Summary
I denne undersøgelse blev der udviklet en metode til at lette overførslen af eksperimentelle indstillinger og analyseskabeloner mellem to flowcytometre i to laboratorier til påvisning af lymfocytter hos japanske encefalitisvaccinerede børn. Standardiseringsmetoden til flowcytometereksperimenterne gør det muligt at gennemføre forskningsprojekter effektivt i flere centre.
Abstract
Et stigende antal laboratorier har brug for at indsamle data fra flere flowcytometre, især til forskningsprojekter udført på tværs af flere centre. Udfordringerne ved at bruge to flowcytometre i forskellige laboratorier inkluderer manglen på standardiserede materialer, softwarekompatibilitetsproblemer, uoverensstemmelser i instrumentopsætning og brugen af forskellige konfigurationer til forskellige flowcytometre. For at etablere et standardiseret flowcytometrieksperiment for at opnå konsistens og sammenlignelighed af eksperimentelle resultater på tværs af flere centre blev der etableret en hurtig og gennemførlig standardiseringsmetode til overførsel af parametre på tværs af forskellige flowcytometre.
Metoderne udviklet i denne undersøgelse tillod overførsel af eksperimentelle indstillinger og analyseskabeloner mellem to flowcytometre i forskellige laboratorier til påvisning af lymfocytter hos japanske encefalitis (JE) -vaccinerede børn. En konsistent fluorescensintensitet blev opnået mellem de to cytometre ved anvendelse af fluorescensstandardperler til at etablere cytometerindstillingerne. Sammenlignelige resultater blev opnået i to laboratorier med forskellige typer instrumenter. Ved hjælp af denne metode kan vi standardisere analyse til evaluering af immunfunktionen hos JE-vaccinerede børn i forskellige laboratorier med forskellige instrumenter, mindske forskellene i data og resultater blandt flowcytometre i flere centre og give en gennemførlig tilgang til gensidig akkreditering af laboratorieresultater. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil sikre effektiv udførelse af forskningsprojekter på tværs af flere centre.
Introduction
Standardiseringen af flowcytometri er nyttig til sammenlignelighed af resultater opnået fra forskellige cytometre på tværs af forskellige laboratorier og studiecentre og bidrager til gensidig anerkendelse af resultater for at forbedre arbejdseffektiviteten. Et stigende antal scenarier kræver standardisering. Under lægemiddeludviklingsprocessen er flowcytometristandardisering vigtig, da et udviklet og valideret assay vil understøtte hele lægemiddeludviklingsprocessen fra præklinisk til klinisk analyse. Flowcytometriske metoder overføres ofte mellem medicinalindustrien og samarbejdende laboratorier1. Desuden er det vigtigt at indhente sammenlignelige data fra multicentriske kliniske undersøgelser. For eksempel blev der udviklet en standardiseringsarbejdsgang i det systemiske autoimmune sygdomme Multicenter Clinical Research Project for at opnå sammenlignelige data fra multicentrisk flowcytometri2.
Standardiseringen af flowcytometrimetoder er udfordrende. De udfordringer, der opleves på tværs af laboratorier, tilskrives manglen på standardiserede materialer, softwarekompatibilitetsproblemer, uoverensstemmelser i instrumentopsætning og brugen af forskellige konfigurationer blandt forskellige flowcytometre og divergerende gatingstrategier mellem centrene 3,4. Derfor er det vigtigt at foretage en gap-analyse mellem laboratorier. Adgang til prøver, kvalitetssystemer, personalekvalifikationer og instrumentkonfiguration skal gennemgås for at sikre, at kravene er opfyldt.
På nuværende tidspunkt har børn, der er vaccineret med den japanske encefalitis (JE) vaccine, en signifikant reduceret forekomst af JE5. Overvågning af perifere blodimmunceller kan hjælpe med at forstå ændringerne i cellemedieret adaptiv immunitet efter vaccination og sammenhængen mellem ændringerne i perifere blodlymfocytundergrupper og virkningerne af vaccination. På grund af den begrænsede stabilitet af fuldblodsprøver udføres evalueringer af vaccineeffektivitet ofte i flere centre. Til denne analyse definerede vi naive CD8+- eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RA+, T-celler med central hukommelse (TCM) som CD27+ CD45RA-, effektorhukommelses-T-celler (TEM) som CD27- CD45RA- og terminalt differentierede effektorhukommelses-T-celler (TEMRA) som CD27- CD45RA+. CD19+ B-celler kan opdeles i populationer, der udtrykker CD27 versus IgD 6,7, naive B-celler udtrykker CD27n-hukommelse B-celler (mBC'er) kan identificeres baseret på ekspressionen af IgD 6, og regulatoriske T-celler (Tregs) kan identificeres som CD4+CD25++CD127lav 8. For at etablere et standardiseret flowcytometrieksperiment for at opnå konsistens og sammenlignelighed af eksperimentelle resultater i flere centre blev der etableret en hurtig og gennemførlig standardiseringsmetode for at lette overførslen af protokoller på tværs af forskellige flowcytometre til påvisning af lymfocytter i fuldblod hos JE-vaccinerede børn. Seks raske børn (2 år) blev rekrutteret fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Efter at have modtaget en prime og boost vaccination med en levende svækket JE SA14-14-2 vaccine mindre end 6 måneder før, blev perifere blodprøver indsamlet fra de frivillige. Meget sammenlignelige data blev opnået fra forskellige instrumenter efter standardiserede procedurer, hvilket er nyttigt for multicentervurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: 2020-k-85). Informeret samtykke fra forsøgspersoner blev frafaldet, da kun restprøver efter klinisk test blev anvendt i denne undersøgelse. To laboratorier er involveret i denne undersøgelse. Det overførende laboratorium er, hvor den standardiserede metode blev udviklet ved hjælp af et flowcytometer. Cytometeret i dette laboratorium kaldes i det følgende cytometer A. Testmetodelaboratoriet er det laboratorium, der modtager metoder ved hjælp af et andet flowcytometer, og cytometeret i dette laboratorium kaldes i det følgende cytometer B.
1. Indsamling af perifere blodprøver og celleforberedelse
- Udtag perifere blodprøver (2 ml) fra JE-vaccinerede børn og uvaccinerede børn i EDTA-K 2-antikoagulerede rør ved standard venepunktur.
- Bland hele blodprøven ved at vende rørene på hovedet 10x. Tilsæt 100 μL fuldblod til et 12 mm x 75 mm rør. Lav hver prøve i to eksemplarer.
- Tilsæt 10 μL strålende pletbuffer (BV-buffer) til et 12 mm x 75 mm rør. Der tilsættes 5 μL af hvert antistof (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; fortyndingsfaktor: 1:20) og 20 μL antistof (CD25, CD45RA; fortyndingsfaktor: 1:5) til BV-bufferen. Hvirvel forsigtigt.
BEMÆRK: Mængderne og oplysningerne om antistoffereagenserne er vist i tabel 1. - Tilsæt antistofcocktailen i røret med hele blodprøven. Vortex forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter i mørket.
- 10x lyseringsopløsningen fortyndes 1:10 med destilleret vand for at fremstille 1x lyseringsopløsning. Lyser blodprøverne ved at tilsætte 2 ml 1x lyseringsopløsning. Vortex forsigtigt og inkuber i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Supernatanten centrifugeres ved 300 × g i 5 min. og dekanteres.
- Pellet resuspenderes i 2 ml 1x PBS, centrifugeres ved 300 × g i 5 min, og supernatanten dekanteres.
- Resuspender pellet i 0,5 ml 1x PBS og bland grundigt. Opbevares ved 2 °C til 8 °C. Send prøverne til de to laboratorier til flowcytometrisk analyse.
BEMÆRK: Den negative kontrolprøve og celle enkeltfarvet kontrol skal behandles samtidigt.
2. Forberedelse af kompensationsperler og enkeltfarvet kontrol
- Etiket V500-anti-CD45 enkeltfarvet, APC-H7-anti-CD3 enkeltfarvet, FITC-anti-CD4 enkeltfarvet, R718-anti-CD8 enkeltfarvet, BV605-anti-CD27 enkeltfarvet, APC-anti-CD45RA enkeltfarvet, PE-anti-CD25 enkeltfarvet, BV421-anti-CD127 enkeltfarvet, BB700-anti-CD19 enkeltbejdset og PE-CY7-anti-IgD enkeltfarvede rør.
- Tilsæt 100 μL 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) indeholdende 1% føtalt bovint serum (FBS) til et 5 ml rundbundet polystyrenreagensglas.
- Der tilsættes 50 μL af de negative perler og 50 μL af antimuse-Ig, κ-perlerne til hvert rør og hvirvel.
- Tilsæt 2 μL af hvert mærket antistof (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) til et enkeltfarvet rør. Vortex blandingen forsigtigt og inkuber i 15 min i mørke ved stuetemperatur (20 °C til 25 °C).
- Perlerne resuspenderes i 2 ml 1x PBS, centrifugeres ved 300 × g i 5 min, og supernatanten dekanteres.
- Resuspender perlerne i 0,5 ml 1x PBS og bland grundigt. Opbevares ved 2 °C til 8 °C.
3. Brug af identiske konfigurationsnavne på de forskellige cytometre i to laboratorier
- Opret en ny konfiguration i softwaren til cytometer A. Klik på knappen Cytometer , og vælg vis konfigurationer for at få vist konfigurationsvinduet.
- Højreklik på mappen med basiskonfigurationer på konfigurationslisten, vælg Ny mappe, og omdøb den.
- Højreklik på basiskonfigurationen , og vælg kopiér.
- Højreklik på den nye mappe , og indsæt basiskonfigurationen for at oprette en ny konfiguration. Omdøb den nye konfiguration til "Standardiseret metodeoverførsel".
- Træk parameternavnet, f.eks. FITC, fra listen Parametre til den relevante detektor (530/30).
- Rediger yderligere parametre (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605) til den nye konfiguration.
- Følg denne metode for at oprette en ny konfiguration på en anden flowcytometermodel med samme navn "Standardiseret metodeoverførsel". Sørg for, at konfigurationen indeholder de samme parametre for hver detektor.
BEMÆRK: For at kunne identificere eksperimentskabelonen på de to forskellige flowcytometermodeller skal du sørge for, at navnet er konsistent. - Under cytometerkonfigurationerne skal du bruge cytometeropsætnings- og sporingsperler (CST) til at definere cytometerets baseline og spore cytometerets ydeevne. Klik på knappen Cytometer , og vælg CST for at få vist cytometeropsætningen og sporingsarbejdsområdet.
- Tilsæt tre dråber (150 μL) opsætningsperler til 0,5 ml 1x PBS i et 5 ml rundbundet polystyrenreagensglas. Placer perlerøret på cytometeret.
- I vinduet Opsætningskontrol skal du vælge Definer oprindelig plan og klikke på Kør.
4. Standardiseringseksperiment ved hjælp af cytometer A i det overførende laboratorium
- Kør en præstationskontrol ved hjælp af cytometeropsætningen og sporingsperlerne for at kontrollere, at cytometeret fungerer godt.
- Højreklik på cytometerindstillingerne i softwarebrowservinduet, og vælg Programindstillinger for at oprette et regneark.
- Brug en ufarvet prøve til at justere fotomultiplikatorrørets (PMT) spændinger for FSC, SSC og alle fluorescensparametre. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; og BV605: 505.
- Højreklik på eksperimentcytometerindstillingerne, og vælg applikationsindstillinger for at gemme det.
- Klik på eksperimentknappen , og vælg menuen Kompensationsopsætning . Vælg derefter Opret kompensationskontrolelementer for automatisk at tilføje kompensationskontrolelementer .
- Optag data for alle kompensationskontrolperler.
- Klik på eksperimentet , og vælg kompensationsopsætning. Beregn derefter kompensationen automatisk.
- Registrer data for enkeltfarvede kontrolelementer i celler.
- Brug CD45RA APC til at ændre kompensationsværdien for R718 til 15 % APC. Brug CD19 BB700 til at ændre kompensationsværdien for APC-H7 til 14 % BB700. Brug CD8 R718 til at ændre kompensationsværdien for APC-H7 til 60 % R718.
- Optag data for CST-perlerne.
- Opret et globalt regneark med målværdiskabelonen for CST's lyse perler.
- Brug et FSC/SSC-plot til at tegne polygonporten til CST's lyse perler. Få histogramdiagrammer med 10 fluorescenskanaler til CST-lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Opret intervalporte i histogramplottene. Opret statistikvisningen ved at vise medianen af intervalportene.
- Kør prøverne på flowcytometeret; indsamle i alt 25.000 lymfocytter.
- Opret et globalt regneark med analyseskabelonen til prøverne.
- Brug følgende eksempel på gating-strategi:
- Brug et CD45/side scatter-area (SSC-A) dot plot til at tegne polygonporten for at identificere den intakte lymfocytpopulation, mens du udelukker affald.
- Brug et CD3/CD19-punktdiagram til at tegne en rektangulær port for at vælge CD3+ T-celler og CD19+ B-celler.
- Brug et CD4/CD8-punktplot til at tegne en quad-port for at vælge CD4+ - eller CD8+ T-celler (celler med henholdsvis høj fluorescens for disse markører).
- Brug et CD45RA/CD27-punktplot til at tegne en quad-port for at underopdele CD8+- eller CD4+ T-celler i naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) og TEMRA (CD27-CD45RA+) celler.
- Brug et CD25/CD127-punktplot til at tegne en quad-port for at opdele CD4+ T-celler i Treg-celler (CD4+CD25++CD127lav).
- Brug et CD27/IgD-punktplot til at tegne en quad-port for at opdele CD19+ B-celler i naive B-celler (CD27-IgD+) og hukommelses-B-celler (CD27+IgD-).
- Gem den eksperimentelle skabelon på cytometer A.
- Brug cd-rom'en til at eksportere eksperimentskabelonen.
5. Overførsel af den eksperimentelle skabelon til cytometer B i testmetodelaboratoriet
BEMÆRK: Den eksperimentelle skabelon indeholder instrumentindstillinger, analyseskabelonen og målværdiskabelonen for median fluorescensintensitet (MFI).
- Udfør en præstationskontrol ved hjælp af CST-perler for at kontrollere, at cytometeret fungerer godt.
- Importér den eksperimentelle skabelon, og opret et eksperiment for cytometer B ved hjælp af skabelonen.
- Brug det samme parti CST-perler til at justere de fluorescerende parameterspændinger for hver fluorescenskanal, så de passer til det forrige MFI-instrument.
BEMÆRK: MFI-værdierne varierer inden for ±5% (MFI'en for lyse perler før og efter overførsel er vist i tabel 2). - Juster spændingen for FSC ved hjælp af den ubejdsede prøve, hvis det er nødvendigt.
- Højreklik på de eksperimentelle cytometerindstillinger , og vælg applikationsindstillinger for at gemme applikationsindstillingerne.
- Brug CD45RA APC til at ændre kompensationsværdien for R718 til 15 % APC. Brug CD19 BB700 til at ændre kompensationsværdien for APC-H7 til 24 % BB700. Brug CD8 R718 til at ændre kompensationsværdien for APC-H7 til 60 % R718.
- Kør prøverne på flowcytometeret; indsamle i alt 25.000 lymfocytter.
6. Overensstemmelse mellem de eksperimentelle resultater opnået på de to cytometre
- Vurder forskellene i lymfocytundergrupper mellem instrumenter ved hjælp af envejs ANOVA (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et globalt regneark med målværdiskabelonen for CST's lyse perler. Ved hjælp af et FSC / SSC-plot tegnes en polygonport for at vælge CST-lyse perler. Histogramplots af 10 fluorescenskanaler blev opnået for CST lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Målværdien for hver parameter vises ved at vise medianen inden for histogramportene i tabel 2. Skærmbillederne af skabeloner og parameterindstillinger i softwaren til cytometer A og cytometer B er vist i supplerende figur S1.
Figur 2 viser prikplottene for en prøve mellem de to instrumenter efter instrumentstandardisering. Dataene viser konsistens mellem forskellige instrumenter ved hjælp af en automatisk analyseskabelon. Resultaterne fra seks stikprøver blev sammenlignet på tværs af to forskellige instrumentmodeller i tabel 3. Der blev ikke målt signifikante forskelle i procentdelen af 15 lymfoide undergrupper i de to laboratorier. Disse resultater viser, at meget sammenlignelige data blev opnået efter den standardiserede metode. Procentdelene af 15 lymfoide undergrupper fra forskellige instrumenter er vist i supplerende tabel S1.
Figur 1: Global regnearksskabelon til CST's lyse perler. CST lyse perler er lukket i FSC versus SSC plottet. Histogramplots af 10 fluorescenskanaler præsenteres for CST lyse perler. Intervalporte oprettes for at inkludere den lyse perlepopulation af CST-perler for hver fluorescensdetektor. Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningsområde; SSC-A = sidespredningsområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenligning af punktdiagrammer fra en stikprøve mellem de to instrumenter. (A) CD45/SSC-A dot plot bruges til gate lymfocytter. (B) CD3/CD19-punktplot bruges til at gate CD3+ T-celler og CD19+ B-celler. (C) CD4/CD8-punktplot bruges til at identificere CD3+-, CD8+-T- og CD3+ CD4+T-celler. (D) CD25/CD127-punktplot bruges til at gate-Treg-celler (CD4+CD25++CD127lav). (E) CD45RA/CD27-punktplot for CD4+ T-celler bruges til at gate-naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) og TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) CD45RA/CD27-punktplot for CD8+ T-celler bruges til at gate-naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) og TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) CD27/IgD-punktplot bruges til at gatere naive B-celler (CD27-IgD+) og hukommelses-B-celler (CD27+ IgD-). Gating strategien er fra Zhang et al.7. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; TCM = T-celler med central hukommelse; TEM = effektorhukommelse T-celler; TEMRA = terminalt differentiel effektorhukommelse T-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof mål | Fluorochrom | Klon | Katalog nr | Volumen pr. prøvning (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabel 1: Antistofvolumener og konjugerede fluoroforoplysninger til flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende violet; BB = strålende blå; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| MFI af lyse perler | |||
| Kanal | Cytometer A | Cytometer B | %Forskel i MFI |
| FSC | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabel 2: MFI af lyse perler før og efter overførsel. Forkortelser: MFI = gennemsnitlig fluorescensintensitet; BV = strålende violet; BB = strålende blå; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Gennemsnit af procenter | Gennemsnit af procenter | ||
| Cytometer A (n = 6) | Cytometer B (n = 6) | P-værdi | |
| T-celler | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T-celler | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naiv | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T-celler | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naiv | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ T EMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B-celler | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naivt B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Hukommelse B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabel 3: Vurdering af forskelle i lymfocytundergrupper mellem instrumenter. p > 0,05 angiver ingen signifikant forskel. Forkortelser: TCM = central hukommelse T-celler; TEM = effektorhukommelse T-celler; TEMRA = terminalt differentieret effektorhukommelse T-celler.
Supplerende tabel S1: Procentdel lymfocytundergrupper i seks prøver fra forskellige instrumenter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Skærmbillederne af skabeloner og parameterindstillinger i softwaren til cytometer A og cytometer B. (A) XML-filen med skabeloner. (B) Skærmbilleder af skabeloner. (C) Parameterindstillingerne i cytometer A. (D) Parameterindstillingerne i cytometer B. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofænotypning af perifere blodlymfocytundergrupper kan hjælpe med at forstå ændringerne i cellemedieret adaptiv immunitet efter vaccination hos børn. I kliniske applikationer opstår der uventede situationer, såsom manglende detektering af prøver rettidigt eller udskiftning af et flowcytometer; Derfor er der brug for hurtige standardiserede metoder, der letter overførsler mellem flowcytometre i forskellige laboratorier 9,10,11. Her beskriver vi en hurtig standardiseret metode til at sikre ensartede resultater mellem forskellige instrumenter. Den standardiserede metode blev brugt til at overvåge immunceller i børns perifere blod efter vaccination, og konsistente resultater blev opnået i to laboratorier. Den standardiserede metode blev etableret mellem BD Canto og LSRFortessa. Protokollen er også velegnet til FACSCelesta, FACSymphony A5 og FACSAria II. Sammenlignet med andre standardiseringsmetoder 2,3 kræver denne standardmetode ikke brug af tredjepartssoftware for at opnå konsistens af data. Det bruger kun egenskaberne ved Diva-software til at oprette et skabelonmodul, der indeholder målværdiposition og automatisk analyse for at realisere overførselsmetoden mellem forskellige instrumenter og reducerer kravet om dataanalyse. Metoden sparer tid, er nem at betjene og kræver ikke udvikling af et automatiseret gatingværktøj.
Standardisering af en flowcytometriprotokol i denne undersøgelse opnås ved at oprette en eksperimentel skabelon på et instrument, der inkluderer cytometriindstillinger, automatisk dataanalyse og målpositionsark. Derefter bruger de andre instrumenter CST-perler til at justere parameterspændingerne for at nå målværdien. Flere vigtige funktioner bør overvejes for at fuldføre vellykket standardisering på tværs af forskellige flowcytometerinstrumenter. For det første kræver den standardiserede metode, at instrumenterne bruger det samme softwaresystem, så eksperimentskabelonens XML-fil kan deles mellem instrumenternes software. For det andet skal de to instrumenter have samme navn for konfigurationen, og parametrene skal også navngives identisk. For det tredje skal CST-perlerne indsamles under de specificerede spændingsforhold uden kompensation som målværdier. I betragtning af de forskellige instrumenters forskellige laserkræfter og PMT-følsomheder er det nødvendigt at bruge CST-perler fra samme partinummer til at justere spændingsparametrene i henhold til målværdierne på andre instrumenter og sikre, at MFI-værdien ligger inden for ±5%. For det fjerde er daglige kvalitetskontrolvurderinger af instrumenter også meget vigtige. Hvis et instrument ikke består vurderingen, skal flowcellen rengøres for bobler eller underkastes laserkalibrering. Endelig, for at reducere forskelle forårsaget af forberedelsesprocedurer, skal prøverne forberedes på en identisk måde, når sådanne store multicenterundersøgelser udføres, ud over at overføre indstillinger for at kunne analysere prøverne i forskellige laboratorier. Der er dog stadig plads til paneloptimering for bedre identifikation af hukommelses B-celler i denne protokol. Frekvensen af hukommelses B-celler er relativt lav hos 2-årige børn, og CD27-ekspression på overfladen af disse celler er diffus. Dette kan bedre identificere hukommelses B-celler, hvis markøren erstattes med et lysere fluorescein end BV605.
Der skal dog bemærkes nogle begrænsninger. For det første blev to flowcytometre anvendt til standardisering i dette eksperiment; Yderligere instrumentmodeller bør indgå i efterfølgende forsøg. For det andet blev celleoverfladefarvningsmetoden brugt til at skelne og bestemme lymfocytundergrupper og involverede ikke påvisning af flere intracellulære cytokiner. For det tredje sammenlignede vi ikke de eksperimentelle resultater med og uden standardiseringsprocessen for to flowcytometre.
Fordelen ved denne standardiserede metode er, at forskellige instrumenter kan dele eksperimentskabelonens XML-fil, hvis softwaren er den samme. Den eksperimentelle skabelon indeholder skabelonen for faste målværdier, og data kan kun opnås efter justering af PMT-spændinger til målværdierne mellem instrumenter. Derudover indeholder den eksperimentelle skabelon også automatisk gatestrategianalyse. Når dataene er opnået, genereres den automatiske analyserapport. Denne procedure er nem at betjene og reducerer forskellene i resultater forårsaget af manuel analyse. Denne standardiserede metode kan bruges til at vurdere ændringer i lymfocytundergrupper i fuldblod hos JE-vaccinerede børn ved hjælp af forskellige instrumenter på tværs af laboratorier og nå målet om at sikre, at undersøgelsesprojektet udføres konsekvent på tværs af flere centre. I denne undersøgelse sigter vi mod at teste konvertibiliteten af den standardiserede metode ved overfladefarvning, og dens succes vil lægge et fundament for praksis med senere intracellulær farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
RW blev støttet af Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ blev støttet af CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
