Summary
في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لتسهيل نقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين اثنين من مقاييس التدفق الخلوي في مختبرين للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال اليابانيين الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ. ستسمح طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي بإجراء مشاريع بحثية بفعالية في مراكز متعددة.
Abstract
يحتاج عدد متزايد من المختبرات إلى جمع البيانات من أجهزة قياس التدفق الخلوي المتعددة ، خاصة للمشاريع البحثية التي يتم إجراؤها عبر مراكز متعددة. تشمل تحديات استخدام مقياسين خلويين للتدفق في مختبرات مختلفة نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة لأجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة. لإنشاء تجربة قياس التدفق الخلوي الموحدة لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية عبر مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لنقل المعلمات عبر مقاييس التدفق الخلوي المختلفة.
سمحت الطرق التي تم تطويرها في هذه الدراسة بنقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين مقياسين للتدفق الخلوي في مختبرات مختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني (JE). تم الحصول على شدة مضان متسقة بين اثنين من أجهزة قياس الخلايا باستخدام حبات قياسية مضان لتحديد إعدادات مقياس الخلايا. تم الحصول على نتائج قابلة للمقارنة في مختبرين بأنواع مختلفة من الأدوات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا توحيد التحليل لتقييم الوظيفة المناعية للأطفال الذين تم تطعيمهم في JE في مختبرات مختلفة بأدوات مختلفة ، وتقليل الاختلافات في البيانات والنتائج بين أجهزة قياس التدفق الخلوي في مراكز متعددة ، وتوفير نهج عملي للاعتماد المتبادل لنتائج المختبر. ستضمن طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي الأداء الفعال للمشاريع البحثية عبر مراكز متعددة.
Introduction
يعد توحيد قياس التدفق الخلوي مفيدا لمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من أجهزة قياس الخلايا المختلفة عبر المختبرات ومراكز الدراسة المختلفة ، ويؤدي إلى الاعتراف المتبادل بالنتائج لتحسين كفاءة العمل. وهناك عدد متزايد من السيناريوهات التي تتطلب توحيدا. أثناء عملية تطوير الدواء ، يعد توحيد قياس التدفق الخلوي أمرا مهما ، حيث أن الفحص المطور والمعتمد سيدعم عملية تطوير الدواء بأكملها من التحليل قبل السريري إلى التحليل السريري. كثيرا ما يتم نقل طرق قياس التدفق الخلوي بين صناعة الأدوية والمختبرات المتعاونة1. علاوة على ذلك ، من الضروري الحصول على بيانات قابلة للمقارنة من الدراسات السريرية متعددة المراكز. على سبيل المثال ، تم تطوير سير عمل التوحيد القياسي في مشروع الأبحاث السريرية متعددة المراكز لأمراض المناعة الذاتية الجهازية للحصول على بيانات قابلة للمقارنة من قياس التدفق الخلوي متعدد المراكز2.
توحيد طرق قياس التدفق الخلوي يمثل تحديا. تعزى التحديات التي تواجهها المختبرات إلى نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة بين مقاييس التدفق الخلوي المختلفة واستراتيجيات البوابات المتباينة بين المراكز 3,4. لذلك ، من المهم إجراء تحليل الفجوة بين المختبرات. يجب مراجعة الوصول إلى العينات وأنظمة الجودة ومؤهلات الموظفين وتكوين الأداة لضمان تلبية المتطلبات.
في الوقت الحاضر ، الأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح التهاب الدماغ الياباني (JE) لديهم انخفاض كبير في حدوث JE5. يمكن أن تساعد مراقبة الخلايا المناعية للدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم ، والعلاقة بين التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي وتأثيرات التطعيم. نظرا للاستقرار المحدود لعينات الدم الكاملة ، غالبا ما يتم إجراء تقييمات لفعالية اللقاح في مراكز متعددة. في هذا التحليل ، حددنا خلايا CD8 + أو CD4 + T الساذجة على أنها CD27 + CD45RA+ ، وخلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM) على أنها CD27 + CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (TEM) على أنها CD27- CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة المتمايزة نهائيا (TEMRA) على أنها CD27- CD45RA+. يمكن فصل خلايا CD19 + B إلى مجموعات تعبر عن CD27 مقابل IgD 6,7 ، ويمكن تحديد الخلايا البائية الساذجة التي تعبر عن خلايا الذاكرة البائية CD27n (mBCs) بناء على تعبير IgD6 ، ويمكن تحديد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) على أنها CD4 + CD25 + + CD127 منخفضة 8. لإنشاء تجربة موحدة لقياس التدفق الخلوي لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية في مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لتسهيل نقل البروتوكولات عبر أجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الدم الكامل للأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE. تم تجنيد ستة أطفال أصحاء (2 سنة) من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية. بعد تلقي التطعيم الأولي والتطعيم المعزز بلقاح JE SA14-14-2 الموهن الحي قبل أقل من 6 أشهر ، تم جمع عينات الدم المحيطية من المتطوعين. تم الحصول على بيانات قابلة للمقارنة بدرجة كبيرة من أدوات مختلفة باتباع إجراءات موحدة ، وهو أمر مفيد للتقييمات متعددة المراكز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية (رقم الموافقة: 2020-k-85). تم التنازل عن الموافقة المستنيرة للمواضيع البشرية حيث تم استخدام العينات المتبقية فقط بعد الاختبارات السريرية في هذه الدراسة. يشارك مختبران في هذه الدراسة. مختبر النقل هو المكان الذي تم فيه تطوير الطريقة الموحدة باستخدام مقياس تدفق خلوي واحد. يشار إلى مقياس الخلايا في هذا المختبر فيما يلي باسم مقياس المقياس الخلوي A. مختبر طريقة الاختبار هو المختبر الذي يستقبل الطرق باستخدام مقياس تدفق خلوي آخر ، ويشار إلى مقياس الخلايا في هذا المختبر فيما يلي باسم مقياس التدفق الخلوي B.
1. جمع عينات الدم المحيطية وإعداد الخلايا
- اجمع عينات الدم المحيطية (2 مل) من الأطفال الذين تم تطعيمهم في JE والأطفال غير الملقحين في أنابيب EDTA-K2 المضادة للتخثر عن طريق بزل الوريد القياسي.
- امزج عينة الدم بأكملها عن طريق قلب الأنابيب رأسا على عقب 10x. أضف 100 ميكرولتر من الدم الكامل إلى أنبوب 12 مم × 75 مم. اجعل كل عينة من نسختين.
- أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبقع اللامع (BV buffer) إلى أنبوب 12 مم × 75 مم. أضف 5 ميكرولتر من كل جسم مضاد (CD45 ، CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD127 ، CD27 ، CD19 ، IgD ؛ عامل التخفيف: 1:20) و 20 ميكرولتر من الجسم المضاد (CD25 ، CD45RA ؛ عامل التخفيف: 1: 5) إلى المخزن المؤقت BV. دوامة بلطف.
ملاحظة: يتم عرض أحجام ومعلومات كواشف الأجسام المضادة في الجدول 1. - أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى الأنبوب مع عينة الدم بأكملها. دوامة بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- قم بتخفيف محلول التحلل 10x 1:10 بالماء المقطر لتحضير محلول تحلل 1x. تحلل عينات الدم بإضافة 2 مل من محلول التحلل 1x. دوامة بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وصب طاف.
- أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وصب المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في 0.5 مل من 1x PBS واخلطها جيدا. يحفظ في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية. إرسال العينات إلى المعملين لتحليل التدفق الخلوي.
ملاحظة: يجب معالجة عينة التحكم السلبية والتحكم أحادي الخلية في وقت واحد.
2. إعداد حبات التعويض والتحكم في بقعة واحدة
- التسمية V500-anti-CD45 أحادية اللون ، APC-H7-anti-CD3 أحادية اللون ، FITC-anti-CD4 أحادية اللون ، R718-anti-CD8 أحادية اللون ، BV605-anti-CD27 أحادية اللون ، APC-anti-CD45RA أحادية اللون ، PE-anti-CD25 أحادية اللون ، BV421-anti-CD127 أحادية اللون ، BB700-anti-CD19 أحادية اللون ، وأنابيب PE-CY7-anti-IgD أحادية اللون.
- أضف 100 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) إلى أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل.
- أضف 50 ميكرولتر من الخرز السالب و 50 ميكرولتر من حبيبات Ig المضادة للفأر ، κ إلى كل أنبوب ودوامة.
- أضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد مسمى (CD45 ، CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD25 ، CD127 ، CD45RA ، CD27 ، CD19 ، IgD) إلى أنبوب مصبوغ واحد. يحوم المزيج برفق ويحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية).
- أعد تعليق الخرزات في 2 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وصب المادة الطافية.
- أعد تعليق الخرزات في 0.5 مل من 1x PBS واخلطها جيدا. يحفظ في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية.
3. استخدام أسماء تكوين متطابقة على أجهزة قياس الخلايا المختلفة في مختبرين
- قم بإنشاء تكوين جديد في برنامج مقياس الخلايا A. انقر فوق الزر Cytometer واختر عرض التكوينات لعرض نافذة التكوين.
- في قائمة التكوين، انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد التكوينات الأساسي، واختر مجلد جديد، وأعد تسميته.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق التكوين الأساسي واختر نسخ.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق المجلد الجديد والصق التكوين الأساسي لإنشاء تكوين جديد. إعادة تسمية التكوين الجديد "نقل الطريقة الموحدة".
- اسحب اسم المعلمة، مثل FITC، من قائمة المعلمات إلى الكاشف المناسب (530/30).
- قم بتحرير معلمات إضافية (PE و BB700 و PE-CY7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605) إلى التكوين الجديد.
- اتبع هذه الطريقة لإنشاء تكوين جديد على نموذج مقياس تدفق خلوي مختلف باستخدام نفس الاسم "نقل الطريقة الموحدة". تأكد من أن التكوين يتضمن نفس المعلمات لكل كاشف.
ملاحظة: لتحديد قالب التجربة بنجاح على نموذجي مقياس التدفق الخلوي المختلفين، تأكد من تناسق الاسم. - تحت تكوينات مقياس الخلايا ، استخدم خرز إعداد مقياس الخلايا وتتبعه (CST) لتحديد خط الأساس لمقياس الخلايا وتتبع أداء مقياس الخلايا. انقر فوق الزر Cytometer واختر CST لعرض إعداد مقياس الخلايا ومساحة عمل التتبع.
- أضف ثلاث قطرات (150 ميكرولتر) من حبات الإعداد إلى 0.5 مل من 1x PBS في أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل. ضع أنبوب الخرز على مقياس الخلايا.
- في نافذة التحكم في الإعداد ، اختر تعريف الأساس، وانقر فوق تشغيل.
4. توحيد التجربة باستخدام مقياس الخلايا A في مختبر النقل
- قم بإجراء فحص أداء باستخدام إعداد مقياس الخلايا وتتبع الخرز للتحقق من أن مقياس الخلايا يعمل بشكل جيد.
- في نافذة مستعرض البرامج، انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا واختر إعدادات التطبيق لإنشاء ورقة عمل.
- باستخدام عينة غير ملوثة ، اضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) ل FSC و SSC وجميع معلمات التألق. FSC: 260 ؛ SSC: 460 ؛ FITC: 490 ؛ PE: 575 ؛ BB700: 620 ؛ PE-CY7: 640 ؛ APC: 600 ؛ R718: 620 ؛ APC-H7: 620 ؛ BV421: 466 ؛ V500: 420 ؛ و BV605: 505.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا التجريبي واختر إعدادات التطبيق لحفظه.
- انقر على زر التجربة واختر قائمة إعداد التعويض . ثم اختر إنشاء عناصر تحكم في التعويض لإضافة عناصر التحكم في التعويض تلقائيا.
- تسجيل البيانات لجميع حبات التحكم في التعويض.
- انقر على التجربة واختر إعداد التعويض. ثم احسب التعويض تلقائيا.
- تسجيل البيانات لعناصر التحكم أحادية اللون للخلية.
- استخدم CD45RA APC لتعديل قيمة التعويض من R718 إلى 15٪ APC. استخدم CD19 BB700 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 14٪ BB700. استخدم CD8 R718 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 60٪ R718.
- سجل البيانات لخرز CST.
- قم بإنشاء ورقة عمل عمومية لقالب القيمة الهدف للخرز اللامع CST.
- باستخدام مخطط FSC / SSC ، ارسم بوابة المضلع للخرز اللامع CST. احصل على مخططات الرسم البياني ل 10 قنوات مضان للخرز اللامع CST: FITC و PE و BB700 و PE-Cy7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605. إنشاء بوابات الفاصل الزمني في مخططات الرسم البياني. قم بإنشاء طريقة عرض الإحصائيات من خلال إظهار وسيط بوابات الفاصل الزمني.
- تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي ؛ جمع ما مجموعه 25000 الخلايا الليمفاوية.
- إنشاء ورقة عمل عمومية لقالب التحليل للعينات.
- استخدم نموذج استراتيجية البوابة التالية:
- باستخدام مخطط نقطي CD45 / منطقة التشتت الجانبية (SSC-A) ، ارسم بوابة المضلع لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة مع استبعاد الحطام.
- باستخدام مخطط نقطي CD3 / CD19 ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد خلايا CD3 + T وخلايا CD19 + B.
- باستخدام مخطط نقطي CD4 / CD8 ، ارسم بوابة رباعية لتحديد خلايا CD4 + أو CD8 + T (خلايا ذات مضان عالي لهذه العلامات ، على التوالي).
- باستخدام مخطط نقطي CD45RA/CD27، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا CD8+ أو CD4+ T إلى خلايا ساذجة (CD27+CD45RA+) وTCM (CD27+ CD45RA-) وT EM (CD27-CD45RA-) وTEMRA (CD27-CD45RA+).
- باستخدام مخطط نقطي CD25 / CD127 ، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا CD4 + T إلى خلايا Treg (CD4 + CD25 + + CD127 منخفضة).
- باستخدام مخطط نقطي CD27 / IgD ، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا CD19 + B إلى خلايا B ساذجة (CD27-IgD +) وخلايا ذاكرة B (CD27 + IgD-).
- احفظ القالب التجريبي على مقياس الخلايا A.
- استخدم القرص المضغوط لتصدير القالب التجريبي.
5. نقل القالب التجريبي إلى مقياس الخلايا B في مختبر طريقة الاختبار
ملاحظة: يتضمن القالب التجريبي إعدادات الجهاز وقالب التحليل وقالب القيمة المستهدفة لمتوسط شدة التألق (MFI).
- قم بإجراء فحص الأداء باستخدام حبات CST للتحقق من أن مقياس الخلايا يعمل بشكل جيد.
- استيراد القالب التجريبي وإنشاء تجربة لمقياس الخلايا B باستخدام القالب.
- استخدم نفس الكمية من حبات CST لضبط جهد معلمة الفلورسنت لكل قناة مضان لتتناسب مع أداة MFI السابقة.
ملاحظة: تختلف قيم MFI في حدود ±5٪ (يظهر في الجدول 2 MFI للخرز اللامع قبل وبعد النقل). - اضبط الجهد ل FSC باستخدام العينة غير الملوثة ، إذا لزم الأمر.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا التجريبي واختر إعدادات التطبيق لحفظ إعدادات التطبيق .
- استخدم CD45RA APC لتعديل قيمة التعويض من R718 إلى 15٪ APC. استخدم CD19 BB700 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 24٪ BB700. استخدم CD8 R718 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 60٪ R718.
- تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي ؛ جمع ما مجموعه 25000 الخلايا الليمفاوية.
6. الاتساق بين النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها على اثنين من أجهزة القياس الخلوي
- تقييم الاختلافات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية بين الأدوات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (p < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 ورقة عمل عالمية لقالب القيمة المستهدفة للخرز اللامع CST. باستخدام مخطط FSC / SSC ، يتم رسم بوابة مضلعة لتحديد حبات CST الساطعة. تم الحصول على مخططات الرسم البياني ل 10 قنوات مضان للخرز اللامع CST: FITC و PE و BB700 و PE-Cy7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605. يتم عرض القيمة المستهدفة لكل معلمة من خلال إظهار الوسيط داخل بوابات الرسم البياني في الجدول 2. يتم عرض لقطات الشاشة للقوالب وإعدادات المعلمات في برنامج مقياس الخلايا A ومقياس الخلايا B في الشكل التكميلي S1.
يوضح الشكل 2 المخططات النقطية لعينة واحدة بين الأداتين بعد توحيد الجهاز. توضح البيانات الاتساق بين الأدوات المختلفة باستخدام قالب التحليل التلقائي. تمت مقارنة النتائج من ست عينات عبر نموذجين مختلفين للأجهزة في الجدول 3. لم يتم قياس فروق ذات دلالة إحصائية في النسب المئوية ل 15 مجموعة فرعية لمفاوية في المختبرين. تظهر هذه النتائج أنه تم الحصول على بيانات قابلة للمقارنة بدرجة عالية باتباع الطريقة الموحدة. النسب المئوية ل 15 مجموعة فرعية لمفاوية من أدوات مختلفة موضحة في الجدول التكميلي S1.
الشكل 1: قالب ورقة عمل عالمي للخرز اللامع CST. يتم بوابات الخرز الساطع CST في مؤامرة FSC مقابل SSC. يتم تقديم مخططات الرسم البياني ل 10 قنوات مضان للخرز اللامع CST. يتم إنشاء بوابات الفاصل الزمني لتشمل مجموعة الخرزات الساطعة لخرز CST لكل كاشف مضان. الاختصارات: FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة التشتت الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة بين المخططات النقطية من عينة واحدة بين الأداتين. (أ) يستخدم مخطط CD45 / SSC-A النقطي لبوابة الخلايا الليمفاوية. (ب) يستخدم المخطط النقطي CD3 / CD19 لبوابة خلايا CD3 + T وخلايا CD19 + B. (ج) يستخدم المخطط النقطي CD4 / CD8 لتحديد خلايا CD3 + CD8 + T و CD3 + CD4 + T. (د) يتم استخدام مخطط النقطة CD25 / CD127 لبوابة خلايا Treg (CD4 + CD25 + + CD127 منخفضة). (ه) يتم استخدام المخطط النقطي CD45RA / CD27 لخلايا CD4 + T للبوابة الساذجة (CD27 + CD45RA+) و TCM (CD27 + CD45RA-) و TEM (CD27- CD45RA) و TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) يتم استخدام المخطط النقطي CD45RA / CD27 لخلايا CD8 + T للبوابة الساذجة (CD27 + CD45RA+) و TCM (CD27 + CD45RA-) و TEM (CD27- CD45RA) و TEMRA (CD27-CD45RA+). (ز) يتم استخدام مخطط نقطة CD27 / IgD لبوابة الخلايا البائية الساذجة (CD27- IgD +) وخلايا الذاكرة B (CD27 + IgD-). استراتيجية البوابات من Zhang et al.7. الاختصارات: SSC-A = منطقة التشتت الجانبي ؛ TCM = خلايا الذاكرة المركزية T ؛ TEM = خلايا T للذاكرة المستجيبة ؛ TEMRA = الخلايا التائية للذاكرة التفاضلية التفاضلية النهائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| هدف الأجسام المضادة | فلوروكروم | استنساخ | رقم الكتالوج | الحجم لكل اختبار (ميكرولتر) |
| سي دي 4 | فيتك | سك3 | 566320 | 5 |
| سي دي 25 | بى | م-A251 | 555432 | 20 |
| سي دي 19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | بي سي واي 7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | ايه بي سي | هاي 100 | 550855 | 20 |
| سي دي 8 | آر 718 | جي 42-8 | 751953 | 5 |
| سي دي 3 | APC-H7 | إس كي 7 | 560176 | 5 |
| سي دي 127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| سي دي 45 | في 500 | هاي 30 | 560777 | 5 |
| سي دي 27 | BV605 | إل128 | 562656 | 5 |
الجدول 1: أحجام الأجسام المضادة ومعلومات الفلوروفور المترافق لتحليلات التدفق الخلوي. الاختصارات: BV = البنفسجي اللامع. BB = أزرق لامع ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين. APC = الوفيكوسيانين.
| MFI من الخرز مشرق | |||
| قناة | مقياس الخلايا أ | مقياس الخلايا ب | ٪الفرق في مؤسسات التمويل الأصغر |
| إف إس سي | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| إس إس سي | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| فيتك | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| بى | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| بي سي واي 7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| ايه بي سي | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| آر 718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| في 500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
الجدول 2: مؤسسة التمويل الأصغر للخرز اللامع قبل وبعد النقل. الاختصارات: MFI = متوسط شدة التألق ؛ BV = البنفسج اللامع ؛ BB = أزرق لامع ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PE = فيكوريثرين. APC = الوفيكوسيانين.
| متوسط النسب المئوية | متوسط النسب المئوية | ||
| مقياس الخلايا A (ن = 6) | مقياس الخلايا ب (ن = 6) | قيمة P | |
| الخلايا التائية | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| خلايا CD4 + T | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4 + تيسم | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4 + ساذج | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4 + تيإي إم | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4 + تيEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| تريج | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| خلايا CD8+ T | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8 + تيسم | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8 + ساذج | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8 + تيإي إم | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ تيإيمرا | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| الخلايا البائية | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| ساذج ب | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| الذاكرة ب | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
الجدول 3: تقييم الاختلافات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية بين الأدوات. P > 0.05 يشير إلى عدم وجود فرق كبير. الاختصارات: TCM = خلايا الذاكرة المركزية T ؛ TEM = خلايا T للذاكرة المستجيبة ؛ TEMRA = الخلايا التائية للذاكرة المستجيبة المتمايزة نهائيا.
الجدول التكميلي S1: النسب المئوية للمجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية في ست عينات من أدوات مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S1: لقطات الشاشة للقوالب وإعدادات المعلمات في برنامج مقياس الخلايا A ومقياس الخلايا B. (أ) ملف XML للقوالب. (ب) لقطات شاشة القوالب. (ج) إعدادات المعلمات في المقياس الخلوي A. (د) إعدادات المعلمات في مقياس الخلايا B. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يساعد التنميط المناعي للمجموعات الفرعية من الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم لدى الأطفال. في التطبيقات السريرية ، تحدث حالات غير متوقعة ، مثل الفشل في اكتشاف العينات في الوقت المناسب أو استبدال مقياس التدفق الخلوي ؛ لذلك ، هناك حاجة إلى طرق موحدة سريعة تسهل عمليات النقل بين أجهزة قياس التدفق الخلوي في المختبرات المختلفة9،10،11. هنا ، نصف طريقة موحدة سريعة لضمان نتائج متسقة بين الأدوات المختلفة. تم استخدام الطريقة الموحدة لمراقبة الخلايا المناعية في الدم المحيطي للأطفال بعد التطعيم ، وتم الحصول على نتائج متسقة في مختبرين. تم إنشاء الطريقة الموحدة بين BD Canto و LSRFortessa. البروتوكول مناسب أيضا ل FACSCelesta و FACSymphony A5 و FACSAria II. بالمقارنة مع طرق التقييس الأخرى 2,3 ، لا تتطلب هذه الطريقة القياسية استخدام برامج تابعة لجهات خارجية للحصول على اتساق البيانات. يستخدم فقط خصائص برنامج Diva لإنشاء وحدة قالب تحتوي على موضع القيمة المستهدفة والتحليل التلقائي لتحقيق طريقة النقل بين الأدوات المختلفة ، ويقلل من متطلبات تحليل البيانات. توفر هذه الطريقة الوقت ، وهي سهلة التشغيل ، ولا تتطلب تطوير أداة بوابات آلية.
يتم تحقيق توحيد بروتوكول قياس التدفق الخلوي في هذه الدراسة من خلال إنشاء قالب تجريبي على أداة واحدة يتضمن إعدادات قياس الخلايا وتحليل البيانات التلقائي وورقة عمل موضع الهدف. بعد ذلك ، تستخدم الأدوات الأخرى حبات CST لضبط جهد المعلمة للوصول إلى القيمة المستهدفة. وينبغي النظر في العديد من السمات الهامة لاستكمال التقييس الناجح عبر مختلف أجهزة قياس التدفق الخلوي. أولا ، تتطلب الطريقة الموحدة أن تستخدم الأدوات نفس نظام البرنامج ، بحيث يمكن مشاركة ملف XML لقالب التجربة بين برنامج الأدوات. ثانيا ، يجب أن يكون للأداتين نفس الاسم للتكوين ، ويجب أيضا تسمية المعلمات بشكل متطابق. ثالثا ، يجب جمع حبات CST في ظل ظروف الجهد المحددة دون تعويض كقيم مستهدفة. نظرا لقوى الليزر المختلفة وحساسيات PMT للأدوات المختلفة ، من الضروري استخدام حبات CST من نفس رقم الدفعة لضبط معلمات الجهد ، وفقا للقيم المستهدفة على الأدوات الأخرى ، والتأكد من أن قيمة MFI في حدود ±5٪. رابعا ، التقييمات اليومية لمراقبة جودة الأدوات مهمة جدا أيضا. إذا فشلت إحدى الأدوات في التقييم ، فيجب تنظيف خلية التدفق بحثا عن الفقاعات أو تعريضها لمعايرة الليزر. أخيرا ، لتقليل الاختلافات الناتجة عن إجراءات التحضير ، يجب تحضير العينات بطريقة متطابقة عند إجراء مثل هذه الدراسات الكبيرة متعددة المراكز ، بالإضافة إلى نقل الإعدادات لتكون قادرة على تحليل العينات في مختبرات مختلفة. ومع ذلك ، لا يزال هناك مجال لتحسين اللوحة لتحديد خلايا الذاكرة B بشكل أفضل في هذا البروتوكول. تواتر خلايا الذاكرة البائية منخفض نسبيا في الأطفال بعمر عامين ، وتعبير CD27 على سطح هذه الخلايا منتشر. قد يحدد هذا خلايا الذاكرة البائية بشكل أفضل إذا تم استبدال العلامة بفلوريسئين أكثر إشراقا من BV605.
ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى بعض القيود. أولا ، تم استخدام اثنين من مقاييس التدفق الخلوي للتوحيد القياسي في هذه التجربة. يجب تضمين نماذج أدوات إضافية في التجارب اللاحقة. ثانيا ، تم استخدام طريقة تلطيخ سطح الخلية لتمييز وتحديد المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية ولم تتضمن الكشف عن المزيد من السيتوكينات داخل الخلايا. ثالثا ، لم نقارن النتائج التجريبية مع وبدون عملية التوحيد القياسي لمقياسين خلويين للتدفق.
تتمثل ميزة هذه الطريقة الموحدة في أن الأدوات المختلفة يمكنها مشاركة ملف XML لقالب التجربة إذا كان البرنامج هو نفسه. يحتوي القالب التجريبي على قالب قيم الهدف الثابت ، ولا يمكن الحصول على البيانات إلا بعد ضبط جهد PMT على القيم المستهدفة بين الأجهزة. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي القالب التجريبي أيضا على تحليل تلقائي لاستراتيجية البوابة. بمجرد الحصول على البيانات ، يتم إنشاء تقرير التحليل التلقائي. هذا الإجراء سهل التشغيل ويقلل من الاختلافات في النتائج الناتجة عن التحليل اليدوي. يمكن استخدام هذه الطريقة الموحدة لتقييم التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية في الدم الكامل للأطفال الذين تم تطعيمهم باستخدام أدوات مختلفة عبر المختبرات ، وتحقيق الهدف المتمثل في ضمان تنفيذ مشروع الدراسة باستمرار عبر مراكز متعددة. في هذه الدراسة ، نهدف إلى اختبار قابلية تحويل الطريقة الموحدة عن طريق تلطيخ السطح ، وسيضع نجاحها أساسا لممارسة التلوين داخل الخلايا لاحقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم RW من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية ، الصين (رقم 7222059) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82002130) ، وتم دعم XZ من قبل صندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (رقم 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
