Summary
In deze studie werd een methode ontwikkeld om de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen tussen twee flowcytometers in twee laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. De standaardisatiemethode voor de flowcytometerexperimenten zal het mogelijk maken om onderzoeksprojecten effectief uit te voeren in meerdere centra.
Abstract
Een toenemend aantal laboratoria moet gegevens verzamelen van meerdere flowcytometers, vooral voor onderzoeksprojecten die in meerdere centra worden uitgevoerd. De uitdagingen van het gebruik van twee flowcytometers in verschillende laboratoria omvatten het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentinstellingen en het gebruik van verschillende configuraties voor verschillende flowcytometers. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten over meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om parameters over verschillende flowcytometers over te dragen.
De methoden die in deze studie werden ontwikkeld, maakten de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen mogelijk tussen twee flowcytometers in verschillende laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis (JE) -gevaccineerde kinderen. Een consistente fluorescentie-intensiteit werd verkregen tussen de twee cytometers met behulp van fluorescentiestandaardparels om de cytometerinstellingen vast te stellen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in twee laboratoria met verschillende soorten instrumenten. Met behulp van deze methode kunnen we de analyse voor het evalueren van de immuunfunctie van JE-gevaccineerde kinderen in verschillende laboratoria met verschillende instrumenten standaardiseren, de verschillen in gegevens en resultaten tussen flowcytometers in meerdere centra verminderen en een haalbare aanpak bieden voor de wederzijdse accreditatie van laboratoriumresultaten. De standaardisatiemethode van flowcytometerexperimenten zal zorgen voor de effectieve uitvoering van onderzoeksprojecten in meerdere centra.
Introduction
De standaardisatie van flowcytometrie is nuttig voor de vergelijkbaarheid van resultaten verkregen van verschillende cytometers in verschillende laboratoria en studiecentra, en bevorderlijk voor de wederzijdse erkenning van resultaten om de werkefficiëntie te verbeteren. Steeds meer scenario's vragen om standaardisatie. Tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen is standaardisatie van flowcytometrie belangrijk, omdat een ontwikkelde en gevalideerde test het hele ontwikkelingsproces van geneesmiddelen van preklinische tot klinische analyse zal ondersteunen. Flowcytometrische methoden worden vaak overgedragen tussen de farmaceutische industrie en samenwerkende laboratoria1. Bovendien is het essentieel om vergelijkbare gegevens te verkrijgen uit multicentrische klinische studies. In het Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project is bijvoorbeeld een standaardisatieworkflow ontwikkeld om vergelijkbare gegevens uit multicentrische flowcytometrie2 te verkrijgen.
De standaardisatie van flowcytometriemethoden is een uitdaging. De uitdagingen die in laboratoria worden ervaren, worden toegeschreven aan het gebrek aan gestandaardiseerde materialen, softwarecompatibiliteitsproblemen, inconsistenties in instrumentconfiguratie en het gebruik van verschillende configuraties tussen verschillende flowcytometers en divergente gatingstrategieën tussen de centra 3,4. Daarom is het belangrijk om een gap-analyse tussen laboratoria uit te voeren. Monstertoegang, kwaliteitssystemen, personeelskwalificaties en instrumentconfiguratie moeten worden herzien om ervoor te zorgen dat aan de vereisten wordt voldaan.
Op dit moment hebben kinderen die zijn gevaccineerd met het Japanse encefalitis (JE) -vaccin een significant verminderde incidentie van JE5. Het monitoren van perifere bloedimmuuncellen kan helpen bij het begrijpen van de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie, en de correlatie tussen de veranderingen in perifere bloedlymfocytensubsets en de effecten van vaccinatie. Vanwege de beperkte stabiliteit van volbloedmonsters worden evaluaties van de werkzaamheid van het vaccin vaak in meerdere centra uitgevoerd. Voor deze analyse definieerden we naïeve CD8+ of CD4+ T-cellen als CD27+ CD45RA+, centrale geheugen T-cellen (T CM) als CD27+ CD45RA-, effectorgeheugen T-cellen (TEM) als CD27- CD45RA-, en terminaal gedifferentieerde effectorgeheugen T-cellen (T EMRA) als CD27- CD45RA+. CD19+ B-cellen kunnen worden onderverdeeld in populaties die CD27 versus IgD 6,7 tot expressie brengen, naïeve B-cellen drukken CD27n-geheugen tot expressie B-cellen (mBC's) kunnen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van IgD6, en regulerende T-cellen (Tregs) kunnen worden geïdentificeerd als CD4 + CD25 ++ CD127laag 8. Om een gestandaardiseerd flowcytometrie-experiment op te zetten om de consistentie en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten in meerdere centra te bereiken, werd een snelle en haalbare standaardisatiemethode vastgesteld om de overdracht van protocollen over verschillende flowcytometers voor de detectie van lymfocyten in het volbloed van JE-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. Zes gezonde kinderen (2 jaar oud) werden gerekruteerd uit het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Na het ontvangen van een prime en boost vaccinatie met een levend verzwakt JE SA14-14-2 vaccin minder dan 6 maanden eerder, werden perifere bloedmonsters verzameld van de vrijwilligers. Zeer vergelijkbare gegevens werden verkregen uit verschillende instrumenten volgens gestandaardiseerde procedures, wat nuttig is voor multicenter-beoordelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: 2020-k-85). Van geïnformeerde toestemming van menselijke proefpersonen werd afgezien omdat in deze studie alleen restmonsters na klinische tests werden gebruikt. Bij dit onderzoek zijn twee labo's betrokken. Het overdrachtslaboratorium is waar de gestandaardiseerde methode werd ontwikkeld met behulp van één flowcytometer. De cytometer in dit lab wordt hierna cytometer A genoemd. Het testmethodelaboratorium is het laboratorium dat methoden ontvangt met behulp van een andere flowcytometer en de cytometer in dit laboratorium wordt hierna cytometer B genoemd.
1. Perifere bloedmonsterverzameling en celvoorbereiding
- Verzamel perifere bloedmonsters (2 ml) van JE-gevaccineerde kinderen en niet-gevaccineerde kinderen in EDTA-K 2-antistollingsbuizen door standaard venapunctie.
- Meng het volbloedmonster door de buisjes 10x ondersteboven te draaien. Voeg 100 μL volbloed toe aan een buis van 12 mm x 75 mm. Maak elk monster in tweevoud.
- Voeg 10 μL briljante vlekbuffer (BV-buffer) toe aan een buis van 12 mm x 75 mm. Voeg 5 μL van elk antilichaam (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; verdunningsfactor: 1:20) en 20 μL antilichaam (CD25, CD45RA; verdunningsfactor: 1:5) toe aan de BV-buffer. Vortex zachtjes.
OPMERKING: De volumes en informatie van de antilichaamreagentia zijn weergegeven in tabel 1. - Voeg de antilichaamcocktail toe aan de buis met het volbloedmonster. Vortex zachtjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker.
- Verdun de 10x lyseeroplossing 1:10 met gedestilleerd water om 1x lyseeroplossing te bereiden. Lyseer de bloedmonsters door 2 ml 1x lyserende oplossing toe te voegen. Vortex zachtjes en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g en decanteer het supernatant.
- Resuspensie van de pellet in 2 ml 1x PBS, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g en decanteer het supernatant.
- Resuspensie van de pellet in 0,5 ml 1x PBS en meng grondig. Bewaren bij 2 °C tot 8 °C. Stuur de monsters naar de twee laboratoria voor flowcytometrische analyse.
OPMERKING: Het negatieve controlemonster en het enkelgekleurde controleorgaan moeten gelijktijdig worden verwerkt.
2. Voorbereiden van compensatiekralen en enkelvlekbediening
- Label V500-anti-CD45 single-stained, APC-H7-anti-CD3 single-stained, FITC-anti-CD4 single-stained, R718-anti-CD8 single-stained, BV605-anti-CD27 single-stained, APC-anti-CD45RA single-stained, PE-anti-CD25 single-stained, BV421-anti-CD127 single-stained, BB700-anti-CD19 single-stained, en PE-CY7-anti-IgD single-stained tubes.
- Voeg 100 μL 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) buffer met 1% foetaal runderserum (FBS) toe aan een 5 ml polystyreen reageerbuis met ronde bodem.
- Voeg 50 μL van de negatieve kralen en 50 μL van de anti-muis Ig, κ kralen toe aan elke buis en vortex.
- Voeg 2 μL van elk gelabeld antilichaam (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) toe aan een enkelgekleurde buis. Draai het mengsel voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur (20 °C tot 25 °C).
- Resuspendeer de kralen in 2 ml 1x PBS, centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer de kralen in 0,5 ml 1x PBS en meng grondig. Bewaren bij 2 °C tot 8 °C.
3. Het gebruik van identieke configuratienamen op de verschillende cytometers in twee laboratoria
- Maak een nieuwe configuratie aan in de software van cytometer A. Klik op de knop Cytometer en kies configuraties weergeven om het configuratievenster weer te geven.
- Klik in de configuratielijst met de rechtermuisknop op de map met basisconfiguraties, kies Nieuwe map en wijzig de naam ervan.
- Klik met de rechtermuisknop op de basisconfiguratie en kies Kopiëren.
- Klik met de rechtermuisknop op de nieuwe map en plak de basisconfiguratie om een nieuwe configuratie te maken. Wijzig de naam van de nieuwe configuratie "Standardized Method Transfer".
- Sleep de parameternaam, zoals FITC, van de lijst Parameters naar de juiste detector (530/30).
- Bewerk aanvullende parameters (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605) naar de nieuwe configuratie.
- Volg deze methode om een nieuwe configuratie te maken op een ander flowcytometermodel met dezelfde naam "Standardized Method Transfer". Zorg ervoor dat de configuratie voor elke detector dezelfde parameters bevat.
OPMERKING: Als u de experimentsjabloon op de twee verschillende flowcytometermodellen wilt identificeren, moet u ervoor zorgen dat de naam consistent is. - Gebruik onder de cytometerconfiguraties CST-kralen (Cytometer Setup and Tracking) om de basislijn van de cytometer te definiëren en de prestaties van de cytometer bij te houden. Klik op de knop Cytometer en kies CST om de werkruimte voor het instellen en bijhouden van de cytometer weer te geven.
- Voeg drie druppels (150 μL) set-setparels toe aan 0,5 ml 1x PBS in een 5 ml polystyreen reageerbuis met ronde bodem. Plaats de kralenbuis op de cytometer.
- Kies in het venster Setup Control de optie Baseline definiëren en klik op Uitvoeren.
4. Standaardisatie-experiment met cytometer A in het overdrachtslaboratorium
- Voer een prestatiecontrole uit met behulp van de cytometerinstelling en trackingparels om te controleren of de cytometer goed presteert.
- Klik in het browservenster van de software met de rechtermuisknop op de cytometerinstellingen en kies Toepassingsinstellingen om een werkblad te maken.
- Pas met behulp van een niet-gekleurd monster de pmt-spanningen (fotomultiplicatorbuis) van FSC, SSC en alle fluorescentieparameters aan. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; en BV605: 505.
- Klik met de rechtermuisknop op de cytometerinstellingen van het experiment en kies toepassingsinstellingen om deze op te slaan.
- Klik op de experimentknop en kies het instellingenmenu voor compensatie . Kies vervolgens Compensatiebesturingselementen maken om automatisch compensatiebesturingselementen toe te voegen.
- Registreer gegevens voor alle compensatiecontrolekralen.
- Klik op het experiment en kies compensatie-instelling. Bereken vervolgens automatisch de compensatie.
- Recordgegevens voor besturingselementen met één kleur in cellen.
- Gebruik CD45RA APC om de compensatiewaarde van R718 te wijzigen in 15% APC. Gebruik CD19 BB700 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 14% BB700. Gebruik CD8 R718 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 60% R718.
- Registreer gegevens voor de CST-kralen.
- Maak een globaal werkblad van de doelwaardesjabloon voor de heldere CST-kralen.
- Teken met behulp van een FSC/SSC-plot de polygoonpoort voor de CST-heldere kralen. Verkrijg histogramplots van 10 fluorescentiekanalen voor de CST heldere kralen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605. Maak intervalpoorten in de histogramplots. Maak de statistiekenweergave door de mediaan van de intervalpoorten weer te geven.
- Voer de monsters uit op de flowcytometer; Verzamel in totaal 25.000 lymfocyten.
- Maak een globaal werkblad van de analysesjabloon voor de voorbeelden.
- Gebruik de volgende voorbeeld gating strategie:
- Teken met behulp van een CD45/side scatter-area (SSC-A) dot plot de polygoonpoort om de intacte lymfocytenpopulatie te identificeren terwijl puin wordt uitgesloten.
- Teken met behulp van een CD3/CD19 dot plot een rechthoekige poort om CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te selecteren.
- Teken met behulp van een CD4/CD8 dot plot een quad gate om CD4+ of CD8+ T cellen te selecteren (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markers, respectievelijk).
- Teken met behulp van een CD45RA/CD27 dot plot een quad gate om CD8+ of CD4+ T cellen onder te verdelen in naïeve (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-), en TEMRA (CD27-CD45RA+) cellen.
- Teken met behulp van een CD25/CD127 dot plot een quad gate om CD4+ T-cellen onder te verdelen in Treg-cellen (CD4+CD25++CD127laag).
- Teken met behulp van een CD27/IgD dot plot een quad gate om CD19+ B cellen onder te verdelen in naïeve B cellen (CD27-IgD+) en geheugen B cellen (CD27+IgD-).
- Sla de experimentele sjabloon op cytometer A op.
- Gebruik de cd-rom om de experimentele sjabloon te exporteren.
5. Overbrengen van de experimentele sjabloon naar cytometer B in het laboratorium van de testmethode
OPMERKING: De experimentele sjabloon bevat instrumentinstellingen, de analysesjabloon en de doelwaardesjabloon van mediane fluorescentie-intensiteit (MFI).
- Voer een prestatiecontrole uit met behulp van CST-kralen om te controleren of de cytometer goed presteert.
- Importeer de experimentele sjabloon en maak een experiment voor cytometer B met behulp van de sjabloon.
- Gebruik dezelfde partij CST-kralen om de fluorescerende parameterspanningen voor elk fluorescentiekanaal aan te passen aan het vorige MFI-instrument.
OPMERKING: De MFI-waarden variëren binnen ±5% (de MFI van heldere kralen voor en na overdracht wordt weergegeven in tabel 2). - Pas de spanning voor FSC aan met behulp van het niet-gekleurde monster, indien nodig.
- Klik met de rechtermuisknop op de instellingen van de experimentele cytometer en kies toepassingsinstellingen om de toepassingsinstellingen op te slaan.
- Gebruik CD45RA APC om de compensatiewaarde van R718 te wijzigen in 15% APC. Gebruik CD19 BB700 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 24% BB700. Gebruik CD8 R718 om de compensatiewaarde van APC-H7 te wijzigen in 60% R718.
- Voer de monsters uit op de flowcytometer; Verzamel in totaal 25.000 lymfocyten.
6. Consistentie tussen de experimentele resultaten verkregen op de twee cytometers
- Beoordeel de verschillen in lymfocytensubsets tussen instrumenten met behulp van eenrichtings-ANOVA (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een globaal werkblad van de doelwaardesjabloon voor de CST heldere kralen. Met behulp van een FSC/SSC-plot wordt een polygoonpoort getekend om de CST-heldere kralen te selecteren. Histogramplots van 10 fluorescentiekanalen werden verkregen voor de CST heldere kralen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 en BV605. De doelwaarde voor elke parameter wordt weergegeven door de mediaan binnen de histogrampoorten in tabel 2 weer te geven. De screenshots van sjablonen en parameterinstellingen in de software van cytometer A en cytometer B worden weergegeven in aanvullende figuur S1.
Figuur 2 toont de dot plots van één monster tussen de twee instrumenten na instrumentstandaardisatie. De gegevens tonen consistentie tussen verschillende instrumenten met behulp van een automatische analysesjabloon. De resultaten van zes monsters werden vergeleken over twee verschillende instrumentmodellen in tabel 3. In de twee laboratoria werden geen significante verschillen in de percentages van 15 lymfoïde subgroepen gemeten. Deze resultaten tonen aan dat zeer vergelijkbare gegevens zijn verkregen volgens de gestandaardiseerde methode. De percentages van 15 lymfoïde subgroepen van verschillende instrumenten zijn weergegeven in aanvullende tabel S1.
Afbeelding 1: Globale werkbladsjabloon voor de CST heldere kralen. CST heldere kralen zijn omheind in de FSC versus SSC plot. Histogramplots van 10 fluorescentiekanalen worden gepresenteerd voor de CST heldere kralen. Intervalpoorten worden gemaakt om de heldere kralenpopulatie van CST-kralen voor elke fluorescentiedetector op te nemen. Afkortingen: FSC-A = voorwaarts verstrooiingsgebied; SSC-A = zijverstrooiingsgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van dot plots van één steekproef tussen de twee instrumenten. (A) CD45/SSC-A dot plot wordt gebruikt om lymfocyten te gaten. (B) CD3/CD19 dot plot wordt gebruikt om CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te gaten. (C) CD4/CD8 dot plot wordt gebruikt om CD3+ CD8+ T en CD3+ CD4+ T cellen te identificeren. (D) CD25/CD127 dot plot wordt gebruikt om Treg-cellen (CD4+CD25++CD127laag) te gaten. (E) CD45RA/CD27 dot plot voor CD4+ T cellen wordt gebruikt om naïeve (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-), en TEMRA (CD27-CD45RA+) te gaten. (F) CD45RA/CD27 dot plot voor CD8+ T cellen wordt gebruikt om naïeve (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-), en TEMRA (CD27-CD45RA+) te gaten. (G) CD27/IgD dot plot wordt gebruikt om naïeve B-cellen (CD27- IgD+) en geheugen B-cellen (CD27+ IgD-) te gaten. De gating-strategie is van Zhang et al.7. Afkortingen: SSC-A = zijverstrooiingsgebied; TCM = T-cellen van het centrale geheugen; TEM = effector geheugen T-cellen; TEMRA = terminaal differentieel effector geheugen T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam doelwit | Fluorochroom | Kloon | Catalogusnummer | Volume per test (μL) |
| CD4 | Fitc | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | Bv421 | Hil-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | Bv605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabel 1: Antilichaamvolumes en geconjugeerde fluorofoorinformatie voor flowcytometrische analyses. Afkortingen: BV = briljant violet; BB = briljant blauw; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrin; APC = allophycocyanine.
| MFI van heldere kralen | |||
| Kanaal | Cytometer A | Cytometer B | %Diff in MFI |
| Fsc | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| Fitc | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| Bv421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| Bv605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabel 2: MFI van heldere kralen voor en na overdracht. Afkortingen: MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; BV = briljant violet; BB = briljant blauw; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrin; APC = allophycocyanine.
| Gemiddelde van percentages | Gemiddelde van percentages | ||
| Cytometer A (n=6) | Cytometer B (n=6) | P-waarde | |
| T-cellen | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T cellen | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naïef | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T-cellen | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naïef | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B-cellen | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naïef B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Geheugen B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabel 3: Beoordeling van verschillen in lymfocytensubsets tussen instrumenten. p > 0,05 geeft geen significant verschil aan. Afkortingen: TCM = centraal geheugen T-cellen; TEM = effector geheugen T-cellen; TEMRA = terminaal gedifferentieerde effector geheugen T-cellen.
Aanvullende tabel S1: Percentages vanlymfocytensubsets in zes monsters van verschillende instrumenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: De screenshots van sjablonen en parameterinstellingen in de software van cytometer A en cytometer B. (A) Het XML-bestand met sjablonen. (B) De screenshots van sjablonen. (C) De parameterinstellingen in cytometer A. (D) De parameterinstellingen in cytometer B. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofenotypering van perifere bloedlymfocytensubgroepen kan helpen de veranderingen in celgemedieerde adaptieve immuniteit na vaccinatie bij kinderen te begrijpen. In klinische toepassingen doen zich onverwachte situaties voor, zoals het niet tijdig detecteren van monsters of het vervangen van een flowcytometer; Daarom zijn snelle gestandaardiseerde methoden nodig die overdrachten tussen flowcytometers in verschillende laboratoria vergemakkelijken 9,10,11. Hier beschrijven we een snelle gestandaardiseerde methode om consistente resultaten tussen verschillende instrumenten te garanderen. De gestandaardiseerde methode werd gebruikt om immuuncellen in het perifere bloed van kinderen na vaccinatie te controleren en consistente resultaten werden verkregen in twee laboratoria. De gestandaardiseerde methode is vastgesteld tussen BD Canto en LSRFortessa. Het protocol is ook geschikt voor FACSCelesta, FACSymphony A5 en FACSAria II. In vergelijking met andere standaardisatiemethoden 2,3 vereist deze standaardmethode geen software van derden om de consistentie van gegevens te verkrijgen. Het gebruikt alleen de kenmerken van Diva-software om een sjabloonmodule te maken met doelwaardepositie en automatische analyse om de overdrachtsmethode tussen verschillende instrumenten te realiseren en vermindert de vereiste van gegevensanalyse. De methode bespaart tijd, is eenvoudig te bedienen en vereist geen ontwikkeling van een geautomatiseerde gating-tool.
Standaardisatie van een flowcytometrieprotocol in deze studie wordt bereikt door een experimentele sjabloon op één instrument te maken met cytometrie-instellingen, automatische gegevensanalyse en een werkblad voor de doelpositie. Vervolgens gebruiken de andere instrumenten CST-kralen om de parameterspanningen aan te passen om de doelwaarde te bereiken. Verschillende belangrijke kenmerken moeten worden overwogen om een succesvolle standaardisatie over verschillende flowcytometerinstrumenten te voltooien. Ten eerste vereist de gestandaardiseerde methode dat de instrumenten hetzelfde softwaresysteem gebruiken, zodat het XML-bestand van de experimentsjabloon kan worden gedeeld tussen de software van de instrumenten. Ten tweede moeten de twee instrumenten dezelfde naam hebben voor de configuratie en moeten de parameters ook identiek worden genoemd. Ten derde moeten de CST-kralen worden verzameld onder de gespecificeerde spanningsomstandigheden zonder compensatie als streefwaarden. Gezien de verschillende laservermogens en PMT-gevoeligheden van verschillende instrumenten, is het noodzakelijk om CST-kralen van hetzelfde partijnummer te gebruiken om de spanningsparameters aan te passen aan de doelwaarden op andere instrumenten en ervoor te zorgen dat de MFI-waarde binnen ±5% ligt. Ten vierde zijn dagelijkse kwaliteitsbeoordelingen van instrumenten ook erg belangrijk. Als één instrument de beoordeling niet doorstaat, moet de stroomcel worden gereinigd voor bellen of worden onderworpen aan laserkalibratie. Ten slotte, om verschillen veroorzaakt door voorbereidingsprocedures te verminderen, moeten de monsters op dezelfde manier worden voorbereid wanneer dergelijke grote multicenterstudies worden uitgevoerd, naast het overbrengen van instellingen om de monsters in verschillende laboratoria te kunnen analyseren. Er is echter nog steeds ruimte voor paneeloptimalisatie voor een betere identificatie van geheugen B-cellen in dit protocol. De frequentie van geheugen B-cellen is relatief laag bij 2-jarige kinderen en CD27-expressie op het oppervlak van deze cellen is diffuus. Dit kan geheugen B-cellen beter identificeren als de marker wordt vervangen door een helderder fluoresceïne dan BV605.
Er moeten echter enkele beperkingen worden opgemerkt. Eerst werden twee flowcytometers gebruikt voor standaardisatie in dit experiment; Aanvullende instrumentmodellen moeten worden opgenomen in volgende experimenten. Ten tweede werd de celoppervlakkleuringsmethode gebruikt om lymfocytensubsets te onderscheiden en te bepalen en omvatte niet de detectie van meer intracellulaire cytokines. Ten derde hebben we de experimentele resultaten niet vergeleken met en zonder het standaardisatieproces van twee flowcytometers.
Het voordeel van deze gestandaardiseerde methode is dat verschillende instrumenten het XML-bestand van de experimentsjabloon kunnen delen als de software hetzelfde is. De experimentele sjabloon bevat de sjabloon voor vaste doelwaarden en gegevens kunnen alleen worden verkregen na aanpassing van PMT-spanningen aan de doelwaarden tussen instrumenten. Daarnaast bevat de experimentele template ook automatische gate strategie analyse. Zodra de gegevens zijn verkregen, wordt het automatische analyserapport gegenereerd. Deze procedure is eenvoudig te bedienen en vermindert de verschillen in resultaten veroorzaakt door handmatige analyse. Deze gestandaardiseerde methode kan worden gebruikt om veranderingen in lymfocytensubsets in het volbloed van JE-gevaccineerde kinderen te beoordelen met behulp van verschillende instrumenten in laboratoria, waardoor het doel wordt bereikt om ervoor te zorgen dat het onderzoeksproject consistent wordt uitgevoerd in meerdere centra. In deze studie willen we de convertibiliteit van de gestandaardiseerde methode testen door oppervlaktekleuring, en het succes ervan zal een basis leggen voor de praktijk van latere intracellulaire kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
RW werd ondersteund door Beijing Natural Science Foundation, China (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ werd ondersteund door het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
