Summary
Le présent protocole décrit les étapes de purification et les études ultérieures de quatre β-glucanes fongiques différents en tant que molécules immunomodulatrices potentielles qui améliorent les propriétés antitumorales de la microglie contre les cellules de glioblastome.
Abstract
L’un des plus grands défis dans le développement de thérapies efficaces contre le glioblastome est de surmonter la forte suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral. L’immunothérapie est apparue comme une stratégie efficace pour retourner la réponse du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux gliomes (GAM) sont les principaux moteurs de tels scénarios anti-inflammatoires. Par conséquent, l’amélioration de la réponse anticancéreuse dans les GAM peut représenter un traitement coadjuvant potentiel pour traiter les patients atteints de glioblastome. Dans cette veine, les molécules fongiques β-glucane sont connues depuis longtemps comme de puissants modulateurs immunitaires. Leur capacité à stimuler l’activité immunitaire innée et à améliorer la réponse au traitement a été décrite. Ces caractéristiques modulatrices sont en partie attribuées à leur capacité à se lier aux récepteurs de reconnaissance de formes, qui, fait intéressant, sont grandement exprimés dans les GAM. Ainsi, ce travail est axé sur l’isolement, la purification et l’utilisation ultérieure de β-glucanes fongiques pour améliorer la réponse tumoricide de la microglie contre les cellules de glioblastome. Les lignées cellulaires de glioblastome de souris (GL261) et de microglie (BV-2) sont utilisées pour tester les propriétés immunomodulatrices de quatre β-glucanes fongiques différents extraits de champignons fortement utilisés dans l’industrie biopharmaceutique actuelle: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum. Pour tester ces composés, des tests de co-stimulation ont été effectués pour mesurer l’effet d’un milieu conditionné par la microglie pré-activé sur la prolifération et l’activation de l’apoptose dans les cellules de glioblastome.
Introduction
Malgré l’avènement de nouvelles réalisations dans le domaine de la neuro-oncologie, l’espérance de vie des patients atteints de glioblastome reste maigre. Les thérapies de référence contre les tumeurs cérébrales sont basées sur la fusion de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, au cours de la dernière décennie, l’immunothérapie est apparue comme une stratégie puissante pour traiter différents types de cancer1. Ainsi, la possibilité d’exploiter la réponse immunitaire de l’organisme contre les cellules tumorales est récemment devenue le quatrième pilier de l’oncologie.
On sait depuis longtemps que l’un des plus grands défis dans le domaine est de surmonter la forte immunosuppression trouvée dans le microenvironnement tumoral2. En particulier, dans le cas du glioblastome, l’une des formes les plus courantes et les plus agressives de cancer du cerveau, démêler les voies clés qui orchestrent de tels scénarios pro-tumoraux et trouver de nouveaux composés qui pourraient contrecarrer la réponse déprimante du système immunitaire pourrait ouvrir la voie à de futures thérapies contre cette maladie incurable.
Le cerveau possède ses propres cellules du système immunitaire, et le type de cellule le plus pertinent est la microglie. Il a été prouvé que ces cellules ont un comportement assez complexe à travers différentes maladies centrales3. Dans le cas des tumeurs cérébrales primaires (par exemple, le glioblastome), ces cellules sont déplacées vers un phénotype anti-inflammatoire qui soutient les cellules tumorales pour coloniser le parenchyme cérébral3. De nombreuses publications ont renforcé le rôle majeur de ces cellules au cours de la progression tumorale. L’une des principales raisons en est que les microglies associées au gliome et les macrophages infiltrés (GAM) représentent un tiers de la masse tumorale totale, suggérant ainsi l’influence sans équivoque de leurs états d’activation au cours de la progression tumoralecérébrale 4,5.
Dans cette veine, les β-glucanes fongiques ont été décrits comme des molécules puissantes déclenchant des réponses immunitaires efficaces, y compris la phagocytose et la production de facteurs pro-inflammatoires, conduisant à l’élimination des agents pernicieux 6,7,8,9,10. Les β-glucanes fongiques ont généralement été étudiés en utilisant des extraits de différentes parties de champignons. Cependant, l’attribution d’effets spécifiques nécessite sa purification pour éviter les ambiguïtés et pouvoir comprendre le mécanisme d’action de telles molécules comme les agents immunomodulateurs8.
Dans ce travail, les β-glucanes solubles sont purifiés à partir de la fructification de quatre champignons différents, régulièrement utilisés comme champignons comestibles (Pleurotus ostreatus et Pleurotus djamor) et comme champignons médicinaux (Ganoderma lucidum et Hericium erinaceus). En particulier, ces quatre champignons sont très utilisés dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique et ont été produits dans le cadre d’une économie circulaire respectueuse de l’environnement dans une entreprise commerciale (voir le tableau des matériaux).
Afin de jeter les bases de l’utilisation future des β-glucanes fongiques dans les thérapies du cancer du cerveau, des stratégies de purification bien définies et des études précliniques approfondissant leur interaction présumée avec les cellules du système immunitaire sont essentielles pour évaluer leur rôle potentiel en tant que médiateurs antitumoraux. Ce travail décrit les nombreuses étapes d’isolement et de purification nécessaires pour récupérer les β-glucanes solubles contenus dans les fructifications du champignon sélectionné. Une fois purifiées avec succès, les cellules microgliales sont activées pour améliorer leur phénotype inflammatoire. Les cellules de glioblastome de souris (GL261) sont recouvertes d’un milieu différent conditionné par la microglie, préalablement traité avec ces extraits, puis son effet sur le comportement des cellules tumorales est évalué. Fait intéressant, des études pilotes de notre laboratoire (données non montrées) ont révélé comment la microglie pro-inflammatoire peut ralentir la migration des cellules tumorales et les propriétés d’invasion non seulement dans les cellules de glioblastome, mais aussi dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses. Ce travail multidisciplinaire peut fournir un outil utile aux chercheurs en oncologie pour tester des composés prometteurs capables de stimuler la réponse immunitaire dans de nombreux types de tumeurs.
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Protocol
Les quatre variantes différentes de champignons décrites dans ce protocole ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Isolement des β-glucanes fongiques
- Extraction et isolement des polysaccharides solubles des champignons
NOTE: Les polysaccharides solubles de champignons (SMP) ont été obtenus selon la procédure schématiquement illustrée à la figure 1.- Rincer doucement les fructifications fraîches de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum (environ 2 000 g/champignon) dans de l’eau distillée cinq fois.
- Sécher les corps des fruits à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à air conventionnelle jusqu’à ce qu’un poids constant soit atteint (~24 h).
- Broyer les champignons séchés dans un moulin à lames, en obtenant environ 200 g de poudre de chaque champignon.
- Suspendre 100 g de poudre de champignons (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum) dans 1 000 mL deH2Od. Ensuite, autoclaver à 121 °C pendant 15 min, et enfin laisser à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifuger la suspension obtenue à 6 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Sécher le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles (IMP) à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 h.
- Jeter le précipité et conserver le surnageant. Concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif.
- Précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol (concentration finale de 80 %) à 4 °C pendant une nuit.
- Centrifuger la suspension d’éthanol à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C, retenir la pastille (précipiter) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Laver le précipité trois fois avec de l’éthanol à 80% avant de le dissoudre dans H2Od (10% p/v). Ajuster le pH à 6,5/7 et la température à 37 °C, et traiter avec 2 u et 4 U de α-amylase et de glucoamylase, respectivement, pour solubiliser les α-glucanes en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Après le traitement par α-amylase/glucoamylase, ajuster le pH et la température à 8,0 et 50 °C, respectivement, et traiter avec de l’alcalase (2,5 U/g de protéines) (voir le tableau des matières) pour solubiliser les protéines.
REMARQUE: Ce traitement enzymatique séquentiel élimine la plupart des α-glucanes et des protéines qui coprécipitent avec les β-glucanes dans la précipitation de l’éthanol. - Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C et le surnageant propre concentré cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau avec de l’éthanol à 80%.
- Solubiliser le précipité résultant dansH2Odet dialyser dans de l’eau distillée pendant 24 h à l’aide de membranes de tubes en cellulose (membranes de coupure de 12 000 Da; voir le tableau des matériaux) pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire. Récupérer la partie soluble dans l’eau et la lyophiliser pour produire des β-glucanes solubles (SβGs).
- Mesure du sucre et des protéines
- Mesurer la teneur totale en sucre de chaque fraction par la méthode de l’acide phénol-sulfurique, en utilisant le glucose comme norme8.
NOTE: La quantification de la teneur en β-glucane peut également être effectuée à l’aide de la trousse de dosage du β-glucane (champignon et levure; voir le tableau des matériaux), basée sur l’hydrolyse enzymatique et l’activité des oxydoréductases: à savoir l’exo-1,3-β-glucanase, la glucose oxydase, la β-glucosidase et la peroxydase, avec formation ultérieure de la quinoneimine. Suivez les instructions du fabricant, avec de légères modifications. - Utilisez 18 MH 2 SO4 au lieu de 12 MH2SO4.
- Évaluer séparément la teneur en glucanes totaux et en α-glucanes.
- Mesurez les valeurs de β-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et de α-glucane (triplicate) selon le protocole de Kjeldahl. Dans certains cas, la teneur en protéines peut être déterminée par la méthode de Lowry, en utilisant l’albumine pour tracer la courbe d’étalonnage11,12.
- Mesurer la teneur totale en sucre de chaque fraction par la méthode de l’acide phénol-sulfurique, en utilisant le glucose comme norme8.
- Analyse par spectroscopie d’absorption ultraviolette
- Obtenir les spectres ultraviolets (UV) SβG à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible (voir le tableau des matériaux) en balayant les échantillons dans la région de 200 à 400 nm (Figure 2).
- Préparer 1,0 mg/mL de chaque SβG dansH2O, transférer la solution dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante.
- Analyse de la distribution du poids moléculaire
- Estimer l’homogénéité des SβG et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion granulométrique (SEC) à l’aide d’un système de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (voir Tableau des matériaux) équipé d’un détecteur d’indice de réfraction et d’une colonne de filtration linéaire sur gel ultra-hydrogel (300 mm x 7,8 mm; Graphique 3).
- Effectuer l’essai à 40 °C en utilisant de l’eau désionisée comme éluant à un débit de 0,5 mL/min-1 et des dextranes (110, 80 et 50 kDa) comme étalons (voir le tableau des matériaux). Recueillir une fraction de 5 mL.
- Analyse infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)
- Enregistrer les spectres infrarouges (Figure 4) sur un spectromètre FTIR dans la plage de 4000-500 cm-1. Les échantillons doivent être préalablement mélangés avec du KBr pour former des films (procédure IRTF standard; voir les instructions du fabricant et le tableau des matériaux).
- Analyse de la composition moléculaire
- Estimer les compositions moléculaires des SβG par chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) ainsi que par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), en suivant les procédures standard12.
2. Étude in vitro de la stimulation microgliale induite par le β-glucane
- Culture cellulaire de cellules de glioblastome et de microglie de souris dans des lames de chambre à 8 puits
REMARQUE: Ce protocole est spécifique pour les lignées cellulaires GL261 (glioblastome) et BV2 (microglie). Cependant, avec de légères modifications, ces étapes pourraient potentiellement être utilisées pour étudier d’autres lignées cellulaires cancéreuses et immunitaires.- Préparer le milieu complet Eagle’s medium modifié (DMEM) de Dulbecco modifié avec du L-glutamine, 4,5 g/L de D-glucose et sans pyruvate. Ajouter 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matières). Préchauffer le matériau au bain-marie à 37 °C pendant 15 min.
- Décongeler les aliquotes BV2 et GL261 congelées dans un bain-marie (37 °C) pendant 2 min, et juste avant qu’elles ne décongèlent complètement, les transporter dans une hotte à flux laminaire et plaquer les cellules dans deux flacons T25 stériles différents (un pour chaque lignée cellulaire).
- Incuber les fioles T25 à 37 °C, 5% CO2 jusqu’à ce que la culture soit confluente.
NOTE: Selon les conditions de congélation et le temps de cryoconservation, le temps jusqu’à la confluence peut varier. Ces lignées cellulaires ont généralement besoin de 3 à 5 jours pour atteindre la confluence dans un flacon T75. - Une fois que la culture cellulaire BV2 devient confluente, transférez-la dans des lames de chambre à 8 puits 0,6 x 106 cellules / puits. Conservez les lames de chambre à 8 puits dans l’incubateur pendant 24 h.
- Une fois que les cellules microgliales sont plaquées dans les lames de chambre à 8 puits, répétez le même protocole avec les cellules GL261.
- Activation de la microglie avec des β-glucanes
- Enduisez les cellules BV2 de quatre β-glucanes différents (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus) à une concentration de 0,2 mg/mL pendant 72 h. Une condition expérimentale doit rester non traitée (milieu normal), agissant comme groupe témoin.
- Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette après 72 h et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 μm. Ensuite, congeler le surnageant à -80 °C pendant au moins 24 h.
- Traitement du GL261 avec un milieu pré-activé conditionné par la microglie
- Une fois que le GL261 est confluent à 80 % dans les lames de la chambre à 8 puits, ajouter un milieu microglial traité au β-glucane (étape 2.2.2) à une concentration volumique finale de 25 % pendant 72 h (volume total : 250 μl/puits).
- Retirez le milieu après 72 h d’incubation et jetez-le.
- Laver les cellules avec une solution saline tampon phosphate (PBS; pH 7,4, 0,1 M) trois fois pendant 5 minutes.
- Fixez les cellules en ajoutant 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Selon les différents anticorps qui pourraient être utilisés pour l’immunofluorescence, les méthodes de fixation peuvent différer de la PFA typique à 4%. Les fixateurs à base d’alcool peuvent être plus efficaces pour préserver certains épitopes.
- Étude d’immunofluorescence
- Laver les échantillons avec du PBS avec du triton X (PBST; 0,01%) pendant 10 minutes trois fois.
- Retirer le PBST et ajouter le tampon bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 10 % dans le PBST (tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.
- Retirer le tampon de blocage et ajouter 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps primaires (anticorps monoclonal Ki-67 de rat 1:500 et anticorps de caspase-3 clivé de lapin 1:500; voir le tableau des matières). Incuber pendant une nuit à 4 °C.
- Après 24 h d’incubation à 4 °C, laisser les échantillons à température ambiante pendant 30 min.
- Lavez les puits trois fois pendant 10 min avec du PBS sur un agitateur (basse vitesse).
- Retirer le PBS et le remplacer par 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps secondaires (anticorps secondaires 1:200 IgG anti-rat d’âne (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé, Alexa Fluor 488 et 1:200 IgG anti-lapin (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé par des oreilles croisées, Alexa Fluor 647; voir Tableau des matériaux) pendant 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
- Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min sur un agitateur polyvalent.
- Retirer le PBS et ajouter 200 μL par puits de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans du PBS (1:5 000) pendant 1 min.
- Retirer le DAPI (voir Tableau des matières) et laver les cellules pendant 5 min dans du PBS.
- Retirez le cadre du puits et ajoutez 50 μL de PBS:glycérol (1:1) sur chaque puits et couvrez avec une lamelle de couverture.
- Scellez les lames avec du vernis à ongles.
- Acquérir des images à 20x à l’aide d’un système de microscope confocal (voir Tableau des matériaux).
3. Quantification et analyse de la prolifération et de l’apoptose des cellules tumorales
REMARQUE : Afin de mesurer l’effet potentiel des différents β-glucanes sur la prolifération et l’apoptose des cellules tumorales, un script interne a été utilisé dans le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de pixels positifs de Ki67 (prolifération) et cCasp3 (apoptose)13.
- Ouvrez ImageJ. Cliquez sur le bouton Plugins . Cliquez sur Coloc2, un plugin précédemment installé dans le dossier plugin, et enfin sélectionnez l’image à analyser11.
REMARQUE: Ce plugin était disponible suite à un contact précédent avec le Dr Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Au lieu du script, les logiciels ImageJ et Fiji ont des outils différents pour l’analyse de la colocalisation (voir Tableau des matériaux), avec des propriétés similaires. - Définissez des seuils en fonction des conditions de contrôle (non traité, DMEM uniquement). Cliquez sur le bouton OK .
REMARQUE: Afin d’éviter les différences d’arrière-plan et d’intensité, toutes les images doivent être prises dans les mêmes conditions. De préférence, les séances d’imagerie doivent être effectuées le même jour et les paramètres du microscope ne sont pas modifiés d’une image à l’autre. - Assurez-vous que les images résultantes des pixels colocalisés et une fenêtre récapitulative indiquant le pourcentage ou le nombre brut de pixels au-dessus du seuil apparaissent. Normaliser les résultats par rapport aux conditions de contrôle (non traitées).
NOTE: Toutes les données sont données sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matériaux). Une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisée. Les erreurs sont représentées par l’erreur-type de la moyenne (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
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Representative Results
Purification réussie des β-glucanes
La masse de MP, SMP et SβG obtenue à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus après le processus d’extraction et de purification est résumée dans le tableau 1. La composition de base (glucides totaux, β-glucanes et protéines) des MP, SMP et SβG obtenus à partir des champignons est représentée dans le tableau 2. Ces résultats montrent comment le protocole a permis la récupération d’une grande quantité de protéines dans les SMP. Cependant, le traitement enzymatique à la α-amylase/glucoamylase et à la protéase a réduit la quantité de protéines et augmenté la concentration de β-glucane.
Les spectres UV des différents SβG n’ont montré aucun pic d’absorption UV à 260 et 280 nm (Figure 2A), indiquant que les SβG manquaient d’acides nucléiques (260 nm) et de protéines (280 nm). De plus, l’homogénéité des SβG a été testée par spectroélectrochimie d’absorption UV-visible (SEC). Les chromatogrammes (figure 3) ont montré une bonne homogénéité, avec un pic principal aigu et unique à 8,20, 10,5, 10,9 et 11,3 minutes pour H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus et P. djamor, respectivement. Ces données suggèrent que la fraction est compatible avec les homopolymères. De plus, la moyenne pondérale Mw a été calculée autour de 120,8, 92,8, 80,7 et 75,9 kDa pour H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus et P. djamor, respectivement, selon l’équation de la courbe d’étalonnage (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
Les spectres FTIR ont mesuré les vibrations moléculaires qui correspondaient aux liaisons polysaccharidiques covalentes (Figure 4). Les spectres présentaient un groupe hydroxyle large et intense à environ 3 435 cm-1. Il a également montré un faible pic d’étirement C-H à environ 2 922 cm-1, correspondant aux polysaccharides14. De plus, l’absorbance à environ 1 641 cm-1 pourrait être attribuée à l’amide I15, liée aux vibrations d’allongement des groupes C=O et CN. Le signal à environ 1 154 cm-1 pourrait être dû à l’étirement asymétrique C-O-C de la liaison glycosidique16. Enfin, la bande à environ 1 072 cm-1 indiquait un étirement C-O des β-glucanes 16. La faible absorption proche de 893 cm-1 pourrait être due à la vibration de réfraction asymétrique du β-pyranose, montrant la β-configuration des unités de sucre17. Dans l’ensemble, les SβG se sont avérés principalement constitués de glucides conjugués à une quantité minimale de protéines.
Le profil monosaccharidique des SβG a été étudié plus avant par HPTLC et GC-MS. La présence d’une grande quantité de D-glucose avec de plus petites quantités de D-galactose et de D-mannose et une trace de D-xylose, D-rhamnose, D-fucose et L-arabinose a été confirmée. Le tableau 3 résume les résultats obtenus pour les SβG de H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus et P. djamor.
Milieu conditionné par la microglie, préactivé par le β-glucane, apoptose induite dans les cellules cancéreuses
Une fois que les β-glucanes des champignons sélectionnés ont été isolés avec succès et entièrement caractérisés, ils ont été ajoutés à la culture cellulaire microgliale (BV2). 72 h après l’ajout d’un milieu conditionné par la microglie aux cellules GL261 (Figure 5), l’expression de deux marqueurs clés de la prolifération (Ki67) et de l’apoptose (caspase clivée 3 [cCasp3]) a été mesurée par immunofluorescence. À l’aide d’un script interne dans le logiciel ImageJ, le nombre de pixels positifs pour chaque canal fluorescent a été quantifié, et donc la façon dont l’effet potentiel de l’activation microgliale induite par le β-glucane peut affecter le comportement des cellules tumorales a été analysée. En utilisant des échantillons témoins comme seuil d’intensité de chaque fluorophore, le script fournissait le nombre de pixels et, ainsi, indiquait l’expression de chaque marqueur après les différentes conditions expérimentales (Figure 6).
Fait intéressant, le GL261 n’a subi aucune différence significative en ce qui concerne la prolifération tumorale une fois exposé aux différents milieux conditionnés par la microglie (Figure 7). Cependant, P. djamor (B) et H. erinaceus (C) ont montré une forte induction (environ six fois et neuf fois, respectivement) de cCasp3.
Figure 1 : Protocole d’isolement. Schéma du protocole pour isoler et purifier la préparation de SβG à partir de P. streatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Spectres UV des β-glucanes. Spectres UV dans la région 200-400 nm de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor et (D) H. erinaceus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Chromatogrammes d’exclusion de taille. Chromatogrammes d’exclusion granulométrique de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor et (D) H. erinaceus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Spectres FTIR. Spectres infrarouges à transformée de Fourier (FTIR) de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor et (D) H. erinaceus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Schéma des essais de costimulation. Essai de costimulation où les cellules microgliales de souris (BV2) ont été recouvertes de β-glucanes pendant 72 heures. Après avoir été cryoconservé et filtré, le surnageant a été recueilli et transféré dans une culture cellulaire GL261 (25%) pendant 72 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images de prolifération et d’apoptose. Images d’immunofluorescence montrant une triple colocalisation de GL261 avec DAPI (bleu), Ki67 (vert) et cCasp3 (rouge). Le script 'Prob Coloc' (images du bas) a permis de quantifier le nombre de pixels positifs de chaque marqueur et de les colocaliser entre eux. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Quantification des taux de prolifération et d’apoptose. Valeurs normalisées par rapport aux conditions de contrôle (DMEM) de Ki67 (à gauche) et à l’expression de cCasp3 (à droite) dans les cellules GL261 après l’exposition du milieu conditionné par la microglie. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Les erreurs sont représentées par s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| MP (g) | PSM (g) | SβG (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1 %) | 5,3 ± 0,2 (2,6 %) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7 %) | 4,9 ± 0,3 (2,4 %) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3 %) | 5,5 ± 0,2 (2,7 %) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5 %) | 5,7 ± 0,2 (2,8 %) |
Tableau 1 : Tableau de la teneur en glucane. Bilan massique pour l’obtention de MP, SMPs et SβG à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus.
| Député | SMP | SβG | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-glucane (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Protéines (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-glucane (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Protéines (%) | 19,9 ± 1,0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glucane (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Protéines (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glucane (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Protéines (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tableau 2 : Glucides totaux. Poids sec (g) teneur en glucides totaux (CHt), β-glucane et protéines MP, SMP et SβGs. Teneur en protéines (MP) quantifiée par la méthode Kjeldah12. (*, protéines quantifiées par la méthode de Lowry9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-arabe (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2,1 ± 0,2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | s.d. |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2,6 ± 0,2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | s.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | s.d. | s.d. | s.d. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1,1 ± 0,1 | 0,3 ± 0,1 | s.d. | s.d. | s.d. |
Tableau 3 : Caractérisation des monosaccharides. Profil monosaccharidique des SβG de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus (s.d., certains monosaccharides étaient indétectables).
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Discussion
Ce travail décrit l’utilisation de techniques bien établies pour isoler, purifier et caractériser avec succès la teneur en SβG de quatre champignons différents. Les résultats ont montré comment, après l’extraction à l’eau chaude des SMP, obtenue à partir de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus, suivie d’un traitement hydrolytique à la α-amylase, à la glucosidase et à la protéase, la teneur en α-glucane et en protéines a été réduite, enrichissant ainsi de manière significative la quantité de SβG purs.
Malgré cela, nous avons observé que la plupart des β-glucanes fongiques étaient insolubles dans l’eau pendant le processus de purification. L’intérêt principal de l’étude était les SβG, en raison de leurs propriétés médico-pharmaceutiques10,18. En outre, grâce au traitement hydrolytique, à la précipitation à l’éthanol et à la dialyse, les glucides solubles de faible poids moléculaire, les peptides, les oligopeptides et les acides aminés ont été retirés avec succès des SMP, montrant une efficacité similaire à d’autres travaux antérieurs utilisant un type de champignon différent mais avec des processus similaires19,20.
Pour tester la pureté des SβG, les spectres UV des différents SβG ont été étudiés par spectrophotométrie UV, en balayant les échantillons dans la région 200-400 nm. Aucun pic d’absorption UV n’a été observé à 260 et 280 nm, indiquant que les SβG n’avaient ni acides nucléiques (260 nm) ni protéines (280 nm), montrant ainsi à nouveau que les β-glucanes constituaient principalement les SβG. Bien que les spectres UV dans la région de 200-400 nm aient montré l’absence de tout pic défini/pointu à 280 nm, un petit pic a quand même pu être observé. Cela pourrait s’expliquer par la présence d’une petite quantité de protéines liées aux polysaccharides, en accord avec les résultats présentés dans le tableau 2. Cependant, il est intéressant de considérer qu’une quantité aussi négligeable de polysaccharides pourrait également s’expliquer par l’accès tardif aux protéines restantes, qui peuvent être protégées par des glucanes ou par des effets stériques qui empêchent la dégradation complète des protéines liées au glucane. Il est important de noter que l’homogénéité des SβG a été testée par SEC, une technique analytique puissante utilisée pour purifier les molécules dissoutes par taille, ce qui a confirmé les résultats du protocole.
De plus, les spectres FTIR ont été utilisés pour mesurer les vibrations moléculaires correspondant aux liaisons polysaccharidiques covalentes. Comme décrit précédemment, des spectres similaires ont été obtenus pour les quatre champignons. La caractéristique spectrale a montré la présence de polysaccharides14, d’amides I 15 et de β-glucanes16. La faible absorption proche de 893 cm-1 suggère la β-configuration des unités de sucre17. Dans l’ensemble, les SβG se sont avérés être principalement formés par des glucides conjugués avec un minimum de protéines. En ce qui concerne l’intérêt d’utiliser les SβG comme molécules immunomodulatrices, il convient de souligner que les complexes polysaccharide-protéine sont souvent notés pour leurs avantages immunomodulateurs21.
Enfin, le profil monosaccharidique des SβG a été étudié par HPTLC et GC-MS. La présence d’une grande quantité de D-glucose avec de plus petites quantités de D-galactose et de D-mannose et des traces de D-xylose, D-rhamnose et D-fucose implique strictement que le composant prédominant dans les SβG est le β-glucane. Cependant, il est important de préciser que notre système de purification résulte de l’optimisation de différentes procédures classiques. Nous travaillons actuellement à l’amélioration de plusieurs étapes, principalement axées sur les techniques de chromatographie (exclusion de taille et chromatographie par échange d’ions).
En ce qui concerne l’objectif principal de ce travail, qui était de tester l’impact des β-glucanes sur les cellules immunitaires, une fois que les quatre types différents de β-glucanes ont été purifiés avec succès, leurs effets potentiels sur l’activation de la microglie ont été testés. L’immunofluorescence a été utilisée contre deux marqueurs de référence pour la prolifération et l’apoptose22,23.
Malgré l’absence de différences statistiques dans les taux de prolifération tumorale, P. ostreatus (A) et H. erinaceus (C) ont pu réduire l’expression de Ki67 jusqu’à 50%. Le manque d’importance est probablement dû à la forte variance de l’étude concernant G. lucidum. De plus, l’induction de l’apoptose dans les cellules cancéreuses est une approche thérapeutique plutôt intéressante, et P. djamor (B) et H. erinaceus (C) ont montré une induction significative des niveaux de cCasp3, suggérant l’activation du programme de mort cellulaire. Tous ces résultats sont conformes aux études précédentes qui ont montré l’effet anti-tumoral de ces champignons dans d’autres types de tumeurs24,25. Les expériences ont été réalisées en double, en maintenant les mêmes conditions et dirigées par les mêmes chercheurs. L’analyse logicielle des résultats des études d’immunofluorescence soutient une approche impartiale et améliore la portée potentielle de cette étude.
En général, ces études ont un défi principal concernant l’utilisation des β-glucanes, qui est la pureté des composés. Il est obligatoire de poursuivre les normes les plus élevées afin de confirmer que les effets observés, après leur utilisation dans des études immunologiques, sont exclusivement provoqués par les glucides, et non par des protéines ou d’autres structures qui peuvent rester attachées à eux si la purification n’est pas effectuée de manière adéquate. Une étape supplémentaire qui pourrait être envisagée dans les études futures est l’utilisation de techniques de chromatographie (p. ex., échange d’ions ou exclusion de taille).
La conclusion générale après les études place H. erinaceus comme le premier candidat comme option immunothérapeutique potentielle pour le traitement du glioblastome, en raison de sa capacité à réduire la prolifération tumorale (~50%) et induire une forte activation du programme de mort cellulaire dans les cellules de glioblastome.
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Disclosures
Il n’y a pas d’intérêts concurrents à déclarer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Vasiliki Economopoulos pour son script interne permettant de mesurer le signal de fuluorescence dans ImageJ. Nous tenons également à remercier le CITIUS (Université de Séville) et tout leur personnel pour leur soutien lors de la manifestation. Ce travail a été soutenu par le FEDER espagnol I + D + i-USE, US-1264152 de l’Université de Séville, et le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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