Summary
Il presente protocollo descrive le fasi di purificazione e i successivi studi di quattro diversi β-glucani fungini come potenziali molecole immunomodulatrici che potenziano le proprietà antitumorali della microglia contro le cellule di glioblastoma.
Abstract
Una delle maggiori sfide nello sviluppo di terapie efficaci contro il glioblastoma è superare la forte soppressione immunitaria all'interno del microambiente tumorale. L'immunoterapia è emersa come una strategia efficace per trasformare la risposta del sistema immunitario contro le cellule tumorali. I macrofagi e le microglia associati al glioma (GAM) sono i principali motori di tali scenari anti-infiammatori. Pertanto, il miglioramento della risposta antitumorale nelle GAM può rappresentare una potenziale terapia coadiuvante per il trattamento dei pazienti con glioblastoma. In questo senso, le molecole fungine di β-glucano sono state a lungo conosciute come potenti modulatori immunitari. È stata descritta la loro capacità di stimolare l'attività immunitaria innata e migliorare la risposta al trattamento. Queste caratteristiche modulanti sono in parte attribuite alla loro capacità di legarsi ai recettori di riconoscimento dei pattern, che, curiosamente, sono molto espressi nei GAM. Pertanto, questo lavoro è focalizzato sull'isolamento, la purificazione e il successivo uso di β-glucani fungini per migliorare la risposta tumoricida della microglia contro le cellule di glioblastoma. Le linee cellulari di glioblastoma di topo (GL261) e microglia (BV-2) sono utilizzate per testare le proprietà immunomodulatorie di quattro diversi β-glucani fungini estratti da funghi pesantemente utilizzati nell'attuale industria biofarmaceutica: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Per testare questi composti, sono stati eseguiti saggi di co-stimolazione per misurare l'effetto di un mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia sulla proliferazione e l'attivazione dell'apoptosi nelle cellule di glioblastoma.
Introduction
Nonostante l'avvento di nuove conquiste nel campo della neuro-oncologia, l'aspettativa di vita dei pazienti con glioblastoma rimane scarsa. Le terapie gold standard contro i tumori cerebrali si basano sulla fusione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, nell'ultimo decennio, l'immunoterapia è emersa come una potente strategia per trattare diversi tipi di cancro1. Pertanto, la possibilità di sfruttare la risposta immunitaria del corpo contro le cellule tumorali è recentemente diventata il quarto pilastro dell'oncologia.
È noto da tempo che una delle maggiori sfide nel campo è quella di superare la forte immunosoppressione trovata all'interno del microambiente tumorale2. In particolare, nel caso del glioblastoma, una delle forme più comuni e aggressive di cancro al cervello, svelare percorsi chiave che orchestrano tali scenari pro-tumorali e trovare nuovi composti che potrebbero contrastare la risposta deprimente del sistema immunitario potrebbe aprire la strada a future terapie contro questa malattia incurabile.
Il cervello possiede le proprie cellule del sistema immunitario e il tipo di cellula più rilevante sono le microglia. Queste cellule hanno dimostrato di avere un comportamento piuttosto complesso in diverse malattie centrali3. Nel caso di tumori cerebrali primari (ad esempio, glioblastoma), queste cellule sono spostate verso un fenotipo anti-infiammatorio che supporta le cellule tumorali per colonizzare il parenchima cerebrale3. Numerose pubblicazioni hanno migliorato il ruolo principale di queste cellule durante la progressione del tumore. Una delle ragioni principali di ciò è che la microglia associata al glioma e i macrofagi infiltrati (GAM) rappresentano un terzo della massa tumorale totale, suggerendo così l'influenza inequivocabile dei loro stati di attivazione durante la progressione del tumore cerebrale 4,5.
In questo senso, i β-glucani fungini sono stati descritti come potenti molecole che innescano risposte immunitarie efficaci, tra cui la fagocitosi e la produzione di fattori pro-infiammatori, portando all'eliminazione di agenti perniciosi 6,7,8,9,10. I β-glucani fungini sono stati generalmente studiati utilizzando estratti di diverse parti di funghi. Tuttavia, l'attribuzione di effetti specifici richiede la sua purificazione per evitare ambiguità e per essere in grado di comprendere il meccanismo d'azione di tali molecole come agenti immunomodulatori8.
In questo lavoro, i β-glucani solubili sono purificati dal corpo fruttifero di quattro diversi funghi, regolarmente impiegati come funghi commestibili (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinali (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). In particolare, questi quattro funghi hanno un grande uso nell'industria alimentare e farmaceutica e sono stati prodotti nell'ambito di un'economia circolare rispettosa dell'ambiente in un'impresa commerciale (vedi Tabella dei materiali).
Al fine di gettare le basi per l'uso futuro di β-glucani fungini nelle terapie del cancro al cervello, strategie di purificazione ben definite e studi preclinici che approfondiscono la loro presunta interazione con le cellule del sistema immunitario sono essenziali per valutare il loro potenziale ruolo come mediatori antitumorali. Questo lavoro descrive i numerosi passaggi di isolamento e purificazione necessari per recuperare i β-glucani solubili contenuti all'interno dei corpi fruttiferi del fungo selezionato. Una volta purificate con successo, le cellule della microglia vengono attivate per migliorare il loro fenotipo infiammatorio. Le cellule di glioblastoma di topo (GL261) sono rivestite con un diverso mezzo condizionato dalla microglia, precedentemente trattato con questi estratti, e quindi viene valutato il suo effetto sul comportamento delle cellule tumorali. È interessante notare che studi pilota del nostro laboratorio (dati non mostrati) hanno scoperto come la microglia pro-infiammatoria possa rallentare la migrazione delle cellule tumorali e le proprietà di invasione non solo nelle cellule di glioblastoma ma anche in altre linee cellulari tumorali. Questo lavoro multidisciplinare può fornire uno strumento utile per i ricercatori oncologici per testare composti promettenti in grado di aumentare la risposta immunitaria in molti diversi tipi di tumori.
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Protocol
Le quattro diverse varianti di funghi descritte in questo protocollo sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Isolamento di β-glucani fungini
- Estrazione e isolamento di polisaccaridi solubili di funghi
NOTA: I polisaccaridi solubili dei funghi (SMP) sono stati ottenuti secondo la procedura schematicamente mostrata nella Figura 1.- Risciacquare delicatamente i corpi fruttiferi freschi di P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (circa 2.000 g / fungo) in acqua distillata cinque volte.
- Essiccare i corpi fruttiferi a 50 ± 2 °C in un forno ad aria convenzionale fino a raggiungere un peso costante (~24 h).
- Macinare i funghi secchi in un mulino a lame, ottenendo circa 200 g di polvere da ciascun fungo.
- Sospendere 100 g di polvere di funghi (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) in 1.000 ml di H2Od. Quindi, autoclavare a 121 °C per 15 min, e infine lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
- Centrifugare la sospensione risultante a 6.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Essiccare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili (IMP) a 50 ± 2 °C in un forno ad aria per 24 ore.
- Scartare il precipitato e mantenere il surnatante. Concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante.
- Precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo (concentrazione finale dell'80%) a 4 °C durante la notte.
- Centrifugare la sospensione di etanolo a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C, trattenere il pellet (precipitato) e gettare il surnatante con una pipetta.
- Lavare il precipitato tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo in H2Od (10% p/v). Regolare il pH a 6,5/7 e la temperatura a 37 °C e trattare con 2 U e 4 U di α-amilasi e glucoamilasi, rispettivamente, per solubilizzare i α-glucani seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
- Dopo il trattamento con α-amilasi/glucoamilasi, regolare il pH e la temperatura rispettivamente a 8,0 e 50 °C e trattare con alcalasi (2,5 U/g di proteine) (vedere Tabella dei materiali) per solubilizzare le proteine.
NOTA: Questo trattamento enzimatico sequenziale rimuove la maggior parte dei α-glucani e delle proteine che co-precipitano con β-glucani nella precipitazione dell'etanolo. - Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C e il concentrato di surnatante pulito cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente con etanolo all'80%.
- Solubilizzare il precipitato risultante in H2Od e dializzarlo in acqua distillata per 24 ore utilizzando membrane tubolari di cellulosa (membrane cut-off da 12.000 Da; vedi Tabella dei materiali) per rimuovere molecole a basso peso molecolare. Recuperare la parte idrosolubile e liofilizzarla per produrre β-glucani solubili (SβG).
- Misurazione di zuccheri e proteine
- Misurare il contenuto totale di zucchero di ciascuna frazione con il metodo dell'acido fenolo-solforico, utilizzando il glucosio come standard8.
NOTA: La quantificazione del contenuto di β-glucano può essere effettuata anche utilizzando il kit di dosaggio β-glucano (funghi e lieviti; vedi Tabella dei materiali), basato sull'idrolisi enzimatica e sull'attività delle ossidoreduttasi: vale a dire eso-1,3-β-glucanasi, glucosio ossidasi, β-glucosidasi e perossidasi, con successiva formazione della chinonerimina. Seguire le istruzioni del produttore, con lievi modifiche. - Utilizzare 18 MH 2 SO4 invece di 12 MH2SO4.
- Valutare separatamente il contenuto dei glucani e dei α-glucani totali.
- Misurare i valori di β-glucano risultanti come differenza tra i valori di glucano totale e α-glucano (triplicato) seguendo il protocollo Kjeldahl. In alcuni casi, il contenuto proteico può essere determinato con il metodo di Lowry, utilizzando l'albumina per tracciare la curva di calibrazione11,12.
- Misurare il contenuto totale di zucchero di ciascuna frazione con il metodo dell'acido fenolo-solforico, utilizzando il glucosio come standard8.
- Analisi della spettroscopia di assorbimento ultravioletto
- Ottenere gli spettri ultravioletti (UV) SβG utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (vedi Tabella dei materiali) scansionando i campioni nella regione 200-400 nm (Figura 2).
- Preparare 1,0 mg/ml di ogni SβG in H2Od, trasferire la soluzione in una cuvetta di quarzo e scansionare a temperatura ambiente.
- Analisi della distribuzione del peso molecolare
- Stimare l'omogeneità dei SβG e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (vedi Tabella dei materiali) dotato di un rivelatore di indice di rifrazione e di una colonna lineare di filtrazione in gel ultra-idrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).
- Eseguire il test a 40 °C utilizzando acqua deionizzata come eluente ad una portata di 0,5 mL/min-1 e destrani (110, 80 e 50 kDa) come standard (vedere Tabella dei materiali). Raccogliere una frazione di 5 ml.
- Analisi infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR)
- Registrare gli spettri infrarossi (Figura 4) su uno spettrometro FTIR nell'intervallo 4000-500 cm-1. I campioni devono essere precedentemente miscelati con KBr per formare pellicole (procedura FTIR standard; vedere le istruzioni del produttore e la tabella dei materiali).
- Analisi della composizione molecolare
- Stimare le composizioni molecolari di SβG mediante cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) e gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS), seguendo le procedure standard12.
2. Studio in vitro della stimolazione microglia indotta da β-glucano
- Coltura cellulare di glioblastoma di topo e cellule di microglia in vetrini a 8 pozzetti
NOTA: Questo protocollo è specifico per le linee cellulari GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). Tuttavia, con lievi modifiche, questi passaggi potrebbero potenzialmente essere utilizzati per studiare altre linee cellulari tumorali e immunitarie.- Preparare il mezzo completo modificato di Eagle (DMEM) di Dulbecco modificato con L-glutammina, 4,5 g / L D-glucosio e senza piruvato. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (vedere la tabella dei materiali). Preriscaldare il materiale a bagnomaria a 37 °C per 15 min.
- Scongelare le aliquote BV2 e GL261 congelate a bagnomaria (37 °C) per 2 minuti e, poco prima che si scongelano completamente, trasportarle in una cappa a flusso laminare e placcare le cellule in due diversi palloni sterili T25 (uno per ogni linea cellulare).
- Incubare i matraccio T25 a 37 °C, 5% CO2 fino a quando la coltura è confluente.
NOTA: A seconda delle condizioni di congelamento e del tempo di crioconservazione, il tempo fino alla confluenza può variare. Queste linee cellulari di solito richiedono da 3 a 5 giorni per raggiungere la confluenza in un matraccio T75. - Dopo che la coltura cellulare BV2 diventa confluente, trasferirla in vetrini a 8 pozzetti 0,6 x 106 cellule/pozzetto. Conservare i vetrini della camera a 8 pozzetti nell'incubatore per 24 ore.
- Una volta che le cellule della microglia sono placcate nei vetrini della camera a 8 pozzetti, ripetere lo stesso protocollo con le cellule GL261.
- Attivazione della microglia con β-glucani
- Rivestire le cellule BV2 con quattro diversi β-glucani (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) ad una concentrazione di 0,2 mg/ml per 72 ore. Una condizione sperimentale deve rimanere non trattata (mezzo normale), agendo come gruppo di controllo.
- Raccogliere il surnatante con una pipetta dopo 72 ore e far passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 μm. Quindi, congelare il surnatante a -80 °C per almeno 24 ore.
- Trattamento di GL261 con terreno pre-attivato condizionato da microglia
- Una volta che GL261 è confluente all'80% all'interno dei vetrini della camera a 8 pozzetti, aggiungere il mezzo microgliale trattato con β-glucano (fase 2.2.2) ad una concentrazione di volume finale del 25% per 72 ore (volume totale: 250 μl/pozzetto).
- Rimuovere il terreno dopo 72 ore di incubazione e scartarlo.
- Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre volte per 5 minuti.
- Fissare le cellule aggiungendo 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 15 minuti.
NOTA: A seconda dei diversi anticorpi che potrebbero essere utilizzati per l'immunofluorescenza, i metodi di fissazione possono differire dal tipico 4% di PFA. I fissativi a base di alcol possono essere più efficienti nel preservare alcuni epitopi.
- Studio di immunofluorescenza
- Lavare i campioni con PBS con tritone X (PBST; 0,01%) per 10 minuti tre volte.
- Rimuovere il PBST e aggiungere tampone bloccante l'albumina sierica bovina (BSA) al 10% in PBST (Tabella 1) per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi primari (1:500 anticorpo monoclonale Ki-67 di ratto e 1:500 anticorpo caspasi-3 scisso di coniglio; vedere Tabella dei materiali). Incubare per una notte a 4 °C.
- Dopo 24 ore di incubazione a 4 °C, lasciare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Lavare i pozzetti tre volte per 10 minuti con PBS su uno shaker (bassa velocità).
- Rimuovere il PBS e sostituirlo con 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi secondari (1:200 anticorpo secondario anti-ratto asino (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 488 e 1:200 anticorpo secondario anti-coniglio anti-coniglio (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 647; vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i campioni con PBS per 10 minuti su uno shaker multiuso.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL per pozzetto di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in PBS (1:5.000) per 1 min.
- Rimuovere DAPI (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle per 5 minuti in PBS.
- Rimuovere il telaio del pozzetto e aggiungere 50 μL di PBS:glicerolo (1:1) su ciascun pozzetto e coprire con un vetrino.
- Sigillare le diapositive con lo smalto.
- Acquisire immagini a 20x utilizzando un sistema di microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali).
3. Quantificazione e analisi della proliferazione e dell'apoptosi delle cellule tumorali
NOTA: Al fine di misurare il potenziale effetto dei diversi β-glucani sulla proliferazione e sull'apoptosi delle cellule tumorali, è stato utilizzato uno script interno nel software ImageJ per quantificare il numero di pixel positivi di Ki67 (proliferazione) e cCasp3 (apoptosi)13.
- Aprire ImageJ. Fare clic sul pulsante Plugin . Fare clic su Coloc2, un plugin precedentemente installato nella cartella plugin, e infine selezionare l'immagine da analizzare11.
NOTA: Questo plugin era disponibile dopo un precedente contatto con il Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Invece dello script, sia il software ImageJ che Fiji hanno strumenti diversi per l'analisi di colocalizzazione (vedi Tabella dei materiali), con proprietà simili. - Impostare le soglie in base alle condizioni di controllo (non trattate, solo DMEM). Fare clic sul pulsante OK .
NOTA: per evitare discrepanze di sfondo e intensità, tutte le immagini devono essere scattate nelle stesse condizioni. Preferibilmente, le sessioni di imaging dovrebbero essere eseguite lo stesso giorno e i parametri del microscopio inalterati tra le immagini. - Assicurati che vengano visualizzate le immagini risultanti dei pixel colocalizzati e una finestra di riepilogo che fornisca la percentuale o il numero non elaborato di pixel al di sopra della soglia. Normalizzare i risultati rispetto alle condizioni di controllo (non trattate).
NOTA: Tutti i dati sono indicati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software grafici e di analisi (vedi Tabella dei materiali). È stata utilizzata una ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Gli errori sono rappresentati come errore standard della media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
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Representative Results
Purificazione riuscita dei β-glucani
La massa di MP, SMP e SβG ottenuta dai corpi fruttiferi di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus dopo il processo di estrazione e purificazione è riassunta nella tabella 1. La composizione di base (carboidrati totali, β-glucani e proteine) di MP, SMP e SβG ottenuti dai funghi è raffigurata nella Tabella 2. Questi risultati mostrano come il protocollo abbia permesso il recupero di una grande quantità di contenuto proteico nelle SMP. Tuttavia, il trattamento enzimatico con α-amilasi/glucoamilasi e proteasi ha ridotto la quantità di proteine e aumentato la concentrazione di β-glucano.
Gli spettri UV dei diversi SβG non hanno mostrato picchi di assorbimento UV a 260 e 280 nm (Figura 2A), indicando che i SβG mancavano di acidi nucleici (260 nm) e proteine (280 nm). Inoltre, l'omogeneità degli SβG è stata testata seguendo la spettroelettrochimica di assorbimento UV-visibile (SEC). I cromatogrammi (Figura 3) hanno mostrato una buona omogeneità, con un picco principale acuto e singolo a 8,20, 10,5, 10,9 e 11,3 minuti rispettivamente per H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor. Questi dati suggeriscono che la frazione è coerente con gli omopolimeri. Inoltre, il Mw medio ponderale è stato calcolato come circa 120,8, 92,8, 80,7 e 75,9 kDa per H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor, rispettivamente, secondo l'equazione della curva di calibrazione (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
Gli spettri FTIR hanno misurato le vibrazioni molecolari che corrispondevano ai legami polisaccaridici covalenti (Figura 4). Gli spettri mostravano un gruppo ossidrile ampio e intenso a circa 3.435 cm-1. Ha anche mostrato un debole picco di allungamento C-H a circa 2.922 cm-1, corrispondente ai polisaccaridi14. Inoltre, l'assorbanza a circa 1.641 cm-1 potrebbe essere assegnata all'ammide I15, correlata alle vibrazioni di allungamento dei gruppi C=O e CN. Il segnale a circa 1.154 cm-1 potrebbe essere dovuto allo stiramento asimmetrico C-O-C del legame glicosidico16. Infine, la banda a circa 1.072 cm-1 indicava lo stiramento C-O di β-glucani 16. Il debole assorbimento vicino a 893 cm-1 potrebbe essere dovuto alla vibrazione rifrattiva asimmetrica del β-piranosio, che mostra la configurazione β delle unità di zucchero17. Nel complesso, gli SβG sono risultati essere costituiti principalmente da carboidrati coniugati con una quantità minima di proteine.
Il profilo monosaccaridico dei SβG è stato ulteriormente studiato da HPTLC e GC-MS. È stata confermata la presenza di una grande quantità di D-glucosio con minori quantità di D-galattosio e D-mannosio e una traccia di D-xilosio, D-ramnosio, D-fucosio e L-arabinosio. La tabella 3 riassume i risultati ottenuti per SβG di H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor.
Terreno condizionato da microglia, pre-attivato con β-glucano, apoptosi indotta nelle cellule tumorali
Una volta che i β-glucani dei funghi selezionati sono stati isolati con successo e completamente caratterizzati, sono stati aggiunti alla coltura cellulare della microglia (BV2). A 72 ore dopo l'aggiunta di terreno condizionato da microglia alle cellule GL261 (Figura 5), l'espressione di due marcatori chiave per la proliferazione (Ki67) e l'apoptosi (caspasi scissa 3 [cCasp3]) è stata misurata mediante immunofluorescenza. Utilizzando uno script interno nel software ImageJ, è stato quantificato il numero di pixel positivi per ciascun canale fluorescente e quindi è stato analizzato il modo in cui il potenziale effetto dell'attivazione microgliale indotta da β-glucano può influenzare il comportamento delle cellule tumorali. Utilizzando campioni di controllo come soglia per l'intensità di ciascun fluoroforo, lo script ha fornito il numero di pixel e, quindi, ha indicato l'espressione per ciascun marcatore dopo le diverse condizioni sperimentali (Figura 6).
È interessante notare che GL261 non ha subito alcuna differenza significativa per quanto riguarda la proliferazione tumorale una volta esposto ai diversi mezzi condizionati dalla microglia (Figura 7). Tuttavia, P. djamor (B) e H. erinaceus (C) hanno mostrato una forte induzione (circa sei volte e nove volte, rispettivamente) di cCasp3.
Figura 1: Protocollo di isolamento. Schema del protocollo per isolare e purificare la preparazione di SβG da P. streatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Spettri UV dei β-glucani. Spettri UV nella regione 200-400 nm di (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Cromatogrammi di esclusione dimensionale. Cromatogrammi di esclusione dimensionale di (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Spettri FTIR. Spettri infrarossi a trasformata di Fourier (FTIR) di (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Schema dei saggi di costimolazione. Saggio di co-stimolazione in cui le cellule della microglia di topo (BV2) sono state rivestite per 72 ore con β-glucani. Dopo essere stato crioconservato e filtrato, il surnatante è stato raccolto e trasferito in coltura cellulare GL261 (25%) per 72 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Immagini di proliferazione e apoptosi. Immagini di immunofluorescenza che mostrano una tripla colocalizzazione di GL261 con DAPI (blu), Ki67 (verde) e cCasp3 (rosso). Lo script 'Prob Coloc' (immagini in basso) ha permesso di quantificare il numero di pixel positivi da ciascun marcatore e la colocalizzazione tra di essi. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Quantificazione dei tassi di proliferazione e apoptosi. Valori normalizzati rispetto alle condizioni di controllo (DMEM) dell'espressione di Ki67 (a sinistra) e cCasp3 (a destra) nelle cellule GL261 dopo l'esposizione del mezzo condizionato dalla microglia. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Gli errori sono rappresentati come s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Deputato (g) | SMP (g) | SβG (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabella 1: Tabella del contenuto di glucano. Bilancio di massa per ottenere MP, SMP e SβG da corpi fruttiferi di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus.
| MP | SMP | SβG | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-glucano (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Proteine (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-glucano (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Proteine (%) | 19,9 ± 1,0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glucano (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Proteine (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glucano (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Proteine (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabella 2: Carboidrati totali. Peso secco (g) contenuto di carboidrati totali (CHt), β-glucano e proteine di MP, SMP e SβG. Contenuto proteico (MP) quantificato con il metodo Kjeldah12. (*, proteine quantificate con il metodo di Lowry9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xilo (%) | D-Rham (%) | L-Arab (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2,1 ± 0,2 | 0.5 ± 0.2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | n.d |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2,6 ± 0,2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | n.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1,1 ± 0,1 | 0,3 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabella 3: Caratterizzazione dei monosaccaridi. Profilo monosaccaridico di SβG di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus (n.d., alcuni monosaccaridi non erano rilevabili).
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Discussion
Questo lavoro descrive l'uso di tecniche consolidate per isolare, purificare e caratterizzare con successo il contenuto di SβG da quattro diversi funghi. I risultati hanno mostrato come dopo l'estrazione con acqua calda di SMP, ottenuti da P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguita da un trattamento idrolitico con α-amilasi, glucosidasi e proteasi, il contenuto di α-glucano e proteine è stato ridotto, arricchendo così significativamente la quantità di SβG puri.
Nonostante ciò, abbiamo osservato che la maggior parte dei β-glucani fungini erano insolubili in acqua durante il processo di purificazione. L'interesse principale dello studio erano i SβG, a causa delle loro proprietà medico-farmaceutiche10,18. Inoltre, grazie al trattamento idrolitico, alla precipitazione dell'etanolo e alla dialisi, carboidrati solubili a basso peso molecolare, peptidi, oligopeptidi e amminoacidi sono stati rimossi con successo dagli SMP, mostrando un'efficienza simile ad altri lavori precedenti utilizzando un diverso tipo di fungo ma con processi simili19,20.
Per testare la purezza degli SβG, gli spettri UV dei diversi SβG sono stati studiati mediante spettrofotometria UV, scansionando i campioni nella regione 200-400 nm. Non sono stati osservati picchi di assorbimento UV a 260 e 280 nm, indicando che gli SβG non avevano né acidi nucleici (260 nm) né proteine (280 nm), dimostrando così ancora una volta che i β-glucani costituivano principalmente i SβG. Sebbene gli spettri UV nella regione di 200-400 nm abbiano mostrato l'assenza di qualsiasi scelta definita/nitida a 280 nm, è stato comunque possibile osservare un piccolo picco. Ciò potrebbe essere spiegato dalla presenza di una piccola quantità di proteine legate ai polisaccaridi, concordando con i risultati mostrati nella Tabella 2. Tuttavia, è interessante considerare che una quantità così trascurabile di polisaccaridi potrebbe anche essere spiegata dall'accesso ritardato alle proteine rimanenti, che possono essere schermate dai glucani o da effetti sterici che impediscono la completa degradazione delle proteine legate al glucano. È importante sottolineare che l'omogeneità dei SβG è stata ulteriormente testata da SEC, una potente tecnica analitica utilizzata per purificare le molecole disciolte in base alle dimensioni, che ha confermato i risultati del protocollo.
Inoltre, gli spettri FTIR sono stati utilizzati per misurare le vibrazioni molecolari corrispondenti ai legami polisaccaridici covalenti. Come descritto in precedenza, spettri simili sono stati ottenuti per tutti e quattro i funghi. La caratteristica spettrale ha mostrato la presenza di polisaccaridi14, ammide I 15 e β-glucani16. Il debole assorbimento vicino a 893 cm-1 ha suggerito la configurazione β delle unità di zucchero17. Nel complesso, i SβG sono risultati essere formati principalmente da carboidrati coniugati con proteine minime. Per quanto riguarda l'interesse nell'uso di SβG come molecole immunomodulatorie, vale la pena sottolineare che i complessi polisaccaridi-proteine sono spesso noti per i loro benefici immunomodulatori21.
Infine, il profilo monosaccaridico dei SβG è stato studiato da HPTLC e GC-MS. La presenza di una grande quantità di D-glucosio con piccole quantità di D-galattosio e D-mannosio e tracce di D-xilosio, D-ramnosio e D-fucosio implica strettamente che il componente predominante in SβG è β-glucano. Tuttavia, è importante chiarire che il nostro sistema di purificazione deriva dall'ottimizzazione di diverse procedure classiche. Attualmente stiamo lavorando per migliorare diverse fasi, principalmente focalizzate sulle tecniche cromatografiche (esclusione dimensionale e cromatografia a scambio ionico).
Per quanto riguarda l'obiettivo principale di questo lavoro, che era quello di testare l'impatto dei β-glucani sulle cellule immunitarie, una volta che i quattro diversi tipi di β-glucani sono stati purificati con successo, sono stati testati i loro potenziali effetti sull'attivazione della microglia. L'immunofluorescenza è stata utilizzata contro due marcatori gold standard per la proliferazione e l'apoptosi22,23.
Nonostante nessuna differenza statistica nei tassi di proliferazione tumorale, P. ostreatus (A) e H. erinaceus (C) sono stati in grado di ridurre l'espressione di Ki67 fino al 50%. La mancanza di significato è probabilmente dovuta all'elevata varianza nello studio riguardante G. lucidum. Inoltre, l'induzione dell'apoptosi nelle cellule tumorali è un approccio terapeutico piuttosto interessante, e P. djamor (B) e H. erinaceus (C) hanno mostrato una significativa induzione dei livelli di cCasp3, suggerendo l'attivazione del programma di morte cellulare. Tutti questi risultati sono in accordo con studi precedenti che hanno mostrato l'effetto antitumorale di questi funghi in altri tipi di tumori24,25. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato, mantenendo le stesse condizioni e guidati dagli stessi ricercatori. L'analisi basata su software dei risultati degli studi di immunofluorescenza supporta un approccio imparziale e migliora la portata potenziale di questo studio.
In generale, questi studi hanno una sfida principale per quanto riguarda l'uso di β-glucani, che è la purezza dei composti. È obbligatorio perseguire i più alti standard al fine di confermare che gli effetti osservati, dopo il loro utilizzo negli studi immunologici, sono provocati esclusivamente dai carboidrati, e non dovuti a proteine o altre strutture che possono rimanere attaccate ad essi se la purificazione non viene eseguita adeguatamente. Un ulteriore passo che potrebbe essere considerato negli studi futuri è l'uso di tecniche cromatografiche (ad esempio, scambio ionico o esclusione dimensionale).
La conclusione generale dopo gli studi pone H. erinaceus come il candidato principale come potenziale opzione immunoterapeutica per il trattamento del glioblastoma, grazie alla sua capacità di ridurre la proliferazione tumorale (~ 50%) e indurre una forte attivazione del programma di morte cellulare nelle cellule di glioblastoma.
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Disclosures
Non ci sono interessi concorrenti da dichiarare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la dott.ssa Vasiliki Economopoulos per il suo script interno per misurare il segnale di fuluorescenza in ImageJ. Vorremmo anche ringraziare la CITIUS (Università di Siviglia) e tutto il loro personale per il loro sostegno durante la manifestazione. Questo lavoro è stato sostenuto dallo spagnolo FEDER I + D + i-USE, US-1264152 dell'Università di Siviglia, e dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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