contiene SMP con etanol (80% de concentración final) a 4 °C durante la noche.
- Centrifugar la suspensión de etanol a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, retener el pellet (precipitado) y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Lavar el precipitado tres veces con etanol al 80% antes de disolverlo enH2Od(10% p/v). Ajustar el pH a 6.5/7 y la temperatura a 37 °C, y tratar con 2 u y 4 U de α-amilasa y glucoamilasa, respectivamente, para solubilizar α-glucanos siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Después del tratamiento con α-amilasa/glucoamilasa, ajustar el pH y la temperatura a 8,0 y 50 °C, respectivamente, y tratar con alcalasa (2,5 U/g de proteína) (ver Tabla de materiales) para solubilizar las proteínas.
NOTA: Este tratamiento enzimático secuencial elimina la mayoría de los α-glucanos y proteínas que coprecipitan con β-glucanos en la precipitación de etanol. - Después de la hidrólisis, centrifugar el hidrolizado a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, y el sobrenadante limpio concentrar cinco veces en un evaporador rotativo. Precipitar de nuevo con etanol al 80%.
- Solubilizar el precipitado resultante enH2ODy dializar en agua destilada durante 24 h utilizando membranas de tubos de celulosa (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabla de materiales) para eliminar moléculas de bajo peso molecular. Recupere la porción soluble en agua y liofilifíquela para producir β-glucanos solubles (SβGs).
- Medición de azúcar y proteínas
- Medir el contenido total de azúcar de cada fracción por el método de ácido fenol-sulfúrico, utilizando la glucosa como estándar8.
NOTA: La cuantificación del contenido de β-glucano también se puede hacer utilizando el kit de ensayo de β-glucano (hongos y levadura; ver Tabla de materiales), basado en la hidrólisis enzimática y la actividad de las oxidorreductasas: a saber, exo-1,3-β-glucanasa, glucosa oxidasa, β-glucosidasa y peroxidasa, con la posterior formación de la quinoneimina. Siga las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. - Utilice 18 MH 2 SO4 en lugar de 12 MH2SO4.
- Evalúe el contenido de los glucanos totales y α-glucanos por separado.
- Mida los valores de β-glucano resultantes como la diferencia entre los valores de glucano total y α-glucano (triplicado) siguiendo el protocolo Kjeldahl. En ciertos casos, el contenido de proteína puede determinarse por el método de Lowry, utilizando albúmina para trazar la curva de calibración11,12.
- Medir el contenido total de azúcar de cada fracción por el método de ácido fenol-sulfúrico, utilizando la glucosa como estándar8.
- Análisis de espectroscopia de absorción ultravioleta
- Obtenga los espectros ultravioleta (UV) SβG utilizando un espectrofotómetro UV-visible (ver Tabla de materiales) escaneando las muestras en la región de 200-400 nm (Figura 2).
- Preparar 1,0 mg/ml de cada SβG enH2OD, transferir la solución a una cubeta de cuarzo y escanear a temperatura ambiente.
- Análisis de distribución de peso molecular
- Estimar la homoegeneidad de SβGs y el peso molecular de los polímeros por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (ver Tabla de materiales) equipado con un detector de índice de refracción y una columna lineal de filtración de gel ultrahidrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).
- Realizar el ensayo a 40 °C utilizando agua desionizada como eluyente a un caudal de 0,5 ml/min-1 y dextranos (110, 80 y 50 kDa) como patrones (ver Tabla de materiales). Recoja una fracción de 5 ml.
- Análisis infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR)
- Registre los espectros infrarrojos (Figura 4) en un espectrómetro FTIR en el rango de 4000-500 cm-1. Las muestras deben mezclarse previamente con KBr para formar películas (procedimiento FTIR estándar; consulte las instrucciones del fabricante y la Tabla de materiales).
- Análisis de composición molecular
- Estimar las composiciones moleculares de SβGs mediante cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), siguiendo procedimientos estándar12.
2. Estudio in vitro de la estimulación de la microglía inducida por β-glucano
- Cultivo celular de células de glioblastoma y microglía de ratón en portaobjetos de cámara de 8 pocillos
NOTA: Este protocolo es específico para las líneas celulares GL261 (glioblastoma) y BV2 (microglia). Sin embargo, con ligeras modificaciones, estos pasos podrían usarse potencialmente para estudiar otras líneas celulares cancerosas e inmunitarias.- Prepare el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco modificado con L-glutamina, 4,5 g/L de D-glucosa y sin piruvato. Agregue 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de materiales). Precaliente el material en un baño maría a 37 °C durante 15 min.
- Descongele las alícuotas BV2 y GL261 congeladas en un baño maría (37 °C) durante 2 min, y justo antes de descongelarlas por completo, llévelas a una campana de flujo laminar y coloque las células en dos matraces T25 estériles diferentes (uno para cada línea celular).
- Incubar los matraces T25 a 37 °C, 5%CO2 hasta que el cultivo sea confluente.
NOTA: Dependiendo de las condiciones de congelación y el tiempo bajo criopreservación, el tiempo hasta la confluencia puede variar. Estas líneas celulares suelen requerir entre 3 y 5 días para alcanzar la confluencia en un matraz T75. - Después de que el cultivo celular BV2 se vuelva confluente, transfiéralo a portaobjetos de cámara de 8 pocillos 0.6 x 106 células/pocillo. Mantenga los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos en la incubadora durante 24 h.
- Una vez que las células microgliales estén colocadas en los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos, repita el mismo protocolo con las células GL261.
- Activación de la microglía con β-glucanos
- Cubra las células BV2 con cuatro β-glucanos diferentes (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus) a una concentración de 0,2 mg/ml durante 72 h. Una condición experimental debe permanecer sin tratar (medio normal), actuando como el grupo de control.
- Recoger el sobrenadante con una pipeta después de 72 h y pasar el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 μm. A continuación, congelar el sobrenadante a -80 °C durante al menos 24 h.
- Tratamiento de GL261 con medio preactivado condicionado por microglía
- Una vez que el GL261 esté 80% confluente dentro de los portaobjetos de cámara de 8 pocillos, añadir medio microglial tratado con β glucano (paso 2.2.2) a una concentración volumétrica final del 25% durante 72 h (volumen total: 250 μl/pocillo).
- Retirar el medio después de 72 h de incubación y desecharlo.
- Lave las células con solución salina tampón fosfato (PBS; pH 7.4, 0.1 M) tres veces durante 5 minutos.
- Fijar las células añadiendo 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C durante 15 min.
NOTA: Dependiendo de los diferentes anticuerpos que podrían usarse para la inmunofluorescencia, los métodos de fijación pueden diferir del PFA típico al 4%. Los fijadores a base de alcohol pueden ser más eficientes para preservar ciertos epítopos.
- Estudio de inmunofluorescencia
- Lave las muestras con PBS con tritón X (PBST; 0,01%) durante 10 min tres veces.
- Retire el PBST y agregue el tampón de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 10% en PBST (Tabla 1) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Retire el tampón de bloqueo y agregue 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla primaria de anticuerpos (anticuerpo monoclonal Ki-67 de rata 1:500 y anticuerpo caspasa-3 hendido de conejo 1:500; ver Tabla de materiales). Incubar durante la noche a 4 °C.
- Después de 24 h de incubación a 4 °C, dejar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave los pocillos tres veces durante 10 minutos con PBS en un agitador (baja velocidad).
- Retire el PBS y reemplácelo con 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla de anticuerpos secundarios (1:200 anti-rata IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de adsorción, Alexa Fluor 488 y 1:200 burro anti-conejo IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de forma cruzada, Alexa Fluor 647; ver Tabla de materiales) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en una coctelera multiusos.
- Retirar el PBS y añadir 200 μL por pocillo de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS (1:5.000) durante 1 min.
- Retire DAPI (ver Tabla de materiales) y lave las celdas durante 5 minutos en PBS.
- Retire el marco del pocillo y agregue 50 μL de PBS: glicerol (1: 1) en cada pocillo y cubra con un cubreobjetos.
- Selle los portaobjetos con esmalte de uñas.
- Adquiera imágenes a 20x utilizando un sistema de microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).
3. Cuantificación y análisis de la proliferación y apoptosis de células tumorales
NOTA: Para medir el efecto potencial de los diferentes β-glucanos sobre la proliferación y apoptosis de células tumorales, se utilizó un script interno en el software ImageJ para cuantificar el número de píxeles positivos de Ki67 (proliferación) y cCasp3 (apoptosis)13.
- Abra ImageJ. Haga clic en el botón Plugins . Haga clic en Coloc2, un complemento previamente instalado en la carpeta del complemento, y finalmente seleccione la imagena analizar 11.
NOTA: Este plugin estaba disponible después de un contacto previo con el Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). En lugar del script, tanto el software ImageJ como el de Fiji tienen diferentes herramientas para el análisis de colocalización (ver Tabla de materiales), con propiedades similares. - Establezca umbrales de acuerdo con las condiciones de control (sin tratar, solo DMEM). Haga clic en el botón Aceptar .
NOTA: Para evitar discrepancias de fondo e intensidad, todas las imágenes deben tomarse en las mismas condiciones. Preferiblemente, las sesiones de imágenes deben realizarse el mismo día y los parámetros del microscopio no deben alterarse en todas las imágenes. - Asegúrese de que aparezcan las imágenes resultantes de los píxeles colocalizados y una ventana de resumen que proporcione el porcentaje o el número bruto de píxeles por encima del umbral. Normalizar los resultados con respecto a las condiciones de control (no tratadas).
NOTA: Todos los datos se dan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando software de gráficos y análisis (ver Tabla de materiales). Se utilizó un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los errores se representan como error estándar de la media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
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Representative Results
Purificación exitosa de β-glucanos
La masa de MP, SMPs y SβGs obtenida de cuerpos fructíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus después del proceso de extracción y purificación se resume en la Tabla 1. La composición básica (carbohidratos totales, β-glucanos y proteínas) de MP, SMPs y SβGs obtenidos de los hongos se representa en la Tabla 2. Estos resultados muestran cómo el protocolo permitió la recuperación de una gran cantidad de contenido de proteínas en SMPs. Sin embargo, el tratamiento enzimático con α-amilasa/glucoamilasa y proteasa redujo la cantidad de proteína y aumentó la concentración de β-glucano.
Los espectros UV de los diferentes SβGs no mostraron picos de absorción UV a 260 y 280 nm (Figura 2A), lo que indica que los SβGs carecían de ácidos nucleicos (260 nm) y proteínas (280 nm). Además, la homogeneidad de SβGs se probó siguiendo la espectroelectroquímica de absorción UV-visible (SEC). Los cromatogramas (Figura 3) mostraron buena homogeneidad, con un pico principal agudo y único a 8,20, 10,5, 10,9 y 11,3 min para H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus y P. djamor, respectivamente. Estos datos sugieren que la fracción es consistente con los homopolímeros. Además, el Mw promedio en peso se calculó como alrededor de 120.8, 92.8, 80.7 y 75.9 kDa para H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus y P. djamor, respectivamente, de acuerdo con la ecuación de la curva de calibración (y = -0.0655x + 2.6194; R2 = 0,9951).
Los espectros FTIR midieron vibraciones moleculares que correspondían a enlaces polisacáridos covalentes (Figura 4). Los espectros exhibieron un amplio e intenso grupo hidroxilo de alrededor de 3.435 cm-1. También mostró un pico débil de estiramiento C-H en alrededor de 2.922 cm-1, correspondiente a polisacáridos14. Además, la absorbancia en torno a 1.641 cm-1 podría asignarse a la amida I15, relacionada con las vibraciones de alargamiento de los grupos C=O y CN. La señal en alrededor de 1.154 cm-1 podría deberse al estiramiento asimétrico C-O-C del enlace glucosídico16. Finalmente, la banda en alrededor de 1.072 cm-1 indicó estiramiento C-O de β-glucanos16. La débil absorción cercana a 893 cm-1 podría deberse a la vibración refractiva asimétrica de la β-piranosa , mostrando la configuración β de las unidades de azúcar17. En general, se encontró que los SβG consistían principalmente en carbohidratos conjugados con una cantidad mínima de proteína.
El perfil de monosacáridos de SβGs se estudió más a fondo mediante HPTLC y GC-MS. Se confirmó la presencia de una gran cantidad de D-glucosa con cantidades más pequeñas de D-galactosa y D-manosa y un rastro de D-xilosa, D-ramnosa, D-fucosa y L-arabinosa. La Tabla 3 resume los resultados obtenidos para SβGs de H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus y P. djamor.
Medio condicionado por microglía, preactivado con β-glucano, indujo apoptosis en células cancerosas
Una vez que los β-glucanos de los hongos seleccionados se aislaron con éxito y se caracterizaron completamente, se agregaron al cultivo de células microgliales (BV2). A las 72 h después de la adición de medio condicionado por microglía a las células GL261 (Figura 5), la expresión de dos marcadores clave para la proliferación (Ki67) y la apoptosis (caspasa 3 hendida [cCasp3]) se midieron por inmunofluorescencia. Usando un script interno en el software ImageJ, se cuantificó el número de píxeles positivos para cada canal fluorescente y, por lo tanto, se analizó la forma en que se analizó el efecto potencial de la activación microglial inducida por β glucano puede afectar el comportamiento de las células tumorales. Utilizando muestras de control como umbral para la intensidad de cada fluoróforo, el script proporcionó el número de píxeles y, por lo tanto, indicó la expresión para cada marcador después de las diferentes condiciones experimentales (Figura 6).
Curiosamente, GL261 no sufrió ninguna diferencia significativa con respecto a la proliferación tumoral una vez expuesto a los diferentes medios condicionados por la microglía (Figura 7). Sin embargo, P. djamor (B) y H. erinaceus (C) mostraron una fuerte inducción (aproximadamente seis veces y nueve veces más, respectivamente) de cCasp3.
Figura 1: Protocolo de aislamiento. Esquema del protocolo para aislar y purificar la preparación de SβG de P. streatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Espectros UV de β-glucanos. Espectros UV en la región de 200-400 nm de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor, y (D) H. erinaceus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cromatogramas de exclusión de tamaño. Cromatogramas de exclusión de tamaño de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor y (D) H. erinaceus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Espectros FTIR. Espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor y (D) H. erinaceus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Esquema de los ensayos de coestimulación. Ensayo de coestimulación en el que las células de microglía de ratón (BV2) se recubrieron durante 72 h con β-glucanos. Después de ser criopreservado y filtrado, el sobrenadante fue recolectado y transferido al cultivo celular GL261 (25%) durante 72 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de proliferación y apoptosis. Imágenes de inmunofluorescencia que muestran una triple colocalización de GL261 con DAPI (azul), Ki67 (verde) y cCasp3 (rojo). El script 'Prob Coloc' (imágenes inferiores) permitió cuantificar el número de píxeles positivos de cada marcador y la colocalización entre ellos. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Cuantificación de las tasas de proliferación y apoptosis. Valores normalizados con respecto a las condiciones de control (DMEM) de la expresión de Ki67 (izquierda) y cCasp3 (derecha) en células GL261 después de la exposición al medio condicionado por microglía. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Los errores se representan como s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| MP (g) | SMP (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabla 1: Tabla de contenido de glucanos. Balance de masa para la obtención de MP, SMPs y SβGs de cuerpos fructíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus.
| MP | SMP | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-glucano (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Proteína (%) | 21.5±0.9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-glucano (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Proteína (%) | 19,9 ± 1,0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glucano (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Proteína (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glucano (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Proteína (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1.3 ± 0.2* |
Tabla 2: Carbohidratos totales. Contenido en peso seco (g) de carbohidratos totales (CHt), β-glucano y proteínas de MP, SMPs y SβGs. Contenido de proteína (MP) cuantificado por el método Kjeldah12. (*, proteínas cuantificadas por el método de Lowry9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-árabe (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | n.d. |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | s.f. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | s.f. | s.f. | s.f. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1.1 ± 0.1 | 0,3 ± 0,1 | s.f. | s.f. | s.f. |
Tabla 3: Caracterización de monosacáridos. Perfil monosacárido de SβGs de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus (s.f., algunos monosacáridos eran indetectables).
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Discussion
Este trabajo describe el uso de técnicas bien establecidas para aislar, purificar y caracterizar con éxito el contenido de SβGs de cuatro hongos diferentes. Los resultados mostraron cómo después de la extracción con agua caliente de SMP, obtenida de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus, seguida de un tratamiento hidrolítico con α-amilasa, glucosidasa y proteasa, el contenido de α-glucano y proteína se redujo, enriqueciendo significativamente la cantidad de SβG puros.
A pesar de esto, observamos que la mayoría de los β-glucanos fúngicos eran insolubles en agua durante el proceso de purificación. El principal interés del estudio fueron los SβGs, debido a sus propiedades médico-farmacéuticas10,18. Además, gracias al procesamiento hidrolítico, la precipitación de etanol y la diálisis, los carbohidratos solubles de bajo peso molecular, péptidos, oligopéptidos y aminoácidos fueron eliminados con éxito de las SMP, mostrando una eficiencia similar a otros trabajos anteriores utilizando un tipo diferente de hongo pero con procesos similares19,20.
Para probar la pureza de SβGs, los espectros UV de los diferentes SβGs se investigaron mediante espectrofotometría UV, escaneando las muestras en la región de 200-400 nm. No se observaron picos de absorción UV a 260 y 280 nm, lo que indica que los SβGs no tenían ácidos nucleicos (260 nm) ni proteínas (280 nm), mostrando así nuevamente que los β-glucanos constituían principalmente los SβGs. Aunque los espectros UV en la región de 200-400 nm mostraron la ausencia de cualquier selección definida / nítida a 280 nm, aún se pudo observar un pequeño pico. Esto podría explicarse por la presencia de una pequeña cantidad de proteínas unidas a polisacáridos, de acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla 2. Sin embargo, es interesante considerar que una cantidad tan insignificante de polisacáridos también podría explicarse por el retraso en el acceso a las proteínas restantes, que pueden estar protegidas por glucanos o por efectos estéricos que impiden la degradación completa de las proteínas unidas a glucanos. Es importante destacar que la homogeneidad de SβGs fue probada por SEC, una poderosa técnica analítica utilizada para purificar moléculas disueltas por tamaño, que confirmó los resultados del protocolo.
Además, se utilizaron espectros FTIR para medir las vibraciones moleculares correspondientes a enlaces polisacáridos covalentes. Como se describió anteriormente, se obtuvieron espectros similares para los cuatro hongos. La característica de los espectros exhibió la presencia de polisacáridos14, amida I 15 y β-glucanos16. La débil absorción cercana a 893 cm-1 sugirió la β-configuración de las unidades de azúcar17. En general, se encontró que los SβG estaban formados principalmente por carbohidratos conjugados con un mínimo de proteínas. En cuanto al interés en el uso de SβGs como moléculas inmunomoduladoras, vale la pena destacar que los complejos polisacáridos-proteínas a menudo se destacan por sus beneficios inmunomoduladores21.
Finalmente, el perfil de monosacáridos de SβGs fue estudiado por HPTLC y GC-MS. La presencia de una gran cantidad de D-glucosa con cantidades más pequeñas de D-galactosa y D-manosa y trazas de D-xilosa, D-ramnosa y D-fucosa implica estrictamente que el componente predominante en SβGs es β-glucano. Sin embargo, es importante aclarar que nuestro sistema de purificación resulta de la optimización de diferentes procedimientos clásicos. Actualmente estamos trabajando en la mejora de varios pasos, principalmente centrados en las técnicas de cromatografía (exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico).
En cuanto al objetivo principal de este trabajo, que era probar el impacto de los β-glucanos en las células inmunes, una vez que los cuatro tipos diferentes de β-glucanos se purificaron con éxito, se probaron sus efectos potenciales sobre la activación de la microglía. La inmunofluorescencia fue utilizada contra dos marcadores estándar de oro para proliferación y apoptosis22,23.
A pesar de que no hubo diferencias estadísticas en las tasas de proliferación tumoral, P. ostreatus (A) y H. erinaceus (C) pudieron disminuir la expresión de Ki67 hasta en un 50%. La falta de significación es probablemente debido a la alta varianza en el estudio con respecto a G. lucidum. Además, la inducción de la apoptosis en células cancerosas es un enfoque terapéutico bastante interesante, y P. djamor (B) y H. erinaceus (C) mostraron una inducción significativa de los niveles de cCasp3, lo que sugiere la activación del programa de muerte celular. Todos estos resultados están de acuerdo con estudios previos que mostraron el efecto antitumoral de estos hongos en otros tipos de tumores24,25. Los experimentos se realizaron por duplicado, manteniendo las mismas condiciones y dirigidos por los mismos investigadores. El análisis basado en software de los resultados de los estudios de inmunofluorescencia apoya un enfoque imparcial y mejora el alcance potencial de este estudio.
En general, estos estudios tienen un desafío principal con respecto al uso de β-glucanos, que es la pureza de los compuestos. Es obligatorio seguir los más altos estándares para confirmar que los efectos observados, después de su uso en estudios inmunológicos, son provocados exclusivamente por los carbohidratos, y no debido a proteínas u otras estructuras que pueden permanecer unidas a ellos si la purificación no se realiza adecuadamente. Un paso adicional que se puede considerar en estudios futuros es el uso de técnicas de cromatografía (p. ej., intercambio iónico o exclusión de tamaño).
La conclusión general después de los estudios coloca a H. erinaceus como el principal candidato como una opción inmunoterapéutica potencial para el tratamiento del glioblastoma, debido a su capacidad para disminuir la proliferación tumoral (~ 50%) e inducir una fuerte activación del programa de muerte celular en las células de glioblastoma.
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Disclosures
No hay intereses contrapuestos que declarar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Dra. Vasiliki Economopoulos por su guión interno para medir la señal de fuluorescencia en ImageJ. También queremos agradecer al CITIUS (Universidad de Sevilla) y a todo su personal por su apoyo durante la demostración. Este trabajo ha contado con el apoyo de la empresa española FEDER I+D+i-USE, US-1264152 de la Universidad de Sevilla, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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